生化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)完美版2課件

2010級(jí)本科分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)案例：

患兒，男性，3歲，因面色蒼白伴血尿1天入院。1天前食用新鮮蠶豆后，今日出現(xiàn)惡心、嘔吐、排尿呈醬油樣色，面色蒼白。據(jù)家長(zhǎng)反映，患者的姐姐也曾發(fā)生過(guò)類似情況。

體格檢查：體溫38℃(37.2℃），脈搏150次/分（75次/分），呼吸40次/分（20次/分），血壓80/60mmHg（100~120/60~80mmHg），呼吸急促，神清，萎靡，面色蒼白，皮膚及鞏膜黃染，體型較同齡人瘦小。心、肺未及異常，肝、脾未觸及，雙腎區(qū)無(wú)叩擊痛，神經(jīng)系統(tǒng)檢查未及異常。實(shí)驗(yàn)室檢查：

紅細(xì)胞1.98×1012/L(新生兒:6.0×1012/L)

血紅蛋白53g/L(兒童：110~160g/L)

血清總膽紅85.5μmol/L（3.4~11.7μmol/L）結(jié)合膽紅素13.7μmol/L

未結(jié)合膽紅素71.8μmol/L

尿蛋白（++）潛血(+)尿膽紅素(－)尿膽素原(+)尿液鏡下未見(jiàn)紅細(xì)胞發(fā)病機(jī)理紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）有遺傳缺陷者在食用青鮮蠶豆或接觸蠶豆花粉后皆會(huì)發(fā)生急性溶血性貧血癥——蠶豆病，致病機(jī)制尚未十分明了。已知有遺傳缺陷的敏感紅細(xì)胞，因G6PD的缺陷不能提供足夠的NADPH以維持還原型谷胱甘肽（GSH）的還原性（抗氧化作用），在遇到蠶豆中某種因子后更誘發(fā)了紅細(xì)胞膜被氧化，紅細(xì)胞膜上的磷脂分子中的不飽和脂肪酸氧化生成過(guò)氧化脂質(zhì)，損害細(xì)胞膜。G-6-PD有保護(hù)正常紅細(xì)胞免遭氧化破壞的作用，新鮮蠶豆是很強(qiáng)的氧化劑，當(dāng)G-6-PD缺乏時(shí)則紅細(xì)胞被破壞而致病。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶

與6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶

比值法實(shí)驗(yàn)名稱：6-磷酸葡萄糖6-磷酸葡萄糖脫氫酶NADP+NADPH++H+6-磷酸葡萄糖酸NADP+NADPH++H+6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶5-磷酸核酮糖……【原理】

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶催化葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖酸。紅細(xì)胞溶解的溶血素中存在6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶，可催化生成的6-磷酸葡萄糖酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為5-磷酸核糖，這兩步伴有NADP+還原為NADPH，通過(guò)NADP+還原為NADPH的速率與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性成比例。

由于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏雜合子的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的范圍較寬，用以上的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性定量測(cè)定方法來(lái)檢測(cè)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏雜合子，檢出率較低。6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶缺乏極其罕見(jiàn)，其濃度和活性一般較穩(wěn)定。因此在一般情況下，通過(guò)測(cè)定葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡糖糖酸脫氫酶活性來(lái)計(jì)算葡萄糖-6-磷酸脫氫酶/6-磷酸葡糖糖酸脫氫酶比值，可以提高對(duì)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏雜合子的檢出率。

【操作方法】（1）溶血素制備：紅細(xì)胞酶活性測(cè)定用的溶血素為比容紅細(xì)胞1體積溶于溶液19體積中。溶血素須新鮮配制，在4℃存放不宜超過(guò)8小時(shí)。（2）酶活性測(cè)定操作：本測(cè)定系統(tǒng)包括了主要測(cè)定葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性（測(cè)定1）；測(cè)定6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶活性（測(cè)定2）和測(cè)定葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的總活性（測(cè)定3）3個(gè)方面。在1ml的測(cè)定系統(tǒng)中，試劑的濃度及用量及檢測(cè)步驟：一對(duì)照管為基準(zhǔn)，37℃恒溫，340nm記錄各測(cè)定管得吸光度變化（A）10分鐘。如檢查系統(tǒng)＞1ml，各試劑的用量應(yīng)該按比例增加?！居?jì)算結(jié)果】

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性IU/(2.8×1010Ｈｂ)= 〔（A/2.8）×1010〕×115.8.

式中，A為測(cè)定的吸光度變化值；Hb為血紅蛋白濃度；115.8為根據(jù)本測(cè)定方法反應(yīng)體系的總量，溶血素所含紅細(xì)胞數(shù)量和NADPH的吸光系數(shù)，以每分鐘的吸光度變化酶活性計(jì)算公式換算出的系數(shù)

6-磷酸葡萄糖G-6-PD6-磷酸葡萄糖酸酯NADP+NADPH(還原型輔酶Ⅱ)谷胱甘肽還原酶2G-SH抗氧化活性5-磷酸核糖（多步反應(yīng)）從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果（氧化型）GS-SG（尿三膽）尿膽素（+）、尿膽紅素(－)、尿膽素原(+)肝腸循環(huán)增多膽紅素單核吞噬系統(tǒng)降解血紅素紅細(xì)胞破裂血紅蛋白滲出尿蛋白(++)(1.0g/l)運(yùn)氧功能障礙溶血性貧血循環(huán)血量減少血壓下降脈搏加快(心率加快)呼吸加快過(guò)多>34.2umol/L時(shí)，黃疸①血清總膽紅素↑②結(jié)合膽紅素變化不大（水溶性大，隨尿排出）③未結(jié)合膽紅素↑（水溶性小，不能隨尿排出，有毒）醬油尿

G-6-PD是紅細(xì)胞葡萄糖磷酸戊糖旁路代謝中所必須的脫氫酶，它使6-磷酸葡萄糖釋放H+，從而使輔酶Ⅱ（NADP）還原成還原型輔酶Ⅱ（NADPH）.NADPH是紅細(xì)胞抗氧化的重要物質(zhì)，它能使細(xì)胞內(nèi)的氧化型谷胱甘肽（GSSG）還原成還原型的谷胱甘肽（GSH）和維持過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性（如圖）。CAT是過(guò)氧化氫（H2O2）還原成H2O的還原酶。

GSH的重要作用是：①保護(hù)紅細(xì)胞內(nèi)含硫氰基（-SH）的血紅蛋白、酶蛋白和膜蛋白的完整性，避免H2O2對(duì)含-SH基物質(zhì)的氧化②與谷胱甘肽過(guò)氧化酶（GSHpx）共同使H2O2還原成H2O，G-6-PD缺乏時(shí)，NADPH生成不足，CAT和GSH減少，因此，當(dāng)機(jī)體受到氧化物侵害時(shí)作用產(chǎn)生的H2O2不能被及時(shí)還原成H2O，過(guò)多的H2O2作用于含-SH基的血紅蛋白、膜蛋白和酶蛋白，致血紅蛋白和膜蛋白均發(fā)生氧化損傷。血紅蛋白氧化成交鐵血紅蛋白和變形珠蛋白小體，紅細(xì)胞膜的過(guò)氧化損傷則致膜脂質(zhì)和膜蛋白硫基的氧化。上述作用最終造成紅細(xì)胞膜的氧化損傷和溶血。體型體型瘦小與該疾病是否有關(guān)，為什么