防治寄生蟲瘧原蟲的論文（共2篇）

防治寄生蟲瘧原蟲的論文〔共2篇〕第1篇：延緩寄生蟲惡性瘧原蟲產(chǎn)生的研究瘧疾〔Malaria)是全球性嚴(yán)重危害人類健康的主要流行癥之一，當(dāng)前全球有90多個國家和地區(qū)的20多億人寓居在瘧疾流行區(qū)。撒哈拉以南的非洲國家感染瘧疾疫情最重，瘧疾是非洲兒童死亡的最重要原因之一。東南亞的感染情況僅次于非洲，據(jù)衛(wèi)生組織2008年的報告，全球30%的瘧疾發(fā)病率和8%的死亡率集中在這里。固然2010年世界衛(wèi)生組織報告：瘧疾發(fā)病案例由2005年2.44億人次降到2009年2.25億人次；死亡人數(shù)由2000年98.5萬例降到2009年的78.1萬例，其中非洲地區(qū)死亡人數(shù)固然大幅下降，但是當(dāng)前瘧疾仍然是世界六大熱帶病和我們國家五大寄生蟲病之一，是威脅人類健康的重要疾病，給疫區(qū)帶來繁重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，阻礙社會的發(fā)展。由于惡性瘧發(fā)病兇險，愈后差，其病死率可高達(dá)50%，而且惡性瘧原蟲對多種抗瘧藥已存在耐藥性，因而惡性瘧已經(jīng)成為一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。自上60年代以來，全球范圍內(nèi)惡性瘧原蟲對重要抗瘧藥物氯喹產(chǎn)生了抗藥性，瘧原蟲的抗藥性由單一性向多藥抗性發(fā)展。惡性瘧原蟲抗藥株的不斷出現(xiàn)已成為重大的公共衛(wèi)生問題，給瘧疾防治工作帶來新的挑戰(zhàn)，瘧原蟲抗藥性研究迫在眉睫。鑒于全球惡性瘧原蟲對傳統(tǒng)的氯喹、乙胺嘧啶、甲氟喹等已產(chǎn)生耐藥，由于具有抗藥性瘧原蟲會很快遍及所有惡性瘧流行地區(qū)，抗藥強(qiáng)度會不斷增長，原蟲產(chǎn)生抗藥性的速度遠(yuǎn)比新藥研發(fā)的進(jìn)度快得多，從保衛(wèi)青蒿素及其衍生物的角度考慮，世界衛(wèi)生組織建議各國在青蒿素及其衍生物的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他藥物〔ACTs)來治療惡性瘧，以延緩瘧原蟲對青蒿素和其他藥物抗藥性的產(chǎn)生。1青蒿素類藥物抗藥性的現(xiàn)在狀況青蒿素及其衍生物是一類全新構(gòu)造的抗瘧藥，自其問世以來即以高效、速效、低毒的抗瘧活性得到世界公認(rèn)，對氯喹耐藥的惡性瘧仍然有效。如今多重抗藥的惡性瘧原蟲株已在東南亞和南美洲等地廣泛流行，固然瘧原蟲已對多種藥物產(chǎn)生了抗藥性，青蒿素類藥物仍能夠在幾天內(nèi)治愈跨越90%的瘧疾患者，當(dāng)前被全世界公以為是一種很有效的抗瘧新藥，但是當(dāng)前已有許多的研究提示青蒿素類藥物的敏感性正逐步下降，抗藥性的產(chǎn)生是難以避免的。世界衛(wèi)生組織曾經(jīng)警告說，假如失去了ACTs，人們將再也沒有一個治療瘧疾的辦法，或許至少要用十年的時間能力發(fā)現(xiàn)一種新的抗瘧藥。迄今為止，還沒有文獻(xiàn)報道惡性瘧原蟲對青蒿素類藥物出現(xiàn)普遍的耐藥性，但有報道稱用青蒿素類藥物治療病人時已經(jīng)出現(xiàn)了敏感性下降，寄生蟲去除時間出現(xiàn)延遲和幾周后再燃等情況。近期在柬埔寨西部的Pailin和泰國WangPha同時做了—項治療無并發(fā)癥的惡性瘧患者的研究，分為青蒿琥酯單藥組和青蒿琥酯聯(lián)用甲氟喹組兩組，單藥治療組青蒿琥酯的劑量為2mg/kg，d共7d，聯(lián)用組青蒿琥酯4mg/kg，d共3d，以后給甲氟喹25mg/kg，分兩次給藥。在柬埔寨的Pailin寄生蟲去除時間為84h，泰國WangPha，為48h，在過去幾十年的經(jīng)歷體驗表示清楚青蒿素類的藥物可在兩天時間內(nèi)迅速去除血液寄生蟲。排除了再次感染，在兩地單用青蒿琥酯治療組幾周內(nèi)分別有30%和10%的患者出現(xiàn)了癥狀復(fù)發(fā)的情況，而聯(lián)合治療組分別有10%和5%的病人再燃。Pailin和WangPha真正的失敗率可能分別高達(dá)20.0%和37.5%。2004年柬埔寨第1次報告用青蒿素治療惡性瘧出現(xiàn)耐藥以來，很多在泰國一緬甸邊疆上出現(xiàn)的“新感染瘧疾〞病例，實(shí)際上很可能是再燃。在緬甸南部還有另一項研究對青蒿琥酯治療無并發(fā)癥瘧疾患者，治療72h后進(jìn)行寄生蟲去除半衰期的分析，表示清楚72h后有26.9%仍可檢測出原蟲。這是第一次報告青蒿素耐藥性起源在緬甸境內(nèi)，這些研究提供的證據(jù)表示清楚在緬甸的惡性瘧原蟲很可能對青蒿素敏感性降低。在泰國邊疆，甲氟喹，青蒿琥酯在體內(nèi)的療效逐步下降，有研究報告用青蒿琥酯治療惡性瘧病人，治療第3d患者的外周血瘧原蟲陽性率2011年到達(dá)28%，而2000年同樣用青蒿琥酯治療病人，3d后患者外周血瘧原蟲陽性率為0%。惡性瘧原蟲于青蒿素類藥物治療3d后血液中仍然能夠觀察到較多寄生蟲，這就是“延遲瘧原蟲轉(zhuǎn)陰時間〞。還有研究表示清楚，經(jīng)過在泰國青蒿素治療后第2d、第3d可見瘧原蟲的比例約30%和15%，第28d有2%可見瘧原蟲。柬埔寨西部的Pailin，患者經(jīng)青蒿琥酯單藥治療或甲氟喹，青蒿琥酯治療2d后外周血涂片見寄生蟲的比例高達(dá)73%，治療3d后患者外周血涂片見到瘧原蟲的比例為55%。瘧原蟲去除時間延長在越南也有報道，但相關(guān)研究仍在繼續(xù)，有待于進(jìn)一步監(jiān)測及證明。惡性瘧原蟲對青蒿素類藥物出現(xiàn)敏感性降低的現(xiàn)象在亞洲比較突出，而在非洲則不同。在西非馬里共和國〔R6publiqueduMali)的研究指出，在這項青蒿素耐藥性的研究患者外周血中瘧原蟲轉(zhuǎn)陰時間的中位數(shù)為32h，遠(yuǎn)低于柬埔寨西部報告時間?？赡艿脑捎隈R里2004年以后才廣泛使用青蒿素類藥物，而柬埔寨使用這類藥物跨越30年，在馬里瘧疾病人得到青蒿素及衍生物治療的比例遠(yuǎn)低于柬埔寨西部，另外馬里大量惡性瘧疾病例重要為輸入性病例，病人不會自行用藥，這些因素可能使得馬里的瘧原蟲未對青蒿素類藥物長沙耐藥。2009年楊恒林等采取WHO推薦的體外微量法做了緬甸拉咱地區(qū)惡性瘧原蟲對青蒿琥酯等7種藥物體外半數(shù)抑制量〔ID5?！硿y定，發(fā)現(xiàn)緬甸拉咱地區(qū)惡性瘧原蟲對青蒿琥酯的ID5。為299.2nM/L比1993年作者在該地區(qū)做的IC50上升1.2倍，提示青蒿琥酯對惡性的敏感性呈下降趨勢。另一項研究用雙氫青蒿素脈喹片〔每片含雙氫青蒿素40mg，磷酸脈喹320mg)2d4次療法治療緬甸拉咱市惡性瘧原蟲感染陽性者91例，64例全程隨訪者中，尚有4例〔6.3%)于服藥后第3d外周血中瘧原蟲未轉(zhuǎn)陰，但因這4例病人腋溫小于37.5°C仍判為臨床治療有效，這4例患者服藥后隨訪外周血無性體原蟲轉(zhuǎn)陰時間為65.9h，比研究者在云南觀察的最長無性體原蟲轉(zhuǎn)陰時間〔63h)長，這可能與當(dāng)?shù)貝盒辕懺x對脈喹和青蒿素類敏感性下降有關(guān)，揣測當(dāng)?shù)夭糠謵盒辕懺x可能對雙氫青蒿素脈喹片敏感性下降。2青蒿素類藥物抗藥性可能的機(jī)理耐多種抗瘧藥的惡性瘧原蟲是全球瘧疾控制的—個重要障礙。固然青蒿素類藥物抗性關(guān)聯(lián)基因研究被人們進(jìn)行許多探尋求索，但是到如今為止仍然沒有明確的結(jié)論。惡性瘧原蟲耐抗瘧藥乙胺嘧啶、磺胺、氯陸與特定的汐外和一P/cri基因突變相關(guān)。然而，有相當(dāng)大的爭議為新興突變的耐青蒿素類抗瘧藥衍生藥物標(biāo)記。一些觀察表示清楚青蒿素抑制惡性瘧原蟲胞漿網(wǎng)織鈣依靠性ATP酶〔sarco/endoplasmiccalcium-dependentATPase6，P/AT-，有資料表示清楚，青蒿素類藥物能夠抑制在非洲爪蟾卵細(xì)胞內(nèi)表達(dá)P/a^6的酶活性，假如在該酶的第三跨膜區(qū)引入L263E這一突變，則解除了青蒿素類藥物對該酶的抑制。jamb〇u等，報道了位于沿巴西北部邊疆的圭亞那從惡性瘧患者體內(nèi)分離出的蟲株對蒿甲醚的IC5D值有所升高，通過測序，他們發(fā)現(xiàn)P一/a^6的第769位的絲氨酸突變?yōu)樘於０?，提示P一/a^6基因的突變可能會使瘧原蟲對青蒿素的敏感性降低。固然這種突變的意義還未確定，這些觀察可能表示清楚S769N突變可能是一個藥物抗性標(biāo)記。值得留意的是，大部分的P/a^6突變是具有地域局限的?，F(xiàn)仍需要進(jìn)一步的研究，找出能夠可靠預(yù)測的青蒿素耐藥性的分子標(biāo)記。當(dāng)前，對這個觀點(diǎn)持否認(rèn)態(tài)度的有所增長。2010年美國的一個學(xué)者提出，ACT(artemisi-nincombinationtherapy)療效的下降，和P/TOir1基因型有關(guān)。A/?dr1的基因拷貝數(shù)增長，不管在體內(nèi)還是體外實(shí)驗，都是甲氟喹和鹵泛群的抗性的重要決定因子[19]。在東南亞，十分是泰國和柬埔寨的一些地區(qū)，高水平的分離與f/mcr1拷貝數(shù)大于1(30%～40%)是由于MQ單藥治療多年，作為第一線治療無并發(fā)癥惡性瘧疾?？汞懠菜幬餅E用可能導(dǎo)致株擴(kuò)增A/^T1的患病率快速增長，由于所有瘧疾流行地區(qū)，瘧疾在非洲的傳輸水平是最高的。這種情況可能加速耐藥性的出現(xiàn)行為[24]。作為一個概念證明，研究者用7d的本芴醇濃度測量估計再感染成倍增長惡性瘧原蟲濃度，多藥耐藥基因(f/mr1)基因型與藥敏的結(jié)果。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，再次感染寄生蟲f/rnr1單體型的N86/184F/D1246種能夠蒙受本芴醇血藥濃度高于15倍那些與86Y/Y184/1246Y的單倍型。該方法可應(yīng)用于長半衰期抗瘧疾藥物，能及早發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲體內(nèi)的藥物敏感性降低，這代表一種新的抗瘧藥耐藥的分子標(biāo)記方式。到今天為止，上述觀點(diǎn)仍一直存在爭議，分子基礎(chǔ)耐藥機(jī)制仍不清楚。柬埔寨泰國邊疆上出現(xiàn)的青蒿素耐藥性的威脅已得到廣泛成認(rèn)，固然最終明確的惡性瘧原蟲感染，大多數(shù)仍然以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法治療，耐藥的惡性瘧原蟲去除時間需要3或4d，而青蒿素敏感的瘧原蟲蟲去除時間不到2d。防止青蒿素耐藥性的蔓延是瘧疾防治的重大課題。有報道指出，在柬埔寨西部青蒿琥酯治療惡性瘧疾的失敗率增長，也就是說青蒿素類藥物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)敏感性下降，其可能的機(jī)制是寄生蟲生長休眠情況。休眠恢復(fù)假說為寄生蟲在人體內(nèi)經(jīng)過藥物作用后進(jìn)入靜止?fàn)顩r或者休眠，等青蒿素類藥物的短的藥物藥效高峰期過了以后，才進(jìn)一步發(fā)育，這樣的一個發(fā)育滯后，怡怡保衛(wèi)他們免受藥物致死效果。近期有研究表示清楚，在雙氫青蒿素作用下惡性瘧原蟲很容易進(jìn)入休眠期。與其他藥物相比，較長半衰期的藥物則不容易進(jìn)入休眠期。法國和美國科學(xué)家亦發(fā)表了類似研究結(jié)果。休眠現(xiàn)象實(shí)際就是寄生蟲的一種自我保衛(wèi)現(xiàn)象。對于惡性瘧原蟲來說，其表現(xiàn)就是惡性瘧原蟲在人體內(nèi)的去除延遲。雖然去除延遲一直使原蟲復(fù)燃的風(fēng)險增高，但臨床瘧疾卻沒有具體表現(xiàn)出出治療失敗現(xiàn)象。假如確定休眠現(xiàn)象是青蒿素耐藥性真正的原因，我們在臨床治療時，就能夠根據(jù)此機(jī)制更靈敏的運(yùn)用并治療。休眠現(xiàn)象被以為更多的存在于短期療效的藥物中，此時我們的治療就能夠青蒿素短期療效結(jié)合長效藥，以這樣的聯(lián)合用藥為治療的主導(dǎo)地位。3結(jié)束語瘧疾在全球致死性寄生蟲病中位居第一位。青蒿素類藥物作為一種全新抗瘧藥，以其優(yōu)良的療效和低毒性而成為全世界最常用的抗瘧藥。世界已有多個地區(qū)報道惡性瘧原蟲對青蒿素類藥物的敏感性下降，寄生蟲在人體內(nèi)去除率時間延長。讓從事瘧疾防治的工作者真正認(rèn)識到惡性瘧原蟲對青蒿素產(chǎn)生抗藥性的危害，對延緩瘧原蟲對青蒿素類藥物耐藥產(chǎn)生意義重大。固然青蒿素耐藥性機(jī)制最近被多方研究探尋求索，如P/a^6基因突變、P一/ror1基因突變，以及研究最熱的寄生蟲休眠假說等等，但是到如今仍然沒有確定，有待進(jìn)一步的研究探尋求索，解開青蒿素耐藥之謎，延長青蒿素類藥物使用壽命和減緩耐藥性，使瘧疾的治療沒有后顧之憂。王穎娜1，張艷梅2，藺應(yīng)學(xué)3，楊照青1〔1.昆明醫(yī)科大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室，昆明650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院傳染科，昆明650500〕第2篇：影響惡性寄生蟲瘧原蟲紅內(nèi)期連續(xù)培養(yǎng)的因素體外培養(yǎng)瘧原蟲的工作始于本世紀(jì)初。最早從事這項工作的是Bass和Johns，1912年他們報道了在加有葡萄糖的全血內(nèi)觀察到惡性瘧原蟲能夠從環(huán)狀體發(fā)育到裂殖體。接著人們試圖建立瘧原蟲紅內(nèi)期的連續(xù)培養(yǎng)，但一直到60年后，這一努力才獲得成功。兩個獨(dú)立的研究組分別報道了惡性瘧原蟲在體外連續(xù)培養(yǎng)成功，其中十分是Trager和Jen?sen的方法對于人瘧的研究有著劃時代的意義，使各國科學(xué)工作者有時機(jī)從事臨床上最主要的瘧原蟲的研究工作，同時也為研究瘧疾的生物化學(xué)、寄生蟲學(xué)、和化學(xué)治療奠定了基礎(chǔ)。固然在60年代已能進(jìn)行鳥瘧的紅外期的連續(xù)培養(yǎng)，但晡乳動物紅外期培養(yǎng)一直到1981年才獲得成功〕對伯氏瘧方面的這些研究當(dāng)前也已應(yīng)用于人類間日瘧原蟲的紅外期培養(yǎng)，瘧原蟲孢子增殖各期均能在體外發(fā)育，成熟的有感染性的配子體可以從體外培養(yǎng)得到。但完好的連續(xù)的孢子增殖階段的體外培養(yǎng)至今尚未成功，紅內(nèi)期無性體的體外培養(yǎng)。一、體外培養(yǎng)瘧原蟲紅內(nèi)期的研究在1976年前僅限于人和一些動物瘧原蟲的短期保存，尚不能連續(xù)培養(yǎng)。早期的探尋求索固然應(yīng)用的原則如稀釋和連續(xù)流灌等方法和以后成功的方法類似，伹有許多不同。Trager和Jensen以為下述條件為惡性瘧原蟲培養(yǎng)成功所必須，一個人紅細(xì)胞薄層(例如，10%紅細(xì)胞懸浮液1ml置于3.3mm?面積內(nèi)所構(gòu)成的薄層〕，一層3mm厚的RP-MI-1640培養(yǎng)液〔每升培養(yǎng)液內(nèi)含100mJ與紅細(xì)胞相應(yīng)的血清〕，2～5%，和5～10%的混合氣體，間斷或緩慢連續(xù)地更新培養(yǎng)液及隨瘧原蟲率的增長補(bǔ)充新鮮正常紅細(xì)胞。這些條件能夠由很多途徑來獲得，最簡單的是用Petri培養(yǎng)皿在蠟燭缸內(nèi)培養(yǎng)。但使用這一方法天天至少要人工換液1次，原蟲率跨越5%時以至需要屢次。Osisanya等指出假如培養(yǎng)液內(nèi)葡萄糖濃度增長1倍，混合氣體比例為5%CO，和5%0，，使用TES緩沖液，則換液次數(shù)能夠減少?Trager的連續(xù)流灌培養(yǎng)法能夠獲得連續(xù)的較穩(wěn)定的原蟲率。這種方法使培養(yǎng)液在固定的紅細(xì)胞薄層上流動，培養(yǎng)液儲存瓶一周換一次即可。當(dāng)前已進(jìn)一步改良設(shè)計出一些復(fù)雜水平不等的半自動設(shè)備，這些培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)PH值能夠恒定，并能夠自動去除廢物及提供新鮮培養(yǎng)液。懸浮培養(yǎng)法連續(xù)培養(yǎng)能夠提升原蟲率，相應(yīng)減少勞力。Butcher和Zoly等聲稱用懸浮培養(yǎng)法獲得的最終原蟲率比靜止法髙。他們以為這是由于懸浮法培養(yǎng)時紅細(xì)胞反復(fù)感染減少及原蟲感染的紅細(xì)胞的微環(huán)境內(nèi)乳酸濃度下降的結(jié)果。然而Jensen和Endens卻以為這兩種方法效杲差不多。二、影響惡性瘧原蟲紅內(nèi)期連續(xù)培養(yǎng)的因素培養(yǎng)液Trager和Jensen在一開始連續(xù)培養(yǎng)惡性瘧原蟲時就使用了RPMI1640培養(yǎng)液。這種培養(yǎng)液原來是用于培養(yǎng)人白細(xì)胞的。培養(yǎng)液內(nèi)參加了25mM/LHEPES增長了溶液的緩沖能力^Haynes和Chen等人則使用添加補(bǔ)充成份的199培養(yǎng)液。Divo和Jen-sen對RPMI1640，Ham氏營養(yǎng)混合液F-12和含有Eagle或Hanks鹽溶液的199培養(yǎng)液進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)對于培養(yǎng)惡性瘧原蟲來說RPMI164比兩種199培養(yǎng)液好，與Ham氏F-12液的效果相等。瘧原蟲體外培養(yǎng)時PH值堅持在7.3~7.5間很主要。惡性瘧原蟲培養(yǎng)的成功需要有一恒定的pH環(huán)境，這一pH值是瘧原蟲代謝產(chǎn)生大量乳酸所引起的整個和部分PH改變的總和。兩個成功培養(yǎng)例子中，采取的瘧原蟲密度都較低，只要起初不成功的1/4-1/2，這就明顯減少了培養(yǎng)時的乳酸鹽產(chǎn)品。除此之外，使用了一種兩性離子緩沖液HEPES，能夠?qū)O，/NaHCO，緩沖系起輔助作用。HEPES和TES都是良好的緩沖劑，由于在37°C時它們的Pk，分別為7.31和7.50，與瘧原蟲生長的最適PH特別接近。兩性離子緩沖劑還有一個優(yōu)點(diǎn)，即在瘧原蟲生長需要較高，濃度環(huán)境下能夠堅持培養(yǎng)物的PH值穩(wěn)定。三、氣體相氣體相的構(gòu)成對于瘧原蟲的發(fā)育也是一個關(guān)鍵。2-5匁CO，濃度對連續(xù)培養(yǎng)中瘧原蟲生長無顯著影響，但濃度過髙對培養(yǎng)有抑制造用。這可能是直接影響了正常PH范圍的維持，由于RPMI1640培養(yǎng)液內(nèi)有一組CO，/NaHCO，緩沖系。其他哺乳動物瘧原蟲在代謝經(jīng)過中有結(jié)合，現(xiàn)象，所以惡性瘧原蟲可以能利用CO，進(jìn)行代謝。5～10%，濃度合適于瘧原蟲連續(xù)培養(yǎng)，但高濃度的氧〔相當(dāng)于空氣中的氧濃度〉卻有抑制造用，固然這種作用有時需要幾天后能力觀察到。氧對于瘧原蟲代謝的作用還不清楚，似乎低氧張力有利于培養(yǎng)經(jīng)過中低氧化復(fù)原勢的維持。各種維持低氧化復(fù)原勢劑對于短期培養(yǎng)的作用是很不一樣的。然而有趣的是Haynes和他的助手所用的改進(jìn)的199培養(yǎng)液中卻含有2種復(fù)原劑2-巰基乙醇和維生素E。但瘧原蟲在完全無氧環(huán)境中連續(xù)培養(yǎng)沒有成功過。為了使PH值相對恒定及堅持低氧化復(fù)原勢，培養(yǎng)皿內(nèi)氣相與液相間需要有足夠的交換。所以氣體在培養(yǎng)液內(nèi)的溶解度，培養(yǎng)液的深度，紅細(xì)胞的濃度(也即細(xì)胞層的厚度〉和氣體溶解度對于保證充足交換是至關(guān)主要的。惡性瘧原蟲培養(yǎng)的成功與這些互為相關(guān)的因素所起的作用分不開。在髙原地區(qū)藥物敏感性的微量測試所以失敗，可能與以上這些因素有關(guān)。四、血清成功的惡性瘧原蟲紅內(nèi)期連續(xù)培養(yǎng)使用了含150mI/LAB型人血清的完全培養(yǎng)液。所以選用這一型血清是由于它不與猴紅細(xì)胞發(fā)生凝集。其實(shí)只要與培養(yǎng)所用的紅細(xì)胞相適應(yīng)其他任何型血清都能夠應(yīng)用。15〇ml/LAB型血清對于建立新分離株的培養(yǎng)是很需要的，但在維持已建立的培養(yǎng)時這一濃度并不是不可變的。Jensen發(fā)現(xiàn)人血清支持瘧原蟲生長的能力不一，有些情況下只端要50ml/L濃度或更低。近期Divo和Jensen指出假如將20個或20個以上志愿者的血清采集在起，那么50mI/L的血清就足以獲得最佳的原蟲生長率。含25moL混合血清的培養(yǎng)液可以應(yīng)用于連續(xù)培養(yǎng)，但獲得的生長率只要最佳率的50%左右。從當(dāng)?shù)匮獛旎蛐迈r采集來的血淸都應(yīng)該儲存于-20°C或凍干，但反復(fù)凍融的血清晦氣于培養(yǎng)。Druilhe等以為臍帶是培養(yǎng)瘧原蟲血清的最好來源，Jensen也證明了這一點(diǎn)，但獲得這種血清需與當(dāng)?shù)蒯t(yī)院產(chǎn)科部門親密合作，使用人血清固然能夠使連續(xù)培養(yǎng)的惡性瘧原蟲生長到達(dá)最佳狀況，但這種對人血清的依靠也有很多缺點(diǎn)，首祖先血清代價較大，獲得不易，而且在瘧疾流行區(qū)得到的血清往往含有某些免疫抑制因子，除此之外雖然不是特別主要，需提及的是接觸血清有感染肝炎病毒和其他病原的危險。因而尋求人血清的替代品顯得特別主要。最初企圖用現(xiàn)有的商品動物血清替代人血淸，但沒有成功。然而Ifediba和Vander-berg：卻報道了能夠用商品小牛血清加100ml/L再生蛋白胨或豚胨150g/L代替人血清。但瘧原蟲對這一新環(huán)境需要有9個月的適應(yīng)經(jīng)過。用參加小羊和豬血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)瘧原蟲時僅觀察到少數(shù)幾代增殖，不能連續(xù)培養(yǎng)。而經(jīng)熱滅活的馬、小牛和新西蘭白兔血清能夠維持連續(xù)培養(yǎng)。Butcher曾報道一株實(shí)驗室惡性瘧原蟲經(jīng)過一段適應(yīng)經(jīng)過在用100ml/L馬血清的EPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)了4個月。Sax和Rieckmann也以為在使用50m]/L庫存兔血清連續(xù)培養(yǎng)時需要有一適應(yīng)經(jīng)過；但用庫存的小牛血清加次黃嘌呤建立蘇丹惡性瘧原蟲分離連累續(xù)培養(yǎng)前毋需適應(yīng)經(jīng)過，近期報道越南Smith和馬來亞Camp惡性瘧原蟲株能夠在無血清的培養(yǎng)液內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)4周。用含有脂肪酸〔即順-十八烯酸、油酸和亞油酸〕和無脂肪酸小牛血清白蛋白培養(yǎng)液培養(yǎng)瘧原蟲，固然生長率較用血清的為低，但可連續(xù)傳代用含有其他脂肪酸包栝硬脂酸培養(yǎng)液培養(yǎng)瘧原蟲能否會產(chǎn)生同樣結(jié)果，有待進(jìn)一步觀察。五、釭細(xì)胞ABO型紅細(xì)胞皆適于連續(xù)培養(yǎng)惡性瘧原蟲，但在研究紅細(xì)胞外表裂殖子受體時發(fā)現(xiàn)與血紅蛋白型有關(guān)的各種因子、各種基本的酶及膜的一些特征在連續(xù)培養(yǎng)經(jīng)過中對裂殖子的粘附和瘧原蟲的存活起著決定性作用。因而，能夠揣測只要用無Rh蛋白的，不屬于Kell、Jk、Tn、Ge和S-s血型的紅細(xì)胞培養(yǎng)惡性瘧原蟲都可獲得一樣的生長率。相反，缺乏較多的紅細(xì)胞唾液酸糖蛋白、血型糖蛋白的紅細(xì)胞，例En陰性紅細(xì)胞就不能應(yīng)用于培養(yǎng)，由于用這種紅細(xì)胞短期培養(yǎng)時惡性瘧原蟲再侵入率減少。近期還觀察到惡性瘧原蟲連續(xù)培養(yǎng)多代后能夠適應(yīng)于缺乏6-磷酸葡萄糖脫氫酶的紅細(xì)胞。早期的研究表示清楚用于惡性瘧原蟲連續(xù)培養(yǎng)的紅細(xì)胞應(yīng)置于4°C冰箱內(nèi)，儲存于檸橡酸葡萄糖(ACD)和檸橡酸磷酸葡萄糖(CPD)中，并以為用這種方法儲存4周的紅細(xì)胞比新鮮紅細(xì)胞更有利于原蟲生長。如今看來情況并非如此，只要紅細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP的水平在正常范圍內(nèi)，新鮮紅細(xì)胞與儲存紅細(xì)胞同樣適于連續(xù)培養(yǎng)。近期還發(fā)現(xiàn)無免疫供血者的白細(xì)胞不影響瘧原蟲體外發(fā)育，因而，能夠不必去除它們。有些去除白細(xì)胞的方法，例如WhatmanCF-11纖維素柱的應(yīng)用可能反而對培養(yǎng)晦氣。六、瘧原蟲分離株自1976年以來，世界上不同地區(qū)的很多分離株已在實(shí)驗室內(nèi)建立。固然大部分分離株的培養(yǎng)是成功的，但并不是所有株都容易適應(yīng)于體外生長。有些地區(qū)的原蟲株建立培養(yǎng)相當(dāng)困難。Trager以為這并不是由于瘧原蟲的遺傳特性不同而可能是技術(shù)不外關(guān)造成的。建立培養(yǎng)能夠用新鮮感染血，可以以用4℃儲存一段時間的含蟲血或用-70°C甘油低溫保存的除去保衛(wèi)液的含蟲血來進(jìn)行，一般來說從已建立培養(yǎng)的瘧原蟲來進(jìn)行再培養(yǎng)較直接培養(yǎng)現(xiàn)場分離株要容易些。瘧原蟲分離與建立培養(yǎng)之間的時間，含蟲血的原蟲率，運(yùn)輸?shù)姆绞郊皸l件和低溫保存及復(fù)蘇的方法和操作，這些因素對建立培養(yǎng)均有影響。不管如何，直接自病人血取原蟲建立培養(yǎng)，都需時4~6周，這一適應(yīng)時間與真核組織細(xì)胞的培養(yǎng)類似。惡性瘧原蟲紅內(nèi)期無性體體外連續(xù)培養(yǎng)后形態(tài)堅持正常。在培養(yǎng)時可見到各發(fā)育階段的原蟲，這是由于瘧原蟲失去了體內(nèi)同步發(fā)育的特征。這對某一特定階段的免疫學(xué)和生物化學(xué)研究帶來一些困難。然而能夠用生理膠、明膠或聚蔗糖等簡單方法采集成熟的紅內(nèi)期原蟲，用50g/L山梨醇溶液洗滌感染紅細(xì)胞可獲得環(huán)狀體。山梨醇能溶解含成熟原蟲的紅細(xì)胞，但對環(huán)狀體感染的紅細(xì)胞無作用。用上述方法分離獲得的原蟲，繼續(xù)培養(yǎng)時至少能堅持2~3代的同步發(fā)育，但以后又變得不同步了。所以當(dāng)前有需要研究長期維持同步的方法。沒有跡象表示清楚體外長期培養(yǎng)后瘧原蟲會喪失感染性，瘧原蟲在幾個培養(yǎng)系內(nèi)體外培養(yǎng)3年后仍可感染夜裝。除此之外也瞥報道惡性瘧原蟲FCR-3株培養(yǎng)大約4年后偶爾感染了人。然而有證據(jù)表示清楚在培養(yǎng)期間原始分離株的一些特征可能發(fā)生改變。除此之外，某些分離株需一定時間適應(yīng)體外培養(yǎng)的事實(shí)表示清楚，可能是經(jīng)歷一個選擇經(jīng)過。這并不奇怪，由于其他真核細(xì)胞在體外培養(yǎng)時也有類似情況發(fā)生。例如FCK^3株剛分離時和體外培養(yǎng)年后對氣喹是敏感的，然而經(jīng)4年培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)該分離株雖沒有處于氣喹的壓力，但經(jīng)體內(nèi)外證明，卻對氣喹產(chǎn)生了抗性，然而其機(jī)理是在培養(yǎng)經(jīng)過中發(fā)生了抗性突變，或者存在于原始株的抗氯喹克隆由于體外生長的生物學(xué)優(yōu)勢，隨時間的推移而迅速增加的緣故，當(dāng)前還不清楚。在連續(xù)培養(yǎng)條件下，發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲可出現(xiàn)形態(tài)變化。Langretli等首先報道了這一情況，他們觀察到惡性瘧原蟲用蠟燭缸法培養(yǎng)18個月后發(fā)生了變異，這種變異瘧原蟲寄生的紅細(xì)胞膜外表不再出現(xiàn)結(jié)節(jié)。Motyl和Reece還發(fā)如今培養(yǎng)時不引起結(jié)節(jié)(K一)的變異瘧原蟲比引起結(jié)節(jié)(K+)的瘧原蟲蟲率髙，與同位素標(biāo)記的異亮氨酸結(jié)合較快，多重感染細(xì)胞的百分率也較髙。這樣看來瘧原蟲具有體外生長的生物學(xué)優(yōu)勢。但每4周用一種能濃集有結(jié)節(jié)紅細(xì)胞(K+細(xì)胞〉的明膠技術(shù)配合山梨醇的溶解，就幾乎能完全堅持細(xì)胞上有結(jié)節(jié)的K+原蟲系。惡性瘧原蟲在生物學(xué)特性方面的異質(zhì)性問越，最早是Carter和voller提出的。他們發(fā)現(xiàn)非洲和東南亞病人的陽性血內(nèi)有一些變異酶。很明顯，認(rèn)識這種異質(zhì)性在流行病學(xué)上很主要，對近來體外研究瘧原蟲克隆化也很有幫助。惡性瘧原蟲的克隆能夠用有眼稀釋技術(shù)獲得，這一點(diǎn)已由顯微鏡觀察稀釋的培養(yǎng)物微滴和近期的微量操作技術(shù)所證明。用Oduok方法在1小時內(nèi)能夠分離單個感染細(xì)胞5·10次。這種方法經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)建立克隆的成功率為30?50%，由單個感染細(xì)胞建立的克隆大約在培養(yǎng)21天內(nèi)可從吉氏液染色的血片上發(fā)現(xiàn)原蟲，Thaithong應(yīng)用這一方法證明了一個抗氣喹、乙胺嘧啶和周效磺胺-乙胺嘧啶合劑的惡性瘧原蟲T·分離株。七、藥物抗性和群體內(nèi)傳播機(jī)制的遺傳學(xué)研究藥物抗性問題是瘧疾控制的重要障礙，但關(guān)于抗性出現(xiàn)及其在人群中傳播的機(jī)制當(dāng)前還不清楚?？赡苡泻芏鄼C(jī)制包含瘧原蟲對藥物的非遺傳性適應(yīng)或在藥物作用下遺傳性的改變等等。當(dāng)前遺傳學(xué)方面的研究重要用鼠瘧為模型在體內(nèi)進(jìn)行。體外培養(yǎng)技術(shù)和具有多種抗藥性的惡性瘧原蟲克隆的研究表示清楚來源于不同國家的瘧原蟲遺傳學(xué)上是類似的，這可能是存在著一種世界范圍內(nèi)的種間雜交群。用培養(yǎng)的方法還證明抗氣喹株瘧原蟲比敏感株具有生物學(xué)優(yōu)勢，抗性分離株包括著藥敏水平不同的很多克隆，當(dāng)然也包含了敏感克隆。至于藥物敏感株中能否含有抗性克隆，尚有待于進(jìn)一步證明。當(dāng)前，培養(yǎng)技術(shù)和重組DNA分析及基因克隆正被應(yīng)用于藥物抗性遺傳學(xué)基礎(chǔ)的研究。除此之外，由于紅內(nèi)期和紅外期體外培養(yǎng)的成功，能夠得到對蚊蟲有感染性的瘧原蟲，這樣就有可能開展一些典型的