大學生基本培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌課件

微生物基礎實驗項目

1、培養(yǎng)基制備與滅菌；2、微生物的分離培養(yǎng)與菌落觀察；3、水的細菌學檢驗；4、細菌的染色觀察：革蘭氏染色、芽孢與莢膜染色；5、放線菌、霉菌的形態(tài)觀察；7、微生物直接計數(shù)與大小測定；8、微生物生理生化反應

微生物基礎實驗注意事項1、提高安全意識，正確操作儀器；2、培養(yǎng)無菌操作的觀念；3、自覺清洗器皿；4、注重保持環(huán)境衛(wèi)生和實驗室秩序；

培養(yǎng)基的制備與滅菌

一、目的：

1、學習一般培養(yǎng)基的制備方法；

2、掌握高壓蒸汽滅菌技術，了解幾種常用的滅菌方法。

⑴天然培養(yǎng)基：主要成分是天然有機物質，如馬鈴薯、玉米粉、豆餅粉、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等，其成分未完全了解，且各批次不均一。適用于生產上大規(guī)模培養(yǎng)微生物。

⑵合成培養(yǎng)基：成分明確的化學藥品配制而成的培養(yǎng)基。如：高氏一號培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基等。一般適用于在實驗室范圍內研究微生物的形態(tài)、營養(yǎng)代謝、分類鑒定、生物測定、菌種選育和遺傳分析等工作。

⑶半合成培養(yǎng)基：在天然有機物的基礎上，適當補充一些成分已知的化學藥品所配制的培養(yǎng)基。具有廣泛的應用，如馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，適合很多霉菌的生長。

⑴液體培養(yǎng)基：配好后成為液體狀態(tài)的培養(yǎng)基。如糖發(fā)酵液體培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基等。廣泛用于理論研究和大規(guī)模的工業(yè)發(fā)酵。

⑵固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑形成的固態(tài)培養(yǎng)基。常用凝固劑有瓊脂、明膠、硅膠。硅膠用于配制自養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基；對于其他多數(shù)微生物來講，瓊脂最為合適，一般加入1.5-2.5%，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基等。此培養(yǎng)基可供微生物的分離、鑒定、菌種保藏等。⑶半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入少量凝固劑即配成為半固體培養(yǎng)基，如，加入0.2-0.7%瓊脂作為凝固劑。用來觀察細菌運動特征、鑒定菌種、菌種保藏和噬菌體的效價滴定等。

根據(jù)培養(yǎng)基的特殊用途分類：

⑴基礎培養(yǎng)基：含有一般細菌生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質，常用的基礎培養(yǎng)基是牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，也是作為某些特殊培養(yǎng)基的基礎成分。

⑵加富培養(yǎng)基：是在基礎培養(yǎng)基中加入血、血清、動物組織提取液或植物組織提取液，主要用于培養(yǎng)某些對營養(yǎng)要求較為苛刻的微生物。

⑶選擇培養(yǎng)基：根據(jù)某一種或某一類微生物的特殊營養(yǎng)要求或對一些物理、化學條件的抗性而設計的培養(yǎng)基。①根據(jù)某些微生物對碳、氮源的特殊要求來設計選擇性培養(yǎng)基，可以分離到能分解某些物質的微生物。②在培養(yǎng)基中加入某些化學物質，以抑制不需要的微生物的生長繁殖。如在分離放線菌時，在培養(yǎng)基中添加10%的酚數(shù)滴可抑制細菌和霉菌的生長。

⑷鑒別培養(yǎng)基：在基礎培養(yǎng)基中加入某種化合物或化學試劑，使培養(yǎng)的微生物產生某種代謝產物與該化合物或化學試劑發(fā)生明顯的特征性反應，根據(jù)這一特征性反應可以將此種微生物與其他種微生物區(qū)別開來，如伊紅美藍培養(yǎng)基。⑴干熱法滅菌：a)

火焰燒灼：適用于接種環(huán)、接種針、鑷子等金屬用具，無菌操作時的試管口和瓶口也在火焰上短暫燒灼滅菌。

b)熱空氣滅菌：使用電熱干燥箱，借助熱空氣在160-1700C下保溫2小時進行滅菌，此法適用于玻璃器皿（如吸管和培養(yǎng)皿）等的滅菌，對帶膠皮的器物或培養(yǎng)基不適用。

三、材料：

1、藥品：NaCl蛋白胨牛肉膏可溶性淀粉K2HPO4HClNaOH瓊脂葡萄糖蔗糖Na2SO4

黃豆芽馬鈴薯伊紅美藍等。

2、器材：臺秤三角瓶試管漏斗電爐搪瓷杯（鋁鍋）試管架玻棒滴管稱量紙pH試紙棉花紗布牛皮紙棉線滅菌鍋干燥箱等。

⑶矯正pH值：初配制好的培養(yǎng)基，往往不能符合所需求的pH值，故必須矯正，用精密pH試紙，以1NHCl或1NNaOH調節(jié)至所需要的pH值。

⑷過濾：用濾紙、棉花或雙層紗布過濾。

⑸分裝：將制成的培養(yǎng)基分裝于三角瓶或試管內。馬鈴薯糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)

成分：馬鈴薯200g

蔗糖20g

瓊脂25g

水補足1000ml

方法：將馬鈴薯洗凈去皮切塊，放入搪瓷杯中，摻適量水加熱煮沸30分鐘（注意不時用玻棒攪拌，避免糊底），用雙層紗布濾去薯塊，在薯汁中加入瓊脂，加熱熔化，再加入葡萄糖，完全溶化后，用水補足體積，趁熱分裝到三角瓶中，121℃滅菌20min。

注：無須調pH值，保持自然的酸性。伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基(EMB)

成分1：蛋白胨10gNaCl5g

乳糖4g

瓊脂25g蒸餾水1000mlpH7.6

成分2：2%伊紅水溶液2ml，0.5%美藍水溶液1ml

方法：先配成分1，調好pH值后才可加入成分2，混勻，趁熱分裝到三角瓶中，115℃滅菌20min。3倍濃縮乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基

成分1：蛋白胨30g

牛肉膏9g

乳糖15gNaCl

15g蒸餾水

補足1000mlpH7.2

成分2：1.6%溴鉀酚紫乙醇溶液3ml

方法：先配成分1，調好pH值后才可加入成分2，混勻，分裝到三角瓶及大試管中，并加入倒置的事先充滿該培養(yǎng)液的杜氏管（勿留氣泡），封口后115℃滅菌20min。

2、滅菌：⑴干熱滅菌步驟：

①將要滅菌的器皿（培養(yǎng)皿、吸管等）包扎好，放入恒溫干燥箱內。②接通電源，打開開關；旋動恒溫調節(jié)器至1400C，當達到此溫度時，借助恒溫調節(jié)器的自動控制，保持恒溫兩小時。③兩小時后，關掉電源，當溫度降至600C以下后，才可打開箱門，取出滅菌物品。手提式蒸汽滅菌鍋立式蒸汽滅菌鍋（電加熱、自動或半自動）臥式蒸汽滅菌鍋高壓蒸汽滅菌鍋的使用：

①鍋內加入適量的水，使水面與三腳擱架相平為宜。②把要滅菌的材料裝入鍋內，注意不要放得太擠，防礙蒸汽流通，影響滅菌效果。③蓋好滅菌鍋鍋蓋，按對角線形式均勻擰緊鍋蓋上的螺栓，螺栓松緊一致，以免漏氣。④打開電源，開啟排汽閥，以排除鍋內的冷空氣。⑤待冷空氣完全排盡后，關閉排汽開關。讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升，當鍋內壓力升到所需壓力時?？刂茻嵩?，維持壓力至所需時間。本實驗根據(jù)培養(yǎng)基不同，分別采用：1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持20分鐘；0.7kg/cm2（10磅/英寸2），115.60C保持20分鐘。五、培養(yǎng)基的配制及器材準備：

1：配牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基2000ml，分裝于16個250ml三角瓶；2：配牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基500ml，分裝于100支試管；3：高氏1號固體培養(yǎng)基1000ml，分裝于8個250ml三角瓶；4：淀粉固體培養(yǎng)基1000ml，分裝于8個250ml三角瓶；5：馬鈴薯固體培養(yǎng)基2000ml，分裝于16個250ml三角瓶；6：豆芽汁培養(yǎng)基1000ml,分裝于8個250ml三角瓶+20支試管；7：無氮培養(yǎng)基500ml,分裝于4個250ml三角瓶8：伊紅美藍固體培養(yǎng)基1000ml，分裝于8個250ml三角瓶；

五、培養(yǎng)基的配制及器材準備：

9：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基700ml,分裝于90支試管（7ml）；10：蛋白胨水培養(yǎng)基400ml，分裝于50支試管（7ml）；11：3倍乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基100ml，20只大試管（5ml），均加入倒置小管；12：乳糖發(fā)酵液體培養(yǎng)基700ml，分裝于90支試管（7ml），加倒置小管；13