最新基因工程065課件

基因工程065基因工程0651

重組DNA技術(shù)DNARecombinationTechnique

重組DNA技術(shù)DNARecombinationTech2最新基因工程065課件3最新基因工程065課件4最新基因工程065課件5最新基因工程065課件6最新基因工程065課件7最新基因工程065課件8（二）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶Ⅰ逆轉(zhuǎn)錄酶T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶（二）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶9重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無(wú)53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功10限制性核酸內(nèi)切酶定義限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性核酸內(nèi)切酶定義GGATCCGGATCC+BamHⅠ11作用與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）作用分類12第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；命名HindⅢ13Ⅱ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGⅡ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——回文結(jié)構(gòu)(palindrome)14BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC15同功異源酶來(lái)源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功異源酶GGATCCGGATCC+BamHⅠGGATCC16同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA同尾酶BamHⅠBglⅡGGATCCAGATCTG17（三）目的基因

cDNA(complementaryDNA)基因組DNA(genomicDNA)（三）目的基因cDNA(complementaryDN18（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA（四）基因載體定義常用載體19克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體?？寺≥d體(cloningvector)20載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；211.質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn)能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。1.質(zhì)粒(plasmid)特點(diǎn)22目錄目錄23最新基因工程065課件24λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克隆）2.噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)2.噬菌體(phage)M13噬253.粘性質(zhì)粒(cosmid)3.粘性質(zhì)粒(cosmid)26酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)動(dòng)物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他酵母人工染色體其他27二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受28以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過(guò)程目錄以目錄29（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)

（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法30*化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列*化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序31組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫(kù)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*從基因組DNA文庫(kù)獲取目的基因目錄組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分32限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫(kù)目錄限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcosc33mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫(kù)反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制*從cDNA文庫(kù)獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目錄mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子34

體內(nèi)DNA的復(fù)制DNA聚合酶dNTP解旋酶類引物復(fù)習(xí)5’3’體內(nèi)DNA的復(fù)制DNA聚合酶dNTP解旋酶類35PCR擴(kuò)增原理引物5’5’3’3’PCR擴(kuò)增原理引物5’5’3’3’36（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接（二）克隆載體的37BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接目錄BamHⅠ切割反應(yīng)GGATCCT4DNA連接酶GATC38不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。目錄不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)Bg392.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端2.平端連接40目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶重組體413.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。3.同聚物加尾連接425′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目錄5′3′載體DNA5′3′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶434.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

4.人工接頭(linker)連接44人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG5′-EcoRⅠEco45受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌受體菌條件導(dǎo)入方式（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌46（五）重組體的篩選

1.直接選擇法(1)

抗藥性標(biāo)記選擇(2)標(biāo)志補(bǔ)救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡2.免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等（五）重組體的篩選47(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇目錄(插入失活法)目錄48組氨酸缺陷型大腸桿菌無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進(jìn)組氨酸合成λDNA重組體標(biāo)志補(bǔ)救目錄組氨酸缺陷無(wú)組氨酸酵母咪唑甘油磷促進(jìn)組氨酸合成λDNA重組體49α互補(bǔ)目錄α互補(bǔ)目錄50α互補(bǔ)的檢測(cè)目錄α互補(bǔ)的檢測(cè)目錄51原位雜交目錄原位雜交目錄52Southern印跡目錄Southern印跡目錄53雞的β肌球蛋白的克隆和檢出目錄雞的β肌球蛋白的克隆和檢出目錄54重組DNA技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體重組DNA技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基55重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目錄重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源56表達(dá)體系的建立表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達(dá)表達(dá)體系的建立（六）克隆基因的表達(dá)571.原核表達(dá)體系（E.coli表達(dá)體系最為常用）標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志 強(qiáng)啟動(dòng)子翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點(diǎn)E.coli表達(dá)體系的不足

不宜表達(dá)真核基因組DNA不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusionbody)

很難表達(dá)大量可溶性蛋白1.原核表達(dá)體系（E.coli表達(dá)體系最為常用）58大鼠胰島素原cDNA的表達(dá)和分泌 目錄大鼠胰島素原cDNA目錄59最新基因工程065課件60優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)染

——將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染顯微注射

2.真核表達(dá)體系

酵母、昆蟲、乳類動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA轉(zhuǎn)染——將表61表達(dá)載體pFASTBACI的物理圖譜目錄表達(dá)載體pFASTBACI的物理圖譜目錄62目錄目錄63（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認(rèn)識(shí)疾病的分子機(jī)制。三、重組技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系（二）生物制藥（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆三、重組技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系（二）生物64重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成生長(zhǎng)因子(bFGF,EGF)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)與分化生長(zhǎng)素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預(yù)防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂目錄重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激65基因診斷(geneticdiagnosis)是利用分子生物學(xué)及分子遺傳的技術(shù)和原理，在DNA水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。（三）基因診斷基本過(guò)程區(qū)分或鑒定DNA的異常分離、擴(kuò)增待測(cè)的DNA片斷基因診斷(geneticdiagnosis)是利用分子生物66標(biāo)準(zhǔn).能正確擴(kuò)增靶基因；.能準(zhǔn)確區(qū)分單個(gè)堿基的差別；.本底或噪聲低，不干擾DNA的鑒定;.便于完全自動(dòng)化操作，適合大面積、大人群普查。標(biāo)準(zhǔn)67（四）基因治療定義基因治療(genetherapy)是向有功能缺陷的細(xì)胞補(bǔ)充相應(yīng)功能的基因，以糾正或補(bǔ)償其基因的缺陷，從而達(dá)到治療的目的。方式體細(xì)胞基因治療(somaticcellgenetherapy)性細(xì)胞基因治療(germlinegenetherapy)（四）基因治療定義方式681.產(chǎn)前診斷2.攜帶者測(cè)試3.癥候前診斷4.遺傳病易感性（五）遺傳疾病的預(yù)防1.產(chǎn)前診斷（五）遺傳疾病的預(yù)防69

結(jié)束語(yǔ)謝謝大家聆聽?。。?0

結(jié)束語(yǔ)謝謝大家聆聽?。?！70基因工程065基因工程06571

重組DNA技術(shù)DNARecombinationTechnique

重組DNA技術(shù)DNARecombinationTech72最新基因工程065課件73最新基因工程065課件74最新基因工程065課件75最新基因工程065課件76最新基因工程065課件77最新基因工程065課件78（二）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶Ⅰ逆轉(zhuǎn)錄酶T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶（二）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶79重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無(wú)53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功80限制性核酸內(nèi)切酶定義限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性核酸內(nèi)切酶定義GGATCCGGATCC+BamHⅠ81作用與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）作用分類82第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；命名HindⅢ83Ⅱ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGⅡ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——回文結(jié)構(gòu)(palindrome)84BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC85同功異源酶來(lái)源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功異源酶GGATCCGGATCC+BamHⅠGGATCC86同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA同尾酶BamHⅠBglⅡGGATCCAGATCTG87（三）目的基因

cDNA(complementaryDNA)基因組DNA(genomicDNA)（三）目的基因cDNA(complementaryDN88（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA（四）基因載體定義常用載體89克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。克隆載體(cloningvector)90載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；911.質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn)能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。1.質(zhì)粒(plasmid)特點(diǎn)92目錄目錄93最新基因工程065課件94λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克?。?.噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)2.噬菌體(phage)M13噬953.粘性質(zhì)粒(cosmid)3.粘性質(zhì)粒(cosmid)96酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)動(dòng)物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他酵母人工染色體其他97二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受98以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過(guò)程目錄以目錄99（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)

（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法100*化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列*化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序101組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫(kù)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*從基因組DNA文庫(kù)獲取目的基因目錄組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分102限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫(kù)目錄限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcosc103mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫(kù)反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制*從cDNA文庫(kù)獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目錄mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子104

體內(nèi)DNA的復(fù)制DNA聚合酶dNTP解旋酶類引物復(fù)習(xí)5’3’體內(nèi)DNA的復(fù)制DNA聚合酶dNTP解旋酶類105PCR擴(kuò)增原理引物5’5’3’3’PCR擴(kuò)增原理引物5’5’3’3’106（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接（二）克隆載體的107BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接目錄BamHⅠ切割反應(yīng)GGATCCT4DNA連接酶GATC108不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。目錄不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)Bg1092.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端2.平端連接110目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶重組體1113.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。3.同聚物加尾連接1125′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目錄5′3′載體DNA5′3′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶1134.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

4.人工接頭(linker)連接114人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG5′-EcoRⅠEco115受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌受體菌條件導(dǎo)入方式（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌116（五）重組體的篩選

1.直接選擇法(1)

抗藥性標(biāo)記選擇(2)標(biāo)志補(bǔ)救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡2.免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等（五）重組體的篩選117(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇目錄(插入失活法)目錄118組氨酸缺陷型大腸桿菌無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進(jìn)組氨酸合成λDNA重組體標(biāo)志補(bǔ)救目錄組氨酸缺陷無(wú)組氨酸酵母咪唑甘油磷促進(jìn)組氨酸合成λDNA重組體119α互補(bǔ)目錄α互補(bǔ)目錄120α互補(bǔ)的檢測(cè)目錄α互補(bǔ)的檢測(cè)目錄121原位雜交目錄原位雜交目錄122Southern印跡目錄Southern印跡目錄123雞的β肌球蛋白的克隆和檢出目錄雞的β肌球蛋白的克隆和檢出目錄124重組DNA技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體重組DNA技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基125重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目錄重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源126表達(dá)體系的建立表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達(dá)