臨床醫(yī)學(xué)哮喘研究從基礎(chǔ)到臨床課件

哮喘研究－從基礎(chǔ)到臨床Scientificresearchonasthma:frombenchtobedside浙江大學(xué)附屬二院呼吸科浙江大學(xué)呼吸疾病研究所沈華浩哮喘研究－從基礎(chǔ)到臨床浙江大學(xué)附屬二院呼吸科1哮喘最新定義：支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是一種以嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞參與的氣道慢性炎癥。這種炎癥使易感者產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作性的喘息、呼吸困難、胸悶或咳嗽等癥狀，常在夜間和（或）清晨發(fā)作、加劇，常伴有廣泛多變的可逆性氣流受限，多數(shù)患者可自行或經(jīng)治療后緩解。

哮喘最新定義：2哮喘研究的動(dòng)物模型Experimental

modelsforasthma

哮喘研究的動(dòng)物模型3應(yīng)用動(dòng)物模型的價(jià)值建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的目的是更好地解釋人類疾病發(fā)病過程。通過動(dòng)物模型，我們可以探討許多難以直接從臨床得到的疾病發(fā)病機(jī)理。盡管各種動(dòng)物模型在體現(xiàn)人類疾病上還存在一定的缺陷，但不可否認(rèn)的是通過動(dòng)物模型所得到的信息，使得我們對(duì)人類疾病過程有了更透徹清晰的認(rèn)識(shí)。應(yīng)用動(dòng)物模型的價(jià)值4人類哮喘的特征氣道慢性炎癥：大量炎性細(xì)胞–T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等，它們釋放出LTs、PGs、PAF等炎性介質(zhì)，引起微小血管滲漏、支氣管黏膜水腫、腺體分泌增加、粘液栓形成等病理改變，氣道高反應(yīng)性（AHR）：氣道對(duì)特異和非特異刺激的高反應(yīng)性，如組織胺，乙酰甲膽堿。氣道重建：上皮脫落、上皮下基底膜膠原沉積、平滑肌肥大增殖、粘膜水腫、杯狀細(xì)胞及粘液腺增生分泌亢進(jìn)，氣道周血管擴(kuò)張，新生血管形成。

人類哮喘的特征氣道慢性炎癥：大量炎性細(xì)胞–T淋巴細(xì)胞、5臨床研究哮喘受限制一、肺組織標(biāo)本獲取不易，具有一定危險(xiǎn)性。并且僅能反映疾病發(fā)展中的某一點(diǎn)，不能全程反映疾病過程。二、BALF的獲取更需疾病允許，尤其哮喘發(fā)作時(shí)難以獲取，不易將肺的結(jié)構(gòu)（病理）和功能（病理生理）結(jié)合起來。三、要明確參與LAR過程的抗體類型很不容易，因?yàn)槲覀儾豢赡軐⒛硞€(gè)特異抗原免疫病人而使其產(chǎn)生相應(yīng)抗體或?yàn)槠漭斪⒖乖禺愋钥贵w。四、不能冒著哮喘發(fā)作的危險(xiǎn)來探索引起哮喘發(fā)作的抗原。臨床研究哮喘受限制一、肺組織標(biāo)本獲取不易，具有一定危險(xiǎn)性。6研究哮喘的動(dòng)物1生來具有反復(fù)發(fā)作性喘息的動(dòng)物：貓、馬。2抗原激發(fā)前即具有AHR的動(dòng)物：狗、嚙齒類動(dòng)物。3僅在抗原激發(fā)后方具有可逆性氣流阻塞和/或AHR的動(dòng)物：兔、羊、豚鼠、大鼠、小鼠。

研究哮喘的動(dòng)物7生來具有反復(fù)發(fā)作性喘息的動(dòng)物馬亦存在自發(fā)性反復(fù)發(fā)作的氣流阻塞。這是因?yàn)橹旅魻顟B(tài)的馬經(jīng)常暴露于含有真菌孢子的干草的緣故。相同點(diǎn)：哮喘類型與人類哮喘相似的特征職業(yè)性哮喘暴露于抗原時(shí)癥狀明顯脫離抗原環(huán)境、癥狀緩解AHR可因脫離抗原而降低變應(yīng)性哮喘可逆性反復(fù)發(fā)作的氣流阻塞發(fā)作后可緩解具有明確的過敏原生來具有反復(fù)發(fā)作性喘息的動(dòng)物馬亦存在自發(fā)性反復(fù)發(fā)作的氣流阻8抗原激發(fā)誘導(dǎo)可逆性氣流阻塞和氣道高反應(yīng)性的動(dòng)物

兔

羊

豚鼠

大鼠

小鼠

抗原激發(fā)誘導(dǎo)可逆性氣流阻塞和兔9激發(fā)抗原的選擇

1.Proteinantigene.g.OVA,Derp,BetV2.Housedustmite(HDM)3.Fungie.g.Aspergillusfumigatus(extractorconnidia)4.Parasitese.g.Schistosomamansoni5.Worme.g.Nippostrongylusbrasiliensis6.Chemicalcompoundse.g.toluenediisocyanate激發(fā)抗原的選擇1.Proteinantigen10激發(fā)抗原的選擇

Theallergensourceshouldreflectthehumansituation:1.HDM,pollenandfungiarenaturalallergens2.inhalationisthenaturalexpositionroute3.extractsorpollenstarchgranulaarebetterthanpurifiedprotein,but,highdegreeofvariance激發(fā)抗原的選擇Theallergensourc11豚鼠曾經(jīng)廣泛應(yīng)用于哮喘研究，直到1985年才首次在豚鼠哮喘模型上描述LAR時(shí)相，之后許多學(xué)者應(yīng)用豚鼠研究了LAR。豚鼠曾經(jīng)廣泛應(yīng)用于哮喘研究，直到1985年才首次在豚鼠哮喘模12Brattard（1985）OVA+Al(OH)2致敏豚鼠(IP)，使動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生OVA特異性IgE和IgG.在麻醉狀態(tài)下，氣管內(nèi)滴注OVA微?？乖旅?6小時(shí)后可誘發(fā)出LAR，48小時(shí)后消失。該模型中，IAR時(shí)相產(chǎn)生的肺阻力大于24小時(shí)后的LAR。對(duì)未致敏豚鼠或產(chǎn)生IgG而非IgE的致敏豚鼠進(jìn)行攻擊均不能誘發(fā)出LARs，組織學(xué)表現(xiàn)：以嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的局限性細(xì)支氣管炎，平滑肌收縮、粘膜下水腫和氣道粘液形成在激發(fā)前/后應(yīng)用激素可抑制LAR時(shí)相反應(yīng)，但并不能阻斷炎癥細(xì)胞的募集。Brattard（1985）13建立豚鼠哮喘模型有多種不同的方法（抗原種類、致敏方式等）、不同的麻醉方法和肺功能測(cè)定方法；結(jié)果表示也有不同的方法（LAR出現(xiàn)的時(shí)間、LAR產(chǎn)生的次數(shù)、LAR強(qiáng)度）。這說明即使在同一品系動(dòng)物，應(yīng)用不同的方法可引起不同程度的氣流阻塞。重要的是在不同的背后存在相同之處。如在三組實(shí)驗(yàn)中有兩組證明了在引起LARs方面抗原特異性IgE比抗原特異性IgG更為重要。此外，所用實(shí)驗(yàn)均說明了Eos的肺內(nèi)募集與LAR存在相關(guān)性。建立豚鼠哮喘模型有多種不同的方法（抗原種類、致敏方式等）、不14應(yīng)用OVA主動(dòng)免疫致敏或應(yīng)用大鼠雜交瘤產(chǎn)生的抗二硝基酚IgE被動(dòng)免疫致敏。氣管內(nèi)給予特異性抗原。24hr后，OVA致敏組BAL中多形核細(xì)胞明顯高于對(duì)照組，被動(dòng)免疫致敏組（IgE致敏組）應(yīng)用抗原霧化攻擊1－2hr后BAL中的多形核細(xì)胞明顯上升，24hr恢復(fù)正常。對(duì)IgE致敏組進(jìn)行組織病理學(xué)檢查顯示，攻擊2h后可見肺泡和間質(zhì)水腫，伴有局限性細(xì)支氣管周圍多形核細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥在24hr后消失。另外可見間質(zhì)內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。無論是主動(dòng)免疫致敏還是被動(dòng)免疫致敏大鼠，均能建立起抗原特異性IgE依賴的氣道炎癥。應(yīng)用OVA主動(dòng)免疫致敏或應(yīng)用大鼠雜交瘤產(chǎn)生的抗二硝基酚I15小鼠小鼠模型已成為研究抗原誘導(dǎo)的氣道反應(yīng)性的一個(gè)重要的模型，因?yàn)閷?duì)小鼠免疫系統(tǒng)認(rèn)識(shí)廣泛全面，可以用來研究T細(xì)胞在AHR發(fā)生發(fā)展中的作用。小鼠不僅可用常規(guī)方法激發(fā)，也可采用其他更簡(jiǎn)易的方法。如觀察靜脈給予MCH致氣道收縮所需濃度。小鼠16小鼠3正常或抗原致敏的小鼠氣道可用來研究電刺激后神經(jīng)元介質(zhì)的釋放。如對(duì)某一品系的小鼠反復(fù)抗原暴露可使氣道對(duì)神經(jīng)刺激的反應(yīng)增強(qiáng)，表現(xiàn)為達(dá)到50％最大收縮（ES50）所需的電刺激頻率明顯降低，其原因是反復(fù)抗原刺激后神經(jīng)元釋放Ach能力增強(qiáng)。小鼠17小鼠最初的小動(dòng)物模型之一采用了BALB/c小鼠,動(dòng)物經(jīng)皮給予picrylchloride致敏，后滴鼻給予同一致敏原激發(fā)，于激發(fā)后24至48小時(shí)可見支氣管周圍及血管周圍巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞積聚，同時(shí)伴肺阻力增加，但無動(dòng)態(tài)順應(yīng)性改變。小鼠18小鼠A/J小鼠以綿羊血紅細(xì)胞致敏激發(fā)可致AHR及明顯的肺Eos炎癥，而使用抗CD4單克隆抗體阻斷CD4+T細(xì)胞后AHR及肺Eos炎癥均被抑制，可見該模型中氣道功能的改變依賴CD4＋T細(xì)胞，而Eos是該反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞。小鼠19有兩種方法證實(shí)此模型存在氣道功能的改變。1、采用整體體積描記法：經(jīng)靜脈給予濃度依次增高的MCH后發(fā)現(xiàn)氣流傳導(dǎo)（airwayconductance）改變，致敏組較非致敏組對(duì)MCH的反應(yīng)性明顯增高。2、采用體外測(cè)定法：離體氣道平滑肌給予一定量的電流刺激，隨著刺激頻率的增加氣道收縮增強(qiáng)，結(jié)果致敏組小鼠的ES50較非致敏小鼠明顯降低，其機(jī)理可能是電流刺激后致敏小鼠氣道副交感神經(jīng)末梢釋放ACH較非致敏小鼠多，同時(shí)伴M2毒蕈堿受體功能喪失。有兩種方法證實(shí)此模型存在氣道功能的改變。20

急性哮喘模型

ProtocolSensitization(i.p.OVA)Challenge(1%OVA)

1st2nd1st2nd3rd

Days01424252628Analysis

(AirwaysInflammation)

(Lunghistology)

(Th1/Th2responses)

急性哮喘模型21

Advantagesofanacuteallergicmousemodel

Similartohumans-Airwayhyperresponsivenss-Eosinophylia-IncreasedIgE-Gobletcellhyperplasia/metaplasia

-Mucushypersecretion-MucosalEdemaAdvantagesofanac22

Advantagesofanacuteallergicmousemodel

Usefulforbasicresearch:RoleofeosinophilsandCD4+T-lymphocytesAdhesionandchemotacticmoleculesandcellrecruitmentTestconventionalpharmacologicalagentsTransgenicandgene-targetedmouseAdvantagesofanac23BALB/c和C57BL/6J（B6）小鼠.近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通過轉(zhuǎn)基因或基因敲除技術(shù)，已培育出數(shù)十種新的小鼠品系:

IL-5轉(zhuǎn)基因:IL-5+/+，如NJ1638和NJ1720）.IL-5基因敲除（IL-5-/-）品系.IL-4-/-品系，IFN-a-/-品系，CD4-/-、CD8-/-、T細(xì)胞-/-，Eotaxin+/+、 Eotaxin-/-，IL-13-/-，等。BALB/c和C57BL/6J（B6）小鼠.24特殊類型細(xì)胞和細(xì)胞因子基因敲小鼠抗原致敏和激發(fā)后氣道炎癥反應(yīng)比較

細(xì)胞/細(xì)胞因子氣道上皮氣道粘液BALAHR缺陷病理分泌亢進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞（Mch）

Bcells+ +++Tcells(ab,gd)————alphabeta+Tcells————gammadelta+Tcells+++/-?CD4+cells————CD8+cells++++NK-TcellsNDND+NDEosinophils+/-+/-——野生小鼠 ++++

特殊類型細(xì)胞和細(xì)胞因子基因敲小鼠抗原致敏和激發(fā)后氣道炎癥反應(yīng)25特殊類型細(xì)胞和細(xì)胞因子基因敲小鼠抗原致敏和激發(fā)后氣道炎癥反應(yīng)比較

細(xì)胞/細(xì)胞因子氣道上皮氣道粘液BALAHR缺陷病理分泌亢進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞（Mch）

(IL-5[-/-])+/-+/-----IL-4[-/-]+/-—++IL-13[-/-]+/-—++/-IFN-r[-/-]++++野生小鼠 ++++

特殊類型細(xì)胞和細(xì)胞因子基因敲小鼠抗原致敏和激發(fā)后氣道炎癥反應(yīng)26

036122550MethacholineDose(μg/kg)EffectsofHuangqiandDXMonairwayresponsivenessinOVA-sensitizedmice.Airwayresponsivenesswasmeasuredat48hfollowinglastOVAchallenge.ATheMeandoseresponsecurvestonebulizedmethacholine(Mch).Airwayreactivity(Penh,y-axis)inresponsetoincreasingdosesofnebulizedMch(x-axis)wasassessedbywhole-bodyplethysmography.Dataareexpreddedasthemeans±SEM(n=8-10).*p<0.05comparedwithsaline/salinemice.?p<0.05comparedwithsaline-treatedOVAchallengedmice.

027

Disadvantagesofanacuteallergicmousemodel

-Noasthmaspontaneously-Nogeneticandenvironmentalfactors-Airwaysinsensitiveforhistamine-Hardlyairwayremodeling-Noeosinophilsinairwaysunderbasalconditions-HardlyairwayremodelingandnotachronicdiseaseDisadvantagesofanacu28

慢性哮喘模型/氣道重構(gòu)模型

ProtocolSensitization(i.p.OVA)Challenge(1%OVA)

Analysis

(AirwaysInflammation)

(Lunghistology)

(Th1/Th2responses)

慢性哮喘模型/氣道重構(gòu)模型29

Advantagesofachronicallergicmousemodel

-SustainedAHR-Sustainedinflammation-Smoothmuscle&gobletcellhyperplasia-AirwayremodelingAdvantagesofachronic30

Disadvantagesofachronicallergicmousemodel

-Timeconsuming-Expensive-Needmoretest-compound-AHRnotalwaysrelatedtoremodelingDisadvantagesofachro31

Conclusions

-Theallergicmodelsthatshouldbeusedindifferentexperimentsaredeterminedbythedistinctresearchaims.-Ingeneral,achronicmodelisinfavorofanacutemodelsinceitmimicsbetterthesituationinhumansConclusions-Theallerg32哮喘動(dòng)物模型的局限性任何疾病的動(dòng)物模型均有局限性。1、不同種系之間存在的差別限制了動(dòng)物模型結(jié)果在人身上的應(yīng)用。比如人與動(dòng)物的氣道神經(jīng)支配就存在顯著差別，氣道平滑肌中腎上腺素能神經(jīng)支配很少。2、所有品系均有其局限性。如，研究肺心病易在大動(dòng)物上進(jìn)行，另一方面，詳細(xì)描述氣道病理又宜在小動(dòng)物身上進(jìn)行，研究影響氣道反應(yīng)性的免疫因子采用小鼠較為合適?？傊?，沒有一種模型可解決碰到的所有問題。因此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)工作者在模擬人類疾病過程的時(shí)候應(yīng)考慮到他們實(shí)驗(yàn)的局限性。哮喘動(dòng)物模型的局限性33哮喘動(dòng)物模型的局限性3、雖然哮喘的病理過程大致可在動(dòng)物模型上得以體現(xiàn)，但沒有一個(gè)可完全體現(xiàn)它的特點(diǎn)。如家兔模型中描寫到速發(fā)和遲發(fā)反應(yīng)，但沒提到基底膜增厚和平滑肌增生。還有，沒有一個(gè)LARs模型能表現(xiàn)在未受激發(fā)底情況下出現(xiàn)自發(fā)性氣道阻塞和哮喘樣綜合癥。馬可以引起馬喘息病，在去除誘發(fā)的環(huán)境因素后可恢復(fù)到發(fā)作前水平。但人的哮喘氣道高反應(yīng)性的存在往往要更長(zhǎng)一些。4、在絕大多數(shù)的LARs模型中氣道高反應(yīng)性的存在往往時(shí)間較短，增高幅度也不大。犬模型有持續(xù)存在的AHR，但也沒提到自然發(fā)生的氣道阻塞。因此，沒有一個(gè)模型能完全模仿人的哮喘。哮喘動(dòng)物模型的局限性34小結(jié)--哮喘實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究的應(yīng)用一、動(dòng)物模型局限性的存在不表示它不應(yīng)被采用，只是提醒我們?cè)谶\(yùn)用動(dòng)物模型時(shí)要考慮到它的局限性。應(yīng)用動(dòng)物模型研究人類疾病有它不可否認(rèn)的作用。二、新的哮喘模型有使用基因突變模型來研究調(diào)節(jié)氣道反應(yīng)性的遺傳和生化機(jī)制。利用動(dòng)物模型研究氣道反應(yīng)性發(fā)生的正?；蛘弋惓５倪^程可以進(jìn)一步探討出生后環(huán)境因素對(duì)AHR的影響。小結(jié)--哮喘實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究的應(yīng)用35小結(jié)--哮喘實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究的應(yīng)用三、為更好地研究哮喘的免疫病理，一系列的動(dòng)物模型已被采用。許多動(dòng)物（如：家兔、綿羊、豚鼠、大鼠、猴子、狗、小鼠等）被某一抗原致敏激發(fā)后出現(xiàn)肺功能改變（IARs、LARs、氣道反應(yīng)性增加）。四、雖然動(dòng)物模型模仿了人類哮喘的很多特點(diǎn)，但沒有一個(gè)模型能完全具有人類哮喘的特征。但在很多方面還是可用動(dòng)物模型進(jìn)行研究，包括抗原暴露后的病理變化，各種免疫球蛋白、炎性細(xì)胞及介質(zhì)對(duì)氣道功能的影響。今后將開展包括AHR的遺傳學(xué)研究、正?；虍惓獾拦δ馨l(fā)生過程等在內(nèi)的諸多方面的研究。小結(jié)--哮喘實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究的應(yīng)用36

哮喘的臨床研究一、人類哮喘自然病程下的臨床研究二、過敏原激發(fā)實(shí)驗(yàn)以模擬人類哮喘發(fā)病的病理生理過程

37

一、人類哮喘自然病程下的臨床研究哮喘自然史研究（流行病學(xué)調(diào)查）

38Riskfactorsprobablyassociatedwithinfant

wheezingMalegenderLowbirthweight.Environmentaltobaccosmoke.Virusinfections.Riskfactorsprobablyassociat39IncidentPhysicianDiagnosedAsthmainNorrbottenover3Years,1996-99(n=2,100)

AtRisk

RelativeRisk

MultivariateMaleSex 51% 1.1[0.73-1.8]

n.s.FamilyHistory 24% 2.8

[1.8-4.46]

3.3[2.7-3.9]Birthweight(<2.5kg) 4.2% 1.4[0.52-3.8]

n.s.Catathomeever 38% 0.49

[0.28-0.83]0.55[-0.2-1.3]*TypeIallergy

20.6% 4.9

[2.9-8.4]

5.5[4.9-6.1]Cat 13.4% 7.4

[4.3-12]-Dog 8.7% 4.1

[2.1-7.69] -

*CatwasasignificantnegativefactorifTypeIallergywasremovedfromtheanalysis.Perzanowski,M.,etal.AJRCCM2002.IncidentPhysicianDiagnosedA40Reducedprevalenceofhayfever,atopyandasthmaamongfarmers‘children.InSwitzerland:Braun-Fahrl?nderetalClinExpAllergy1999InGermany:vonEhrensteinetal,ClinExpAllergy2000InAustria:Riedleretal,

ClinExpAllergy2000InFinnland:KilpelainenetalClinExpAllergy2000InCanada:Ernstetal,AmJRespCritCareMed2000InAustralia:Downsetal,ClinExpAllergy2001European-wide:Leynaertetal,AmJRespirCritCareMed2001Reducedprevalenceofhayfeve41Resultsofahomebasedenvironmentalinterventionamongurbanchildrenwithasthma.

Controlledtrialofallergenspecificavoidanceforoneyear.Plusoneyearextension.937childrenage5-11insevenUScitiesInterventionResultsFewersymptomdaysfirstandsecondyears(p<0.001).Significantdeclineindustmiteandcockroachallergen(p<0.001).Reductionsindustmiteandcockroachallergensonbedroomfloorsignificantlyassociatedwithreduced–complicationsofasthma.Morganetal’04NewEngJMed351:1068

Resultsofahomebasedenviro42（一）最大呼氣流量（PEF）監(jiān)測(cè)（二）支氣管擴(kuò)張劑試驗(yàn)（三）氣道激發(fā)試驗(yàn)（四）無創(chuàng)性氣道炎癥指標(biāo)監(jiān)測(cè)

（五）變應(yīng)性指標(biāo)監(jiān)測(cè)：包括血清總IgE和特異性IgE測(cè)定，過敏原皮膚試驗(yàn)，過敏原吸入激發(fā)試驗(yàn)（六）支氣管粘膜活檢2.哮喘病情評(píng)估（一）最大呼氣流量（PEF）監(jiān)測(cè)2.哮喘病情評(píng)估43

1、血液：嗜酸性粒細(xì)胞（Eos）計(jì)數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白（ECP）、嗜酸性粒細(xì)胞過氧化酶（EPO）、可溶性白細(xì)胞介素-2受體測(cè)定；2、尿：嗜酸性粒細(xì)胞過氧化酶、9,11-前列腺素F2、白細(xì)胞三烯E4；3、呼出氣體分析：一氧化氮、一氧化碳、碳?xì)浠衔铮?、呼吸冷凝物：過氧化氫、白三烯代謝物、硝基酪氨酸5、誘導(dǎo)痰：細(xì)胞分類尤其Eos絕對(duì)計(jì)數(shù)、可溶性介質(zhì)（ECP，半胱氨酰白三烯等）。

無創(chuàng)性氣道炎癥指標(biāo)監(jiān)測(cè)

1、血液：嗜酸性粒細(xì)胞（Eos）計(jì)數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋44

過敏原激發(fā)實(shí)驗(yàn)以模擬人類哮喘發(fā)病的病理生理過程速發(fā)相哮喘反應(yīng)：特異性支氣管激發(fā)試驗(yàn)中吸入變應(yīng)原后數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘出現(xiàn)的支氣管收縮反應(yīng)?？勺鳛檠芯肯毙园l(fā)作的模型。遲發(fā)相哮喘反應(yīng)：特異性支氣管激發(fā)試驗(yàn)中吸入變應(yīng)原后數(shù)小時(shí)至24小時(shí)出現(xiàn)的與IgE有關(guān)的哮喘反應(yīng)?？勺鳛檠芯肯獾缆匝装Y的模型。

[臨床醫(yī)學(xué)]哮喘研究從基礎(chǔ)到臨床課件45Allergen-inducedincreasesinIL-5receptora-subunitexpressiononbonemarrow–derivedCD34+cellsfromasthmaticsubjectsThedualresponders,butnottheisolatedearlyresponders,developedasignificantincreaseinmethacholineairwayresponsiveness24hafterallergenchallenge.Allergen-inducedincreasesin46Allergen-inducedincreasesinIL-5receptora-subunitexpressiononbonemarrow–derivedCD34+cellsfromasthmaticsubjectsInDR,butnotIERasthmatics,asignificantincreaseinthepercentofCD34+cellsexpressingIL-5Rawasdetectedwhenpre-allergenbonemarrowsampleswerecomparedwith24hpost-allergenaspirates.ThesedatasuggestthatincreasedexpressionofIL-5RaonCD34+cellsfavorseosinophilopoiesisandmaythuscontributetothesubsequentdevelopmentofbloodandtissueeosinophilia,ahallmarkofallergicinflammation.

Sehmietal.JCI,1997.

[臨床醫(yī)學(xué)]哮喘研究從基礎(chǔ)到臨床課件47

Allergen-inducedfluctuationinCCR3expressiononbonemarrowCD34+cellsfromasthmaticsubjectsThenumberofbonemarrowCD34+CCR3+cellsissignificantlyincreasedinDRasthmaticswhocharacteristicallydevelopalate-bronchoconstrictorresponse,sputumandbloodeosinophiliaandincreasedmethacholineairwayresponsiveness24hrafterpostallergeninhalation.However,asignificantlyattenuationinthenumbersofCD34+CCR3+cellswasobservedinERasthmaticswhodonotdevelopabloodeosinophiliaandairwayresponsivenessafterpostallergeninhalation.Sehmietal.Immunology,2003.

[臨床醫(yī)學(xué)]哮喘研究從基礎(chǔ)到臨床課件48“IL-5Story”

根據(jù)基礎(chǔ)研究的結(jié)果可以提出假說和指導(dǎo)臨床實(shí)踐。但是動(dòng)物模型和人體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并不總是一致的！[臨床醫(yī)學(xué)]哮喘研究從基礎(chǔ)到臨床課件49“IL-5Story”“TreatmentofOVA-challengedanimalswithanti-IL-5antibodyduringthesensitizationprotocolcompletelyabolishedtheinfiltrationofeosinophilsintothelungtissueandpreventedthedevelopmentofAHR”

HamelmannE.etal.:AmJRespirCritCareMed.1997and1999“MonoclonalantibodiesdirectedagainstIL-5havebeenusedinatleastfourstudiesinvolvingpatientswithasthma.Thosepreliminarystudieshaveshownclear

reductionsinbothbloodandsputumeosinophilsbutnosignificantchangesinphysiologicalparametersofAHR,thelateasthmaticreactionorinlungfunctionorsymptoms”LeckieM.J.:AmJRespirMed.2003[臨床醫(yī)學(xué)]哮喘研究從基礎(chǔ)到臨床課件50

“IL-5story”-可能的原因

analysissensitizationchallengeaerosoli.p./s.c.analysisallergenchallengetreatmenthumanmousetreatmentaerosolyearsweakschronicinflammationHamelmannetal.AmJRespirCritCareMed.1999“IL-5story”-可能的原因analys51對(duì)第1層和第2層病人的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案舒利迭50/100or氟替卡松1008-周哮喘控制評(píng)估4-周哮喘控制評(píng)估第一階段舒利迭50/250or氟替卡松250舒利迭50/500or氟替卡松500Step1Step2Step3GOALStudy回訪次數(shù) 1 2 3 4 5 6 7 8 9周 -4 0 4 12 24 36 48 52 56對(duì)第1層和第2層病人的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案舒利迭50/1008-52Run-in

BudesonidepMDIspacer600μgbidBudesonideTurbuhaler?

200μgbidPlaceboTerbutalinepMDIspacer

375μgbidBudesonidepMDIspacer

600μgbidRun-inNo2TwoyearsThirdyearEarlyvsdelayedinterventionHaahtelaetal.NEJM1994Run-inBudesonidepMDIspacer53研究方法篩選布地奈德/福莫特羅都保（160/4.5g/吸）x2吸一日二次布地奈德都保（200g/吸）x2吸，一日二次福莫特羅都保（4.5g/吸）x2吸，一日二次隨機(jī)化周數(shù) -2 0 2 4 6 8 10 12就診 1 2 3 4 5研究方法篩選布地奈德/福莫特羅都保（160/4.5g/吸）54

今后的若干研究方向

1.哮喘遺傳病學(xué)研究：哮喘和/或特應(yīng)癥基因的確定。2.闡明神經(jīng)和內(nèi)分泌因素在哮喘發(fā)病中的作用。3.哮喘病慢性化的機(jī)制：持續(xù)性慢性氣道炎癥;氣道重構(gòu)；其它因素？4.發(fā)展和篩選反映哮喘氣道炎癥及其嚴(yán)重度的無創(chuàng)方法和可靠指標(biāo)。

5.發(fā)展新的抗炎藥物，如chemokinereceptorantagonist；

neurotrophin-andreceptorantagonistspeptidaseinhibitorsantisenseoligosagainstSTATs；C3aandC5areceptorantagonists。6.長(zhǎng)期吸入ICS和LABA的副作用和安全性。[臨床醫(yī)學(xué)]哮喘研究從基礎(chǔ)到臨床課件55哮喘研究－從基礎(chǔ)到臨床Scientificresearchonasthma:frombenchtobedside浙江大學(xué)附屬二院呼吸科浙江大學(xué)呼吸疾病研究所沈華浩哮喘研究－從基礎(chǔ)到臨床浙江大學(xué)附屬二院呼吸科56哮喘最新定義：支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是一種以嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞參與的氣道慢性炎癥。這種炎癥使易感者產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作性的喘息、呼吸困難、胸悶或咳嗽等癥狀，常在夜間和（或）清晨發(fā)作、加劇，常伴有廣泛多變的可逆性氣流受限，多數(shù)患者可自行或經(jīng)治療后緩解。

哮喘最新定義：57哮喘研究的動(dòng)物模型Experimental

modelsforasthma

哮喘研究的動(dòng)物模型58應(yīng)用動(dòng)物模型的價(jià)值建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的目的是更好地解釋人類疾病發(fā)病過程。通過動(dòng)物模型，我們可以探討許多難以直接從臨床得到的疾病發(fā)病機(jī)理。盡管各種動(dòng)物模型在體現(xiàn)人類疾病上還存在一定的缺陷，但不可否認(rèn)的是通過動(dòng)物模型所得到的信息，使得我們對(duì)人類疾病過程有了更透徹清晰的認(rèn)識(shí)。應(yīng)用動(dòng)物模型的價(jià)值59人類哮喘的特征氣道慢性炎癥：大量炎性細(xì)胞–T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等，它們釋放出LTs、PGs、PAF等炎性介質(zhì)，引起微小血管滲漏、支氣管黏膜水腫、腺體分泌增加、粘液栓形成等病理改變，氣道高反應(yīng)性（AHR）：氣道對(duì)特異和非特異刺激的高反應(yīng)性，如組織胺，乙酰甲膽堿。氣道重建：上皮脫落、上皮下基底膜膠原沉積、平滑肌肥大增殖、粘膜水腫、杯狀細(xì)胞及粘液腺增生分泌亢進(jìn)，氣道周血管擴(kuò)張，新生血管形成。

人類哮喘的特征氣道慢性炎癥：大量炎性細(xì)胞–T淋巴細(xì)胞、60臨床研究哮喘受限制一、肺組織標(biāo)本獲取不易，具有一定危險(xiǎn)性。并且僅能反映疾病發(fā)展中的某一點(diǎn)，不能全程反映疾病過程。二、BALF的獲取更需疾病允許，尤其哮喘發(fā)作時(shí)難以獲取，不易將肺的結(jié)構(gòu)（病理）和功能（病理生理）結(jié)合起來。三、要明確參與LAR過程的抗體類型很不容易，因?yàn)槲覀儾豢赡軐⒛硞€(gè)特異抗原免疫病人而使其產(chǎn)生相應(yīng)抗體或?yàn)槠漭斪⒖乖禺愋钥贵w。四、不能冒著哮喘發(fā)作的危險(xiǎn)來探索引起哮喘發(fā)作的抗原。臨床研究哮喘受限制一、肺組織標(biāo)本獲取不易，具有一定危險(xiǎn)性。61研究哮喘的動(dòng)物1生來具有反復(fù)發(fā)作性喘息的動(dòng)物：貓、馬。2抗原激發(fā)前即具有AHR的動(dòng)物：狗、嚙齒類動(dòng)物。3僅在抗原激發(fā)后方具有可逆性氣流阻塞和/或AHR的動(dòng)物：兔、羊、豚鼠、大鼠、小鼠。

研究哮喘的動(dòng)物62生來具有反復(fù)發(fā)作性喘息的動(dòng)物馬亦存在自發(fā)性反復(fù)發(fā)作的氣流阻塞。這是因?yàn)橹旅魻顟B(tài)的馬經(jīng)常暴露于含有真菌孢子的干草的緣故。相同點(diǎn)：哮喘類型與人類哮喘相似的特征職業(yè)性哮喘暴露于抗原時(shí)癥狀明顯脫離抗原環(huán)境、癥狀緩解AHR可因脫離抗原而降低變應(yīng)性哮喘可逆性反復(fù)發(fā)作的氣流阻塞發(fā)作后可緩解具有明確的過敏原生來具有反復(fù)發(fā)作性喘息的動(dòng)物馬亦存在自發(fā)性反復(fù)發(fā)作的氣流阻63抗原激發(fā)誘導(dǎo)可逆性氣流阻塞和氣道高反應(yīng)性的動(dòng)物

兔

羊

豚鼠

大鼠

小鼠

抗原激發(fā)誘導(dǎo)可逆性氣流阻塞和兔64激發(fā)抗原的選擇

1.Proteinantigene.g.OVA,Derp,BetV2.Housedustmite(HDM)3.Fungie.g.Aspergillusfumigatus(extractorconnidia)4.Parasitese.g.Schistosomamansoni5.Worme.g.Nippostrongylusbrasiliensis6.Chemicalcompoundse.g.toluenediisocyanate激發(fā)抗原的選擇1.Proteinantigen65激發(fā)抗原的選擇

Theallergensourceshouldreflectthehumansituation:1.HDM,pollenandfungiarenaturalallergens2.inhalationisthenaturalexpositionroute3.extractsorpollenstarchgranulaarebetterthanpurifiedprotein,but,highdegreeofvariance激發(fā)抗原的選擇Theallergensourc66豚鼠曾經(jīng)廣泛應(yīng)用于哮喘研究，直到1985年才首次在豚鼠哮喘模型上描述LAR時(shí)相，之后許多學(xué)者應(yīng)用豚鼠研究了LAR。豚鼠曾經(jīng)廣泛應(yīng)用于哮喘研究，直到1985年才首次在豚鼠哮喘模67Brattard（1985）OVA+Al(OH)2致敏豚鼠(IP)，使動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生OVA特異性IgE和IgG.在麻醉狀態(tài)下，氣管內(nèi)滴注OVA微粒抗原致敏,6小時(shí)后可誘發(fā)出LAR，48小時(shí)后消失。該模型中，IAR時(shí)相產(chǎn)生的肺阻力大于24小時(shí)后的LAR。對(duì)未致敏豚鼠或產(chǎn)生IgG而非IgE的致敏豚鼠進(jìn)行攻擊均不能誘發(fā)出LARs，組織學(xué)表現(xiàn)：以嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的局限性細(xì)支氣管炎，平滑肌收縮、粘膜下水腫和氣道粘液形成在激發(fā)前/后應(yīng)用激素可抑制LAR時(shí)相反應(yīng)，但并不能阻斷炎癥細(xì)胞的募集。Brattard（1985）68建立豚鼠哮喘模型有多種不同的方法（抗原種類、致敏方式等）、不同的麻醉方法和肺功能測(cè)定方法；結(jié)果表示也有不同的方法（LAR出現(xiàn)的時(shí)間、LAR產(chǎn)生的次數(shù)、LAR強(qiáng)度）。這說明即使在同一品系動(dòng)物，應(yīng)用不同的方法可引起不同程度的氣流阻塞。重要的是在不同的背后存在相同之處。如在三組實(shí)驗(yàn)中有兩組證明了在引起LARs方面抗原特異性IgE比抗原特異性IgG更為重要。此外，所用實(shí)驗(yàn)均說明了Eos的肺內(nèi)募集與LAR存在相關(guān)性。建立豚鼠哮喘模型有多種不同的方法（抗原種類、致敏方式等）、不69應(yīng)用OVA主動(dòng)免疫致敏或應(yīng)用大鼠雜交瘤產(chǎn)生的抗二硝基酚IgE被動(dòng)免疫致敏。氣管內(nèi)給予特異性抗原。24hr后，OVA致敏組BAL中多形核細(xì)胞明顯高于對(duì)照組，被動(dòng)免疫致敏組（IgE致敏組）應(yīng)用抗原霧化攻擊1－2hr后BAL中的多形核細(xì)胞明顯上升，24hr恢復(fù)正常。對(duì)IgE致敏組進(jìn)行組織病理學(xué)檢查顯示，攻擊2h后可見肺泡和間質(zhì)水腫，伴有局限性細(xì)支氣管周圍多形核細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥在24hr后消失。另外可見間質(zhì)內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。無論是主動(dòng)免疫致敏還是被動(dòng)免疫致敏大鼠，均能建立起抗原特異性IgE依賴的氣道炎癥。應(yīng)用OVA主動(dòng)免疫致敏或應(yīng)用大鼠雜交瘤產(chǎn)生的抗二硝基酚I70小鼠小鼠模型已成為研究抗原誘導(dǎo)的氣道反應(yīng)性的一個(gè)重要的模型，因?yàn)閷?duì)小鼠免疫系統(tǒng)認(rèn)識(shí)廣泛全面，可以用來研究T細(xì)胞在AHR發(fā)生發(fā)展中的作用。小鼠不僅可用常規(guī)方法激發(fā)，也可采用其他更簡(jiǎn)易的方法。如觀察靜脈給予MCH致氣道收縮所需濃度。小鼠71小鼠3正?；蚩乖旅舻男∈髿獾揽捎脕硌芯侩姶碳ず笊窠?jīng)元介質(zhì)的釋放。如對(duì)某一品系的小鼠反復(fù)抗原暴露可使氣道對(duì)神經(jīng)刺激的反應(yīng)增強(qiáng)，表現(xiàn)為達(dá)到50％最大收縮（ES50）所需的電刺激頻率明顯降低，其原因是反復(fù)抗原刺激后神經(jīng)元釋放Ach能力增強(qiáng)。小鼠72小鼠最初的小動(dòng)物模型之一采用了BALB/c小鼠,動(dòng)物經(jīng)皮給予picrylchloride致敏，后滴鼻給予同一致敏原激發(fā)，于激發(fā)后24至48小時(shí)可見支氣管周圍及血管周圍巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞積聚，同時(shí)伴肺阻力增加，但無動(dòng)態(tài)順應(yīng)性改變。小鼠73小鼠A/J小鼠以綿羊血紅細(xì)胞致敏激發(fā)可致AHR及明顯的肺Eos炎癥，而使用抗CD4單克隆抗體阻斷CD4+T細(xì)胞后AHR及肺Eos炎癥均被抑制，可見該模型中氣道功能的改變依賴CD4＋T細(xì)胞，而Eos是該反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞。小鼠74有兩種方法證實(shí)此模型存在氣道功能的改變。1、采用整體體積描記法：經(jīng)靜脈給予濃度依次增高的MCH后發(fā)現(xiàn)氣流傳導(dǎo)（airwayconductance）改變，致敏組較非致敏組對(duì)MCH的反應(yīng)性明顯增高。2、采用體外測(cè)定法：離體氣道平滑肌給予一定量的電流刺激，隨著刺激頻率的增加氣道收縮增強(qiáng)，結(jié)果致敏組小鼠的ES50較非致敏小鼠明顯降低，其機(jī)理可能是電流刺激后致敏小鼠氣道副交感神經(jīng)末梢釋放ACH較非致敏小鼠多，同時(shí)伴M2毒蕈堿受體功能喪失。有兩種方法證實(shí)此模型存在氣道功能的改變。75

急性哮喘模型

ProtocolSensitization(i.p.OVA)Challenge(1%OVA)

1st2nd1st2nd3rd

Days01424252628Analysis

(AirwaysInflammation)

(Lunghistology)

(Th1/Th2responses)

急性哮喘模型76

Advantagesofanacuteallergicmousemodel

Similartohumans-Airwayhyperresponsivenss-Eosinophylia-IncreasedIgE-Gobletcellhyperplasia/metaplasia

-Mucushypersecretion-MucosalEdemaAdvantagesofanac77

Advantagesofanacuteallergicmousemodel

Usefulforbasicresearch:RoleofeosinophilsandCD4+T-lymphocytesAdhesionandchemotacticmoleculesandcellrecruitmentTestconventionalpharmacologicalagentsTransgenicandgene-targetedmouseAdvantagesofanac78BALB/c和C57BL/6J（B6）小鼠.近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通過轉(zhuǎn)基因或基因敲除技術(shù)，已培育出數(shù)十種新的小鼠品系:

IL-5轉(zhuǎn)基因:IL-5+/+，如NJ1638和NJ1720）.IL-5基因敲除（IL-5-/-）品系.IL-4-/-品系，IFN-a-/-品系，CD4-/-、CD8-/-、T細(xì)胞-/-，Eotaxin+/+、 Eotaxin-/-，IL-13-/-，等。BALB/c和C57BL/6J（B6）小鼠.79特殊類型細(xì)胞和細(xì)胞因子基因敲小鼠抗原致敏和激發(fā)后氣道炎癥反應(yīng)比較

細(xì)胞/細(xì)胞因子氣道上皮氣道粘液BALAHR缺陷病理分泌亢進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞（Mch）

Bcells+ +++Tcells(ab,gd)————alphabeta+Tcells————gammadelta+Tcells+++/-?CD4+cells————CD8+cells++++NK-TcellsNDND+NDEosinophils+/-+/-——野生小鼠 ++++

特殊類型細(xì)胞和細(xì)胞因子基因敲小鼠抗原致敏和激發(fā)后氣道炎癥反應(yīng)80特殊類型細(xì)胞和細(xì)胞因子基因敲小鼠抗原致敏和激發(fā)后氣道炎癥反應(yīng)比較

細(xì)胞/細(xì)胞因子氣道上皮氣道粘液BALAHR缺陷病理分泌亢進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞（Mch）

(IL-5[-/-])+/-+/-----IL-4[-/-]+/-—++IL-13[-/-]+/-—++/-IFN-r[-/-]++++野生小鼠 ++++

特殊類型細(xì)胞和細(xì)胞因子基因敲小鼠抗原致敏和激發(fā)后氣道炎癥反應(yīng)81

036122550MethacholineDose(μg/kg)EffectsofHuangqiandDXMonairwayresponsivenessinOVA-sensitizedmice.Airwayresponsivenesswasmeasuredat48hfollowinglastOVAchallenge.ATheMeandoseresponsecurvestonebulizedmethacholine(Mch).Airwayreactivity(Penh,y-axis)inresponsetoincreasingdosesofnebulizedMch(x-axis)wasassessedbywhole-bodyplethysmography.Dataareexpreddedasthemeans±SEM(n=8-10).*p<0.05comparedwithsaline/salinemice.?p<0.05comparedwithsaline-treatedOVAchallengedmice.

082

Disadvantagesofanacuteallergicmousemodel

-Noasthmaspontaneously-Nogeneticandenvironmentalfactors-Airwaysinsensitiveforhistamine-Hardlyairwayremodeling-Noeosinophilsinairwaysunderbasalconditions-HardlyairwayremodelingandnotachronicdiseaseDisadvantagesofanacu83

慢性哮喘模型/氣道重構(gòu)模型