分子生物學(xué)技術(shù)

分子生物學(xué)技術(shù)一、分子生物學(xué)概念二、核酸探針技術(shù)三、PCR四、

一、分子生物學(xué)概念

（一）基本概念

（二）基因的堿基順序與蛋白質(zhì)的氨基酸順序

（三）基因的結(jié)構(gòu)

（四）基因的表達(dá)與調(diào)控

（一）基本概念

基因：是編碼蛋白質(zhì)或RNA分子遺傳信息的基本遺傳單位。從化學(xué)角度觀察，基因則是一段具有特定功能和結(jié)構(gòu)的連續(xù)的脫氧核糖核酸序列，是構(gòu)成巨大遺傳單位染色體的重要組成部分。

順?lè)醋樱喉樂(lè)醋雍突蜻@兩個(gè)術(shù)語(yǔ)是互相通用的。一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)順?lè)醋蛹仁且粋€(gè)基因，大約含有1500個(gè)核苷酸對(duì)，是由一群突變單位和重組單位組成的線性結(jié)構(gòu)。因此，順?lè)醋痈拍畋砻鳎夯虿皇亲钚挝?，它仍然是可分的；并非所有的DNA序列都是基因，而只有其中某一特定的多核苷酸區(qū)段才是基因的編碼區(qū)。

每一個(gè)順?lè)醋泳褪且欢魏塑账嵝蛄?，或者是一個(gè)基因的DNA或RNA單元，它編碼一種完整的多肽鏈。順?lè)醋邮枪δ軉挝唬怯稍S多可以突變的位點(diǎn)組成的，而這些位點(diǎn)之間又可以發(fā)生交換。

多體蛋白質(zhì)（multimericproteins）：由數(shù)個(gè)亞基組成的蛋白質(zhì)。同型多體蛋白質(zhì)：在多體蛋白質(zhì)中，如果所有的亞基都是同樣的，這種蛋白質(zhì)就屬于同型多體（homomultimer）蛋白質(zhì)，由一種基因編碼。

異型多體（heteromultimer）蛋白質(zhì)：亞基各不相同的蛋白質(zhì)，由多種基因編碼。如血紅蛋白。

（二）基因的堿基順序與蛋白質(zhì)的氨基酸順序

1.

中心法則（centraldogma）：既遺傳信息是從DNA流向RNA，再由RNA流向蛋白質(zhì)

而遺傳信息從DNA直接到蛋白質(zhì)的傳遞，只是一種理論上的可能性，迄今尚未得到證實(shí)。

2.密碼子：每3個(gè)堿基編碼一種氨基酸，就會(huì)編碼出64種（43=64）不同的氨基酸。蛋白質(zhì)分子是由20種不同的氨基酸構(gòu)成的，因此，1種氨基酸可有幾個(gè)不同的密碼子，既3個(gè)堿基甚至更多的堿基編碼一種氨基酸是必要的。

遺傳密碼是否重疊？研究證實(shí)：遺傳密碼是不重疊的。

三聯(lián)體之間是否存在著“逗號(hào)”？研究證實(shí)：堿基的閱讀是從一個(gè)固定的起點(diǎn)按序進(jìn)行的，不存在有什么“逗號(hào)”的問(wèn)題。

…QABCQDEFQGHIQJKLQ…（三）基因的結(jié)構(gòu)

基因的編碼區(qū)（即轉(zhuǎn)錄區(qū)）是連續(xù)不斷的序列，包括一個(gè)起始密碼子ATG和一個(gè)終止密碼子TAA。編碼區(qū)的兩側(cè)是轉(zhuǎn)錄而不轉(zhuǎn)譯的側(cè)翼序列區(qū)，其中5`非轉(zhuǎn)譯區(qū)簡(jiǎn)稱5`UTR，含有一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)及一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)；3`非轉(zhuǎn)譯區(qū)簡(jiǎn)稱3`UTR含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。

無(wú)論是真核的基因還是原核的基因，都可劃分成編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩個(gè)基本組成部分。

編碼區(qū)含有大量的可以被細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)譯機(jī)器閱讀的遺傳密碼，包括起始密碼子（通常是AUG）和終止密碼子（UAA，UAG或UGA）。非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)中的5`末端非轉(zhuǎn)譯區(qū)（5`UTR）和3`末端非轉(zhuǎn)譯區(qū)（3`UTR），對(duì)于基因遺傳信息的表述是必要的，但它們都不會(huì)被轉(zhuǎn)譯成多肽序列。

真核基因與原核基因的區(qū)別：

事實(shí)上，真核生物的基因都是以單順?lè)醋拥男问酱嬖冢虼怂鼈兙幋a的也都是單基因產(chǎn)物。而大腸桿菌類原核生物往往是多順?lè)醋?，它轉(zhuǎn)錄的是一種大分子量的mRNA，可同時(shí)編碼兩種甚至數(shù)種的基因產(chǎn)物。（四）基因的表達(dá)與調(diào)控

結(jié)構(gòu)基因(structuralgene)：編碼細(xì)胞成份，如代謝酶類、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)和細(xì)胞骨架成份等的基因。

調(diào)節(jié)基因（regulatorygene)：編碼控制其他基因表達(dá)的RNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因。

操縱基因（operator):指接受來(lái)自調(diào)節(jié)基因合成的調(diào)節(jié)蛋白的作用，使結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄活性得以抑制的特定的DNA區(qū)段，也稱為控制單元。儲(chǔ)藏在在基因因中的的遺傳傳信息息分轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄和和轉(zhuǎn)譯譯兩步步進(jìn)行行表達(dá)達(dá)，這這種遺遺傳信信息從從DNA到RNA再到蛋蛋白質(zhì)質(zhì)的流流向，，在所所有的的細(xì)胞胞類型型中都都是受受到高高度調(diào)調(diào)節(jié)的的，同同時(shí)在在有些些情況況下也也是嚴(yán)嚴(yán)格協(xié)協(xié)同的的?；虮肀磉_(dá)的的此種種嚴(yán)格格調(diào)控控機(jī)理理，保保證細(xì)細(xì)胞不不會(huì)浪浪費(fèi)能能量用用于合合成它它所不不需要要的基基因產(chǎn)產(chǎn)物。。從從基因因研究究上，，操縱縱子概概念比比順?lè)捶醋佑钟诌M(jìn)了了一步步。即即基因因不但但在結(jié)結(jié)構(gòu)上上是可可分的的，而而且在在功能能上也也是有有分工工的。。同時(shí)時(shí)，有有的基基因控控制蛋蛋白質(zhì)質(zhì)產(chǎn)物物的合合成，，而有有的基基因并并沒(méi)有有直接接的產(chǎn)產(chǎn)物。。操縱子子模型型二、核核酸探探測(cè)技技術(shù)（一））指紋紋圖譜譜（（二））核酸酸分子子雜交交（一））、指指紋圖圖譜指紋圖圖譜：：即核酸酸酶切切圖譜譜，對(duì)對(duì)生物物的蛋蛋白質(zhì)質(zhì)、DNA和RNA進(jìn)行分分析的的電泳泳圖、、雜交交放射射性自自顯影影圖等等。在在微生生物研研究上上，主主要是是用限限制性性內(nèi)切切酶（（ERA）對(duì)病毒、細(xì)細(xì)菌DNA進(jìn)行酶切分分析的圖譜譜。原理：在微生物（（細(xì)菌）細(xì)細(xì)胞中有1種限制性性內(nèi)切酶類類（II，稱為RE），能特異性的的識(shí)別和切切割DNA鏈上特定的的一段DNA片段，這類類酶廣泛應(yīng)應(yīng)用于基因因工程的各各個(gè)方面。。ERA就是用RE消化病毒或或細(xì)菌的DNA或質(zhì)粒，將將消化物于于瓊脂凝膠膠中電泳分分離，經(jīng)溴化乙錠（（EB）染色，然后后分析DNA酶切片段的的數(shù)目、遷遷移率等分分析微生物物的變異現(xiàn)現(xiàn)象、鑒定定毒株、分分型及了解解基因結(jié)構(gòu)構(gòu)和進(jìn)行流流行病學(xué)研研究等等。。

方法：：

1.DNA抽提

2.DNA酶切

3.電泳4.染色5.觀察察、照相6.分析析

7.酶切圖譜核酸探針技技術(shù)前言(一)核酸酸探針的種種類

(二)核酸探針的的制備(三)核核酸雜交(四)核核酸探針針技術(shù)在動(dòng)動(dòng)物檢疫中中的應(yīng)用前言化學(xué)及生物物學(xué)意義上上的探針(probe)，是指與特定定的靶分子子發(fā)生特異異性相互作作用，并可可被特殊的的方法探知知的分子。?？贵w-抗抗原、生物物素-抗生生物素蛋白白、生長(zhǎng)因因子-受體體的相互作作用都可以以看作是探探針與靶分分子的相互互作用。核核酸探針針技術(shù)原理理是堿基配配對(duì)?；パa(bǔ)補(bǔ)的兩條核核酸單鏈通通過(guò)退火形形成雙鏈，，這一過(guò)程程稱為核酸酸雜交。（（基本過(guò)程程是：加熱熱變性降溫復(fù)性。。）核酸探探針是指帶帶有標(biāo)記物物的已知序序列的核酸酸片段，它它能和與其其互補(bǔ)的核核酸序列雜雜交，形成成雙鏈，所所以可用于于待測(cè)核酸酸樣品中特特定基因序序列的檢測(cè)測(cè)。每一種種病原體都都具有獨(dú)特特的核酸片片段，通過(guò)過(guò)分離和標(biāo)標(biāo)記這些片片段就可制制備出探針針，用于疾疾病的診斷斷等研究。。(一)核核酸探針的的種類1.按來(lái)源源及性質(zhì)劃劃分可將將核酸探針針?lè)譃榛蛞蚪MDNA探針、cDNA探針、RNA探針和人工工合成的寡寡核苷酸探探針等幾類類。

作為為診斷試劑劑，較常使使用的是基基因組DNA探針和cDNA探針。其中中，前者應(yīng)應(yīng)用最為廣廣泛，它的的制備可通通過(guò)酶切或或聚合酶鏈鏈反應(yīng)(PCR)從基因組中中獲得特異異的DNA后將其克隆隆到質(zhì)粒或或噬菌體載載體中，隨隨著質(zhì)粒的的復(fù)制或噬噬菌體的增增殖而獲得得大量高純純度的DNA探針。將RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄錄，所獲得得的產(chǎn)物即即為cDNA。。cDNA探針適用于于RNA病毒的檢測(cè)測(cè)。cDNA探針序列也也可克隆到到質(zhì)?；蚴墒删w中，，以便大量量制備。將將信息RNA(mRNA)標(biāo)記也可作作為核酸分分子雜交的的探針。但但由于來(lái)源源極不方便便，且RNA極易被環(huán)境境中大量存存在的核酸酸酶所降解解，操作不不便，因此此應(yīng)用較少少。用人工工合成的寡寡聚核苷酸酸片段做為為核酸雜交交探針應(yīng)用用十分廣泛泛，可根據(jù)據(jù)需要隨心心所欲合成成相應(yīng)的序序列，可合合成僅有幾幾十個(gè)bp的探探針針序序列列，，對(duì)對(duì)于于檢檢測(cè)測(cè)點(diǎn)點(diǎn)突突變變和和小小段段堿基基的的缺缺失失或或插插入入尤尤為為適適用用2.按按標(biāo)標(biāo)記記物物劃劃分分有有放放射射性性標(biāo)標(biāo)記記探探針針和和非非放放射射性性標(biāo)標(biāo)記記探探針針兩兩大大類類。。放放射射性性標(biāo)標(biāo)記記探探針針用用放放射射性性同同位位素素做做為為標(biāo)標(biāo)記記物物。。放放射射性性同同位位素素是是最最早早使使用用，，也也是是目目前前應(yīng)應(yīng)用用最最廣廣泛泛的的探探針針標(biāo)標(biāo)記記物物。。常常用用的的同同位位素素有有32P、、3H、、35S。。其中中，，以以32P應(yīng)用用最最普普遍遍。。放放射射性性標(biāo)標(biāo)記記的的優(yōu)優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)是是靈靈敏敏度度高高，，可可以以檢檢測(cè)測(cè)到到Pg級(jí)；；缺缺點(diǎn)點(diǎn)是是易易造造成成放放射射性性污污染染，，同同位位素素半半衰衰期期短短、、不不穩(wěn)穩(wěn)定定、、成成本本高高等等。。因因此此，，放放射射性性標(biāo)標(biāo)記記的的探探針針不不能能實(shí)實(shí)現(xiàn)現(xiàn)商商品品化化。。目目前前，，許許多多實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室室都都致致力力于于發(fā)發(fā)展展非非放放射射性性標(biāo)標(biāo)記記的的探探針針。。目前前應(yīng)應(yīng)用用較較多多的的非非放放射射性性標(biāo)標(biāo)記記物物是是生生物物素素(Biotin)和地地高高辛辛(digoxigenin)。。二者者都都是是半半抗抗原原。。生生物物素素是是一一種種小小分分子子水水溶溶性性維維生生素素，，對(duì)對(duì)親親和和素素有有獨(dú)獨(dú)特特的的親親和和力力，，兩兩者者能能形形成成穩(wěn)穩(wěn)定定的的復(fù)復(fù)合合物物，，通通過(guò)過(guò)連連接接在在親親和和素素或或抗抗生生物物素素蛋蛋白白上上的的顯顯色色物物質(zhì)質(zhì)(如如酶酶、、熒熒光光素素等等)進(jìn)進(jìn)行行檢檢測(cè)測(cè)。。地地高高辛辛是是一一種種類類固固醇醇半半抗抗原原分分子子，，可可利利用用其其抗抗體體進(jìn)進(jìn)行行免免疫疫檢檢測(cè)測(cè)，，原原理理類類似似于于生生物物素素的的檢檢測(cè)測(cè)。。地地高高辛辛標(biāo)標(biāo)記記核核酸酸探探針針的的檢檢測(cè)測(cè)靈靈敏敏度度可可與與放放射射性性同同位位素素標(biāo)標(biāo)記記的的相相當(dāng)當(dāng)，，而而特特異異性性優(yōu)優(yōu)于于生生物物素素標(biāo)標(biāo)記記，，其其應(yīng)應(yīng)用用日日趨趨廣廣泛泛。。（二二））核核酸酸探探針針的的制制備備1.DNA探針針制制備備（（1））以以病病原原細(xì)細(xì)胞胞核核或或病病毒毒中中提提取取的的特特異異性性DNA，，用理理化化學(xué)學(xué)方方法法將將其其純純化化，，然然后后再再用用限限制制性性核核酸酸酶酶將將DNA切割割成成若若干干片片段段，，電電泳泳回回收收目目的的DNA；；（（2））酶促促反反應(yīng)應(yīng)合合成成法法，，即即從從病病原原中中提提取取mRNA，，在反反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶作作用用下下合合成成互互補(bǔ)補(bǔ)結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)的的DNA（（cDNA））；；（（3））化學(xué)學(xué)合合成成法法，，以以單單核核苷苷酸酸為為原原料料，，人人工工合合成成DNA的某某一一片片段段。。2.RNA探針針全全基基因因RNA探針針可可用用RNA病毒毒的的基基因因標(biāo)標(biāo)記記即即可可；；由由DNA轉(zhuǎn)錄錄出出探探針針RNA，，可由由RNA聚合合酶酶獲獲得得大大量量高高純純度度的的RNA，，其靈靈敏敏度度比比DNA探針針高高出出10多多倍倍。。(三三)核酸酸雜雜交交雜交交技技術(shù)術(shù)有有固固相相雜雜交交和和液液相相雜雜交交之之分分。。固固相相雜雜交交技技術(shù)術(shù)目目前前較較為為常常用用，，先先將將待待測(cè)測(cè)核核酸酸結(jié)結(jié)合合到到一一定定的的固固相相支支持持物物上上，，再再與與液液相相中中的的標(biāo)標(biāo)記記探探針針進(jìn)進(jìn)行行雜雜交交。。固固相相支支持持物物常常用用硝硝酸酸纖纖維維素素膜膜(nitrocellulosefiltermembrane，，簡(jiǎn)稱稱NC膜)或或尼尼龍龍膜膜(nylonmembrane)。。固相相雜雜交交包包括括膜膜上上印印跡跡雜雜交交和和原原位位雜雜交交。。前前者者包包括括三三個(gè)個(gè)基基本本過(guò)過(guò)程程：：第第一一，，通通過(guò)過(guò)印印跡跡技技術(shù)術(shù)將將核核酸酸片片段段轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移到到固固相相支支持持物物上上；；第第二二，，用用標(biāo)標(biāo)記記探探針針與與支支持持物物上上的的核核酸酸片片段段進(jìn)進(jìn)行行雜雜交交；；第第三三，，雜雜交交信信號(hào)號(hào)的的檢檢測(cè)測(cè)。。用探探針針對(duì)對(duì)細(xì)細(xì)胞胞或或組組織織切切片片中中的的核核酸酸雜雜交交并并進(jìn)進(jìn)行行檢檢測(cè)測(cè)的的方方法法稱稱之之為為核核酸酸原原位位雜雜交交。。某某特特點(diǎn)點(diǎn)是是靶靶分分子子固固定定在在細(xì)細(xì)胞胞中中，，細(xì)細(xì)胞胞固固定定在在載載玻玻片片上上，，以以固固定定的的細(xì)細(xì)胞胞代代替替純純化化的的核核酸酸，，然然后后將將載載玻玻片片浸浸入入溶溶有有探探針針的的溶溶液液里里，，探探針針進(jìn)進(jìn)入入組組織織細(xì)細(xì)胞胞與與靶靶分分子子雜雜交交，，而而靶靶分分子子仍仍固固定定在在細(xì)細(xì)胞胞內(nèi)內(nèi)。。例例如如。?？煽捎糜锰靥禺惍愋孕缘牡募?xì)細(xì)菌菌、、病病毒毒的的核核酸酸做做為為探探針針對(duì)對(duì)組組織織、、細(xì)細(xì)胞胞進(jìn)進(jìn)行行原原位位雜雜交交，，以以確確定定有有無(wú)無(wú)該該病病原原體體的的感感染染等等。。原原位位雜雜交交不不需需從從組組織織中中提提取取核核酸酸，，對(duì)對(duì)于于組組織織中中含含量量極極低低的的靶靶序序列列有有極極高高的的敏敏感感性性，，在在臨臨床床應(yīng)應(yīng)用用上上有有獨(dú)獨(dú)特特的的意意義義。。近年年來(lái)來(lái)液液相相雜雜交交技技術(shù)術(shù)有有所所發(fā)發(fā)展展。。液液相相雜雜交交與與固固相相雜雜交交的的主主要要區(qū)區(qū)別別是是不不用用純純化化或或固固定定的的靶靶分分子子，，探探針針與與靶靶序序列列直直接接在在溶溶液液里里作作用用。。液液相相雜雜交交步步驟驟有有所所簡(jiǎn)簡(jiǎn)化化，，雜雜交交速速度度有有所所提提高高，，增增加加了了特特異異性性和和敏敏感感性性，，但但與與臨臨床床診診斷斷所所要要求求的的特特異異性性和和敏敏感感性性還還有有一一定定的的距距離離。。各各種種雜雜交交技技術(shù)術(shù)中中，，膜膜上上印印跡跡雜雜交交技技術(shù)術(shù)應(yīng)應(yīng)用用最最為為廣廣泛泛，，它它由由以以下下三三個(gè)個(gè)基基本本過(guò)過(guò)程程組組成成。。1.核核酸酸印印跡跡技技術(shù)術(shù)(1)斑斑點(diǎn)點(diǎn)印印跡跡(Dot-blot)將待測(cè)核酸樣樣品變性后直直接點(diǎn)樣在膜膜上，稱之為為斑點(diǎn)印跡。。為使核酸牢固固結(jié)合在膜上上，通常還將將點(diǎn)樣后的膜膜進(jìn)行80℃℃真空烘烤2h。應(yīng)用斑點(diǎn)印跡跡技術(shù)，可在在一張膜上同同時(shí)進(jìn)行多個(gè)個(gè)樣品的檢測(cè)測(cè)，操作簡(jiǎn)便便、快速，在在臨床診斷中中應(yīng)用較廣。。適合進(jìn)行特特定基因的定定性及定量研研究，但不能能鑒定所測(cè)基基因的分子量量。(2)Southern印跡(Southernblot)這是指將DNA片段經(jīng)瓊脂糖糖凝膠電泳分分離后轉(zhuǎn)移到到固相支持物物上的過(guò)程。。常規(guī)處理如如下，先用限限制性內(nèi)切酶酶對(duì)DNA樣品進(jìn)行酶切切處理，經(jīng)瓊瓊脂糖凝膠電電泳將得DNA片段按分子量量大小分離，，接著對(duì)凝膠膠進(jìn)行變性處處理，使雙鏈鏈DNA解離成單鏈，，并將其轉(zhuǎn)移移到NC膜或其它固相相支持物上，，轉(zhuǎn)移后各DNA片段的相對(duì)位位置保持不變變。用探針與與經(jīng)Southern印跡處理的DNA樣品雜交，可可鑒定待測(cè)DNA的大小、進(jìn)行行克隆基因的的酶切圖譜分分析、基因組組基因的定性性及定量分析析、基因突變變分析及限制制性片段長(zhǎng)度度多態(tài)性分析析(RFLP)等。

(3)Northern印跡(Northernblot)Northern印跡是指將RNA片段變性及電電泳分離后，，轉(zhuǎn)移到固相相支持物上的的過(guò)程。RNA樣品經(jīng)Northern印跡后進(jìn)行雜雜交反應(yīng)可鑒鑒定其中特異異mRNA分子的量與大大小。Northern印跡的方法與與Southern印跡基本相同同，可參照進(jìn)進(jìn)行。但RNA的變性方法與與DNA不同。DNA樣品可先通過(guò)過(guò)凝膠電泳進(jìn)進(jìn)行分離，再再用堿處理凝凝膠使DNA變性。而RNA不能用堿變性性,因?yàn)閴A會(huì)會(huì)導(dǎo)致RNA水解。因此，，在Northern印跡前，須進(jìn)進(jìn)行RNA變性電泳，在在電泳過(guò)程中中使RNA解離形成單鏈鏈分布在凝膠膠上，再進(jìn)行行印跡轉(zhuǎn)移。。RNA變性電泳的原原理，是用一一定劑量的乙乙二醛-二甲甲基亞礬，或或甲醛和甲基基氫氧化汞等等處理RNA樣品和凝膠，，使雙鏈RNA在電泳過(guò)程中中變性而完全全解離形成單單鏈。2.雜交反應(yīng)的的基本過(guò)程雜雜交反應(yīng)包包括預(yù)雜交、、雜交和漂洗洗幾步操作。。

預(yù)雜交的的目的是用非非特異性DNA分子(鮭精DNA或小牛胸腺DNA)及其它高分子子化合物(Denhart’s溶液)將待測(cè)測(cè)核酸分子中中的非特異性性位點(diǎn)封閉，，以避免這些些位點(diǎn)與探針針的非特異性性結(jié)合。雜交交反應(yīng)是使單單鏈核酸探針針與固定在膜膜上的待測(cè)核核酸單鏈在一一定溫度和條件下進(jìn)進(jìn)行復(fù)性反應(yīng)應(yīng)的過(guò)程。雜雜交反應(yīng)結(jié)束束后，應(yīng)進(jìn)行行洗膜處理以以洗去非特異異性雜交以及及未雜交的標(biāo)標(biāo)記探針，以以避免干擾特特異性雜交信信號(hào)的檢測(cè)。。膜洗凈后,將繼續(xù)進(jìn)行行雜交信號(hào)的的檢測(cè)。(四)核酸酸探針技術(shù)在在動(dòng)物檢疫中中的應(yīng)用核酸探針技術(shù)術(shù)是目前分子子生物學(xué)中應(yīng)應(yīng)用最廣泛的的技術(shù)之一，，是定性或定定量檢測(cè)特異異RNA或DNA序列的有力工工具。核酸探探針可用以檢檢測(cè)任何特定定病原微生物物，并能鑒別別密切相關(guān)的的毒(菌)株和寄生蟲(chóng)蟲(chóng)。目前，各各種常見(jiàn)病毒毒病的診斷和和研究都已應(yīng)應(yīng)用到核酸探探針技術(shù)，這這方面的研究究報(bào)道數(shù)以萬(wàn)萬(wàn)計(jì)且與日俱俱增。但該項(xiàng)項(xiàng)技術(shù)的操作作畢竟比常規(guī)規(guī)方法復(fù)雜，，費(fèi)用較高，，在動(dòng)物檢疫疫中尚未推廣廣。多在實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)病原原作深入研究究時(shí)使用。三、聚合酶酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)(PolymeraseChainReaction，，PCR)由美國(guó)Centus公司的KaryMullis發(fā)明，于1985年由Saiki等在Science雜志上首次報(bào)報(bào)道，是近年年來(lái)開(kāi)發(fā)的體體外快速擴(kuò)增增DNA的技術(shù)。通過(guò)過(guò)PCR可以簡(jiǎn)便、快快速地從微量量生物材料中中以體外擴(kuò)增增的方式獲得得大量特定的的核酸，并且且有很高的靈靈敏度和特異異性，可在動(dòng)動(dòng)物檢疫中用用于微量樣品品的檢測(cè)。1.PCR的基本原理和和過(guò)程PCR技術(shù)是在模板板DNA、引物和4種脫氧單單核苷酸存在在的條件下依賴于于耐高溫的DNA聚合酶的酶促促合成反應(yīng)。。PCR以欲擴(kuò)增的DNA做為模板，以以和模板正鏈鏈和負(fù)鏈末端端互補(bǔ)的兩種種寡聚核苷酸酸做為引物，，經(jīng)過(guò)模板DNA變性、模板引引物復(fù)性結(jié)合合、并在DNA聚合酶作用下下發(fā)生引物鏈鏈延伸反應(yīng)來(lái)來(lái)合成新的模模板DNA。模板DNA變性、引物結(jié)結(jié)合(退火)、引物延伸伸合成DNA這三步構(gòu)成一一個(gè)PCR循環(huán)。每一循循環(huán)的DNA產(chǎn)物經(jīng)變性又又成為下一個(gè)個(gè)循環(huán)的模板板DNA。這樣，目的的的DNA的數(shù)量將以2n-2n的形式累積，，在2小時(shí)內(nèi)內(nèi)可擴(kuò)增30(n)個(gè)循環(huán)，DNA量達(dá)原來(lái)的上上百萬(wàn)倍。PCR三步反應(yīng)中，，變性反應(yīng)在在高溫中進(jìn)行行，目的是通通過(guò)加熱使DNA雙鏈解離形成成單鏈；第二二步反應(yīng)又稱稱退火反應(yīng)，，在較低溫度度中進(jìn)行，它它使引物與模模板上互補(bǔ)的的序列形成雜雜交鏈而結(jié)合合上模板；第第三步為延伸伸反應(yīng)，是在在4種dNTP底物和Mg2+存在的條件下下，由DNA聚合酶催化以以引物為起始始點(diǎn)的DNA鏈的延伸反應(yīng)應(yīng)。通過(guò)高溫溫變性、低溫溫退火和中溫溫延伸3個(gè)溫溫度的循環(huán)，，模板上介于于兩個(gè)引物之之間的片段不不斷得到擴(kuò)增增。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)產(chǎn)物可通過(guò)凝凝膠電泳、Southern雜交或DNA序列分析進(jìn)行行檢測(cè)。PCR擴(kuò)增示意圖4.PCR衍生技術(shù)PCR可擴(kuò)增雙鏈DNA和單鏈DNA，并能以RNA為模板，進(jìn)行行反轉(zhuǎn)錄PCR以擴(kuò)增cDNA。經(jīng)不斷發(fā)展和和完善，已有有多種衍生PCR技術(shù)。除反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄PCR外，尚有不對(duì)對(duì)稱PCR、反向PCR、錨定PCR、多重PCR、著色互補(bǔ)PCR、免疫PCR和套式PCR等。

(1)反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT－PCR)RT－－PCR用于擴(kuò)增RNA樣品。在PCR體系中先引入入反轉(zhuǎn)錄酶，，將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以cDNA做為PCR的模板，加入入引物和TaqDNA聚合酶按正常常PCR方式擴(kuò)增cDNA。這一技術(shù)廣泛泛應(yīng)用于RNA和RNA病毒的檢測(cè)。。

(2)錨錨定PCR(AnchoredPCR)通常進(jìn)行的PCR試驗(yàn)必須知道道欲擴(kuò)增DNA或RNA片段兩側(cè)的序序列，并以此此為依據(jù)設(shè)計(jì)計(jì)引物進(jìn)行PCR。當(dāng)欲擴(kuò)增的片片段序列未知知時(shí)，可通過(guò)過(guò)錨定PCR進(jìn)行擴(kuò)增。其其基本方法是是分離細(xì)胞總總RNA或mRNA并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合合成cDNA，通過(guò)DNA末端轉(zhuǎn)移酶在在cDNA3’端加上同源多多聚物poly(dG)尾，通過(guò)與其其互補(bǔ)的錨定定引物poly(dC)來(lái)保證擴(kuò)增反反應(yīng)的特異性性。(3)反向向PCR(InversePCR)常規(guī)PCR是擴(kuò)增兩個(gè)已已知序列之間間的DNA片段，反向PCR則用于擴(kuò)增位位于已知序列列兩側(cè)的一段段未知序列。。方法是使含含已知序列和和未知序列的的DNA片段環(huán)化，再再用限制性內(nèi)內(nèi)切酶切開(kāi)已已知序列，這這樣線性化后后原位于已知知序列兩側(cè)的的未知序列變變?yōu)槲挥谝阎蛄兄g，，再經(jīng)常規(guī)PCR操作就可大量量擴(kuò)增未知序序列。(4)不對(duì)對(duì)稱PCR(AsymmetricPCR)不對(duì)稱PCR又稱單鏈擴(kuò)增增PCR。一般PCR反應(yīng)中兩種引引物的量是相相等的，不對(duì)對(duì)稱PCR中，兩種引物物的量相差懸懸殊，