醫(yī)療藥品無菌檢查法驗證

無菌檢查法驗證

張榮玉一、概述：1.1

定義：系用于檢查藥典要求的無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其它品種是否無菌的一種方法。2.1驗證的必要性和意義：確認所采用的方法檢查供試品無菌的適合性。保證檢查結(jié)果的準確性、可靠性、準確性和重現(xiàn)性；檢查方法的完整性。與同藥品無菌檢查接軌。通過對不同品種、批號的無菌檢查比較；對產(chǎn)品生產(chǎn)全過程進行質(zhì)量監(jiān)控。二、存在問題:2.1專業(yè)人才少,缺乏相應(yīng)的培訓(xùn)和管理。2.2工作量大,導(dǎo)致操作不規(guī)范。2.3檢驗方法缺陷，如直接種法可操作性差，引入污染的風險較大。2.4試驗條件的影響環(huán)境影響培養(yǎng)基、稀釋劑、沖洗液。所用品、器具清潔滅菌。三、無菌檢查的試驗要求:3.1環(huán)境：10000級局部以下100級，布局符合無菌操作要求；或隔離系統(tǒng)（生物安全柜）。3.2人員：必須具備微生物專業(yè)知識，并經(jīng)培訓(xùn)。3.3設(shè)備、器件、材料：經(jīng)處理必須符合無菌要求，培養(yǎng)箱的溫度指示裝置要校驗。3.4培養(yǎng)基：3.4.1按藥典規(guī)定處方配制，采用經(jīng)驗證合格的滅菌程序滅菌。3.4.2保存：2-25℃避光保存；期限：非密閉容器3周，密閉容器1年。3.4.3培養(yǎng)基適用性、無菌性、靈敏度檢查。3.4.4靈敏度檢查：3.4.4.1檢查用菌株傳代不得超過5代。3.4.4.2常用菌株：金黃色葡萄球菌（CMCC(B)26003)銅像假單胞菌[CMCC（B）10104]枯草芽胞桿菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]白色念珠菌[CMCC（F）98001]黑曲霉[CMCC（F）98003]3.4.4.3菌液配制、保存、接種培養(yǎng)按藥典要求。3.4.4.4結(jié)果判斷：空白對照應(yīng)無細菌增長，加菌液的培養(yǎng)基管均生長良好，培養(yǎng)基靈敏度符合要求。3.5稀釋液、沖洗液：3.5.1按藥典規(guī)定配制后采用經(jīng)驗證的滅菌程序滅菌。3.5.2常用稀釋液、沖洗液：0.1%蛋白胨水液PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液無菌0.1%氯化鈉液中性磷酸鹽緩沖液含0.1%聚山梨酯（吐溫-80℃）的0.1%蛋白胨水溶液3.5.3依據(jù)供試品的特性選擇稀釋液、沖洗液。四、無菌檢查法驗證:4.1原理:驗證的所有環(huán)境、培養(yǎng)基、菌株、稀釋液、沖洗液均與日常檢查方法相一致、并符合相關(guān)規(guī)定。4.2驗證分類：前驗證：建立無菌檢查方法時。再驗證：修訂檢查方法時。定期驗證：供試品組合或原檢查條件改變。4.3驗證方案制定原則：供試品的抑菌性，敏感菌種選擇;適當?shù)姆椒ㄏ蚪档鸵志浴悠返念A(yù)處理方式能有效抵消（或中和）產(chǎn)品的抑菌性。樣品的預(yù)處理方式、檢驗過程、培養(yǎng)條件均不影響樣品中微生物的生長。驗證記錄真實完整地記錄所做試驗。4.4驗證重點環(huán)節(jié)分布：樣品需前處理不需前處理驗證前處理方法對污染菌生長，檢出影響有抑菌作用去除抑菌作用通過驗證實驗判無抑菌作用驗證抑菌活性去除方法的有效性及對污染菌檢出物影響檢驗4.5驗證方法：4.5.1制備驗證試驗菌液，按藥典方法配制菌液。4.5.2選擇配制適合的培養(yǎng)基、稀釋液、沖洗液。4.5.3供試品的處理：驗證所用的溶解劑、稀釋劑、助溶劑、破乳劑等的有效性，使用量及微生物生長無影響。驗證加熱溫度、離心速度和時間對微生物生長或分布無影響。不需前處理的供試品免做。4.5.4無抑菌性性樣品的的驗證方方法：依依據(jù)產(chǎn)品品溶解性性和微生生物限度度選擇合合適的中中性稀釋釋劑溶解解和稀釋釋，用直直接接種種法驗證證，常用用中性稀稀釋液或或淋洗液液。4.5.5具有抑菌菌性樣品品的驗證證方法：：確定抑菌菌作用（（抑細菌菌、真菌菌試驗驗驗證），，選擇敏敏感菌株株對供試試品抑菌菌活性去去除效果果檢驗（（陽性菌菌回收試試驗）。。消除樣品品抑菌性性的方法法驗證：：化學鈍化化中和法法（化學學試劑中中合法））：利用用化學（（生物））專屬性性滅活，，常用鈍鈍化劑有有：對氨氨基苯甲甲酸、卵卵磷脂、、聚山梨梨酯-80等。薄膜膜過濾法法和直接接接種法法也可用用。對化化學中和和劑不敏敏感的樣樣品，用用酶中和和，如β-內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶酶。稀釋中和和法：利利用降低低供試品品的相對對濃度，，將樣品品稀釋至至最低抑抑菌濃度度下進行行。薄膜過濾濾法：利利用體積積差異分分離，通通過薄膜膜過濾，，微生物物被截于于濾膜，，培養(yǎng)薄薄膜觀察察有無微微生物生生長。各各方法組組合運用用，效果果更好。。③驗證方法法:a.驗證分組組：A組:樣品組,適當方法法中和樣樣品,加入少量量驗證微微生物(接種量少少于100cfu)。B組:對照組,0.1%蛋白胨或或PH7.0無菌氯化化鈉蛋白白胨緩沖沖液,加少量微微生物(接種量少少于100cfu).C組：陽性性對照組組，不經(jīng)經(jīng)中和處處理，將將實驗菌菌株直接接接種于于培養(yǎng)基基中(接種量少少于100cfu)。b.結(jié)果分析析:A組與B組微生物物生長數(shù)數(shù)量相似似，表明明中和劑劑的中和和方式有有效消除除了樣品品的抑菌菌性，如如果B組與C組的微生生物數(shù)量量相似，，表明樣樣品預(yù)處處理用中中和劑的的毒性、、檢測程程序和培培養(yǎng)條件件等均不不影響微微生物生生長。樣樣品如無無抑菌性性，省去去B組試驗，，A組與C組直接比比較。A組微生物物生長數(shù)數(shù)量不及及C組微生物物生長數(shù)數(shù)量，表表明試驗驗用器具具材料或或培養(yǎng)條條件等方方面存在在對微生生物生長長不利因因素。c.為考查驗驗證方法法的穩(wěn)定定性和重重現(xiàn)性，，驗證至至少需3個不同批批次的同同類樣品品，分別別進行3次驗證實實驗。五、供試品無無菌檢查查驗證:5.1按藥典要要求確定定檢驗數(shù)數(shù)量、檢檢驗量、、設(shè)立陽陽性對照照和陰性性對照。。5.2供試品無無菌檢查查方法和和檢驗條條件與驗驗證方法法相同。。5.3直接接種種法驗證證試驗：：5.3.1供試品有有抑菌時時，按培培養(yǎng)基靈靈敏度試試驗的菌菌種，向向該種無無菌檢查查培養(yǎng)基基內(nèi)加入入該微生生物，每每種培養(yǎng)養(yǎng)基接2瓶，每瓶瓶接種量量控制10-100cfu之間。5.3.2參照藥典典規(guī)定確確定培養(yǎng)養(yǎng)基用量量，按無無菌檢查查要求向向上述其其中一瓶瓶加入規(guī)規(guī)定量供供試品，，另一瓶瓶為陽性性對照。。5.3.3將種好的的容器按按藥典規(guī)規(guī)定溫度度培養(yǎng)14days。5.3.4驗證結(jié)果果評價：：供試品與與陽性對對照相比比、供試試品容器器內(nèi)微生生物生長長不明顯顯，說明明有抑菌菌性?？煽墒褂弥兄泻蛣┤缛绫葴?80。β-內(nèi)酰胺酶酶等消除除抑菌效效果。中中和劑不不能消除除抑菌作作用，適適當增加加培養(yǎng)基基體積稀稀釋。5.4薄膜過濾濾法驗證證試驗：：5.4.1薄膜過濾濾法驗證證試驗供供試品有有抑菌特特性時，，在同型型號的每每個過濾濾器加規(guī)規(guī)定定量量的供試試品（容容器數(shù)及及每容器器的過濾濾體積））。淋洗洗至少3次，淋洗洗液為100ml/次，最后后一次淋淋洗液中中，接種種驗證用用菌株（（10-100cfu）；取另另一濾器器不過濾濾供試品品，重復(fù)復(fù)上述淋淋洗操作作，作為為陽性對對照。分分別將靈靈敏度實實驗的菌菌種及相相應(yīng)培養(yǎng)養(yǎng)基逐一一試驗。。5.4.2供試品和和陽性對對照接種種后、培培養(yǎng)基容容器按藥藥典菌株株要求溫溫度下培培養(yǎng)，時時間不超超過14days。5.4.3使用新的的濾膜過過濾器（（不同廠廠家或批批號、型型號）重重新進行行樣品試試驗組、、蛋白胨胨對照組組和陽性性對照組組的驗證證確認。。5.4.4驗證結(jié)果果評價：：供試品培培養(yǎng)基容容器內(nèi)可可見微生生物生長長明顯（（混濁）），與陽陽性對照照組比較較結(jié)果相相似，則則在無菌菌檢查試試驗中必必須過濾濾與驗證證試驗相相等量的的供試品品、淋洗洗液。淋淋洗相同同次數(shù)及及使用相相同量的的培養(yǎng)基基。供試品培培養(yǎng)基容容器內(nèi)與與陽性對對照結(jié)果果相比微微生物生生長不明明顯，應(yīng)應(yīng)增加淋淋洗次數(shù)數(shù)、重復(fù)復(fù)上述試試驗。六、驗證合格格標準:6.1平皿菌落落計:6.1.1通常用于于藥品防防腐劑防防腐效力力測試和和微生物物限度檢檢查中。。計數(shù)每每毫升（（或克））樣品的的微生物物含量。。6.1.2每種試驗驗菌每組組至少重重復(fù)3次（3個不同批批次的樣樣品）。。6.1.3合格標準準：A組（樣品品試驗組組）驗證證微生物物平均生生長數(shù)量量不低于于C組（陽性性對照組組）驗證證微生物物平均生生長數(shù)量量的70%，檢驗方方法通過過驗證。。6.2直接接種種法：6.2.1培養(yǎng)基能能中和抗抗菌劑的的抑菌性性，并適適合廣譜譜微生物物的生長長，包括括樣品種種潛在微微生物生生長。6.2.2每種試驗驗菌種每每組實驗驗至少獨獨立重復(fù)復(fù)3次。如需需要改變變產(chǎn)品和和培養(yǎng)基基比率達達到中和和效果。。6.2.3合格標準準：3批（不同同批次的的樣品））在14days內(nèi)所有樣樣品試驗驗組中培培養(yǎng)基都都顯示大大量的微微生物生生長，則則相應(yīng)的的試驗方方法通過過驗證。。6.3薄膜過濾濾法：6.3.1適用于無無菌檢查查和生物物限度堅堅查，樣樣品必須須能被過過濾。需需溶解的的樣品應(yīng)應(yīng)驗證該該樣品的的溶解方方式及整整個試驗驗過程，，試驗用用具和材材料及培培養(yǎng)條件件等不會會影響樣樣品中固固有的微微生物的的生長。。6.3.2樣品試驗驗組、樣樣品溶液液通過薄薄膜，用用適量淋淋洗液淋淋洗3次，在最最后一次次淋洗液液中接入入少量（（10-100財富）驗驗證菌。。淋洗后后，將濾濾膜轉(zhuǎn)移移到固體體培養(yǎng)基基（或液液體培養(yǎng)養(yǎng)基中））培養(yǎng)。。樣品抑抑菌性強強、則應(yīng)應(yīng)進行中中和處理理，再驗驗證中和和效果。。6.3.3蛋白胨對對照組：：不加產(chǎn)產(chǎn)品的稀稀釋液，，其他操操作及實實驗條件件與樣品品試驗組組相同。。驗證中中和用鈍鈍化劑（（針對需需預(yù)處理理的樣品品）、過過濾器和和濾膜材材質(zhì)是否否會對微微生物產(chǎn)產(chǎn)生影響響）。6.3.4陽性對照照組：將將與上述述兩組等等量同種種驗證菌菌液（10-100cfu）直接種種到固體體培養(yǎng)基基表面（（或液體體培養(yǎng)基基中）。。比較蛋蛋白胨對對照組和和陽性對對照組微微生物的的情況，，估算濾濾器和濾濾膜造成成微生物物的損失失量。6.3.53次試驗（（3個不同批批次的樣樣品）結(jié)結(jié)果評價價：上述述3組試驗結(jié)結(jié)果間差差異均在在70%以上（固固體培養(yǎng)養(yǎng)基）或或培養(yǎng)14days內(nèi)所有試試驗組的的液體培培養(yǎng)基微微生物均均有生長長，則認認為驗證證微生物物的回收收率基本本相同，，相應(yīng)的的微生物物驗證方方法同過過驗證。。七、驗證試驗驗結(jié)果的的評價與與報告:7.1分析評價價主要包包括有：：7.1.1對每個驗驗證試驗驗的菌株株、每次次驗證試試驗的數(shù)數(shù)據(jù)及其其有效性性和合理理性評價價。7.1.2驗證試驗驗數(shù)據(jù)所所表明的的檢品預(yù)預(yù)處理方方式、檢檢驗用器器具、材材料、培培養(yǎng)條件件等的合合理性是是否符合合規(guī)定要要求，它它們與藥藥品檢驗驗的規(guī)程程要求是是否符合合。7.1.3驗證試驗驗數(shù)據(jù)最最后要說說明該藥藥品的微微生物檢檢測方法法是否準準確、有有效、可可靠與可可行，是是否有較較好的重重現(xiàn)性。。最后得得出結(jié)論論。7.2驗證試驗驗報告內(nèi)內(nèi)容包括括有：7.2.1驗證試驗驗藥品的的名稱，，待驗證證檢驗方方法的有有效登記記號。7.2.2驗證試試驗用用菌株株名稱稱、菌菌號、、試驗驗室控控制號號、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)種代代數(shù)。。7.2.3驗證菌菌株的的制備備和接接種記記錄。。7.2.4驗證供供試品品的預(yù)預(yù)處理理方法法、檢檢驗用用具和和材料料、檢檢測步步驟以以及培培養(yǎng)條條件等等。7.2.5驗證試試驗結(jié)結(jié)果的的評價價及結(jié)結(jié)論。。7.2.6驗證條條件：：包括括驗證證試驗驗的原原始記記錄，，包括括驗證證菌株株的制制備和和接種種量復(fù)復(fù)核、、驗證證試驗驗結(jié)果果等。。無菌驗驗證范范例（（注射射劑無無菌檢檢查方方法））一、材材料：：1.1樣品：：品名名、規(guī)規(guī)格、、批號號、生生產(chǎn)批批號。。1.2培養(yǎng)基基稀釋釋液：：硫乙乙醇酸酸鹽液液體培培養(yǎng)基基、批批號；；改良良馬丁丁液體體培養(yǎng)養(yǎng)液，，批號號；營營養(yǎng)肉肉湯培培養(yǎng)基基，批批號；；營養(yǎng)養(yǎng)瓊脂脂培養(yǎng)養(yǎng)基，，批號號；0.1%蛋白胨胨滌養(yǎng)養(yǎng)，PH7.1±±0.2；培養(yǎng)養(yǎng)基和和稀釋釋液來來源。。1.3驗證試試驗用用菌種種：所所用菌菌代數(shù)數(shù)。金金黃色色葡萄萄球菌菌（26003）；銅銅綠假假單胞胞菌（（10104），枯枯草芽芽孢桿桿菌（（63501）;生孢梭梭菌（（64941）；白白色念念珠菌菌（98001）；黑黑曲霉霉菌（（98003），上上述菌菌種的的來源源及傳傳代數(shù)數(shù)。1.4儀器和和濾器器：HTY-2001A集菌儀儀；全全封閉閉無菌菌試驗驗過濾濾培養(yǎng)養(yǎng)器，，批號號及生生產(chǎn)廠廠商。。二、驗驗證方方法：：2.1菌液制制備：：取經(jīng)34℃℃培養(yǎng)18-24h的金葡葡萄、、銅綠綠假單單胞菌菌，枯枯草孢孢芽菌菌的新新鮮肉肉湯培培養(yǎng)物物1ml，加入入無菌菌0.9%氯化鈉鈉溶液液9ml，10倍稀釋釋至10-5、10-7均為50-100cfu/ml，備用用。取經(jīng)34℃℃培養(yǎng)18-24h的生孢孢梭菌菌硫乙乙醇酸酸鹽液液體培培養(yǎng)物物1ml。加入入無菌菌0.9%氯化鈉鈉溶液液9ml，10倍稀釋釋至10-7均為50-100cfu/ml，備用用。取經(jīng)24℃℃培養(yǎng)的的白色色念珠珠菌改改良馬馬丁液液體培培養(yǎng)物物1ml，加入入無菌菌0.9%氯化鈉鈉溶液液9ml，10倍稀釋釋至10-7均為50-100cfu/ml，備用用。取經(jīng)24℃℃培養(yǎng)一一周的的黑曲曲霉料料面培培養(yǎng)物物，加加入無無菌0.9%氯化鈉鈉溶液液10ml，洗下下孢子子；吸吸出孢孢子懸懸液，，過濾濾除去去菌籽籽，收收集菌菌液至至另一一無菌菌試管管，取取菌液液0.1ml，加入入無菌菌0.9%氯化鈉鈉溶液液9.9ml，稀釋釋至10-7均為50-100cfu/ml，備用用。2.2菌液計計數(shù)：：每種種菌液液接種種工作作皿、、取平平均值值。計計數(shù)結(jié)結(jié)果列列表（（略））。。2.3方法驗驗證