制備外植體與接種課件

植物的組織培養(yǎng)第二節(jié)胡蘿卜的組織培養(yǎng)植物的組織培養(yǎng)預(yù)備任務(wù)1人/1個無菌操作臺。每組取如下工具放于203室無菌操作臺上先行滅菌培養(yǎng)皿、鑷子、無菌水和培養(yǎng)基；帶1個500mL的燒杯，作廢液缸；1個250mL的燒杯裝工業(yè)酒精150mL；帶1個100mL的燒杯。注意放置物品時，先關(guān)滅紫外燈，放好后，關(guān)上門，再開啟紫外燈；

預(yù)備任務(wù)1人/1個無菌操作臺。一、組織培養(yǎng)基本原理

全能性

植物體的每一個完整的細(xì)胞都擁有形成完整植株的全部遺傳信息，在一定的條件下都具有產(chǎn)生一株完整個體的潛在能力。去分化去除外植體原有的分化性狀，重新進(jìn)入新的發(fā)育分化狀態(tài)。一、組織培養(yǎng)基本原理

全能性組織培養(yǎng)的特點：取材少，培養(yǎng)材料經(jīng)濟；人為控制培養(yǎng)條件，不受自然條件影響；生長周期短，繁殖率高；管理方便，利于自動化控制。組織培養(yǎng)應(yīng)用：在理論上是研究細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、育種學(xué)、生物化學(xué)和藥物學(xué)等學(xué)科的重要手段；在生產(chǎn)上在農(nóng)學(xué)、園藝、林業(yè)和次生代謝產(chǎn)物工程等生產(chǎn)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。組織培養(yǎng)的特點：取材少，培養(yǎng)材料經(jīng)濟；人為控制培養(yǎng)條件，不受二、組織培養(yǎng)的方法和步驟

選擇原則：根據(jù)培養(yǎng)目的、易于誘導(dǎo)、帶菌少。

生理狀態(tài)：幼嫩的組織

取材季節(jié)：易成活，生長旺盛季節(jié)，內(nèi)源激素含量高，易分化

植物的長勢：生長健壯的組織

外植體大?。簯?yīng)根據(jù)培養(yǎng)目的而定胚胎培養(yǎng)或脫除病毒，則外植體宜小；快速繁殖，外植體宜大。一般外植體大小在0.5～1.0

cm為宜。1、培養(yǎng)材料的采集二、組織培養(yǎng)的方法和步驟

選擇原則：1、培養(yǎng)材料的采集2、外植體的表面消毒處理外植體的表面清洗：洗衣粉清洗，吐溫。外植體表面滅菌（一般采用2次滅菌法）先用70%酒精浸10～30s；轉(zhuǎn)到其它消毒溶液，滅菌液要充分浸沒材料。無菌水涮洗涮洗要每次3min左右，視采用的消毒液種類，涮洗3-l0次左右。2、外植體的表面消毒處理外植體的表面清洗：洗衣粉清洗，吐溫。滅菌劑使用濃度（%）去除難易滅菌時間滅菌效果酒精70-75易0.1-3好氯化汞0.1-0.2較難2-10最好漂白粉飽和溶液易5-30很好次氯酸鈣9-10易5-30很好次氯酸鈉2（活性氯）易5-30很好過氧化氫10-12最易5-15好抗菌素4-50mg/L中30-60較好滅菌劑使用濃度去除難易滅菌時間滅菌效果酒精70-75易0.13、制備外植體與接種將已消毒的材料，用無菌刀、剪、鑷子等，在無菌的環(huán)境下，剝?nèi)パ康镊[片、嫩枝的外皮和種皮胚乳等，葉片則不需剝皮。在操作中嚴(yán)禁用手接觸材料。在無菌壞境下，將切好的外植體立即接在培養(yǎng)基上，每瓶接種2~4個，防止交叉污染。接種后，瓶、管用無菌藥棉或蓋封口，培養(yǎng)皿用無菌膠帶封口。

3、制備外植體與接種將已消毒的材料，用無菌刀、剪、鑷子等，在三、無菌操作步驟接種3天前用甲醛熏蒸接種室，并于接種前3小時打開紫外線燈進(jìn)行殺菌；接種前20分鐘，打開超凈工作臺的風(fēng)機以及臺上的紫外燈；接種員洗凈雙手，在緩沖間換好專用實驗服，換穿拖鞋等；上工作臺后，用酒精棉球搽拭雙手（特別是指甲處）和工作臺面；用酒精棉球搽拭接種工具，再將鑷子和剪刀從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端處，對培養(yǎng)皿要過火烤干；接種時，接種員雙手不能離開工作臺，不能說話、走動和咳嗽等；接種完畢后要清理干凈工作臺，可用紫外線燈滅菌30分鐘，若連續(xù)接種，每5天要大強度滅菌一次。三、無菌操作步驟接種3天前用甲醛熏蒸接種室，并于接種前3小時四、本實驗—胡蘿卜的接種培養(yǎng)把胡蘿卜切成約40mm的段；去除表皮，去除木質(zhì)部和髓；切成約40×20×10mm的條狀，共切4塊。1、胡蘿卜的切塊處理皮層韌皮部形成層木質(zhì)部四、本實驗—胡蘿卜的接種培養(yǎng)把胡蘿卜切成約40mm的段；1、胡蘿卜：把切好的材料，放在100mL的燒杯里，加入75％酒精（現(xiàn)配100mL），浸泡30秒；然后將外植體轉(zhuǎn)入2％次氯酸鈉中（100mL燒杯裝約70mL次氯酸鈉），浸泡25－30分鐘；取出材料，放入培養(yǎng)皿，用無菌水洗4－5分鐘，重復(fù)3次。水稻種子取成熟種子，剝?nèi)ネ鈿び?0％乙醇浸30秒，轉(zhuǎn)至2％次氯酸鈉溶液浸泡30分鐘后，用無菌水沖洗4～5次，置無菌濾紙上吸干多余水分。2、消毒和清洗（203無菌室）胡蘿卜：2、消毒和清洗（203無菌室）把洗凈的材料用燒過的鑷子夾到盛有濾紙的培養(yǎng)皿里，去除表面一層，然后切成約8×8×10mm的塊；把切好的材料，用燒過的鑷子夾到錐形瓶里，3-4塊/瓶，包好封口膜和牛皮紙；將培養(yǎng)基放到202，在23~28℃恒溫避光條件下培養(yǎng)。3、接種與培養(yǎng)把洗凈的材料用燒過的鑷子夾到盛有濾紙的培養(yǎng)皿里，去除表面一層五、注意事項防火實驗中要常用酒精消毒、用酒精燈燒鑷子、刀具，注意安全；手上涂酒精，要干后才能接近火源。無菌操作材料經(jīng)次氯酸鈉消毒后，還需嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作；為防止染菌，手要用酒精擦干凈，鑷子和刀經(jīng)常在火焰上燒；錐形瓶、手不要放在盛材料的培養(yǎng)皿上方。廢液處理

實驗完后，75%酒精和工業(yè)酒精，均應(yīng)倒回到工業(yè)酒精的罐中；升汞有劇毒，小心不要濺出，廢液倒回原處；酒精和升汞千萬別搞混。五、注意事項防火六、常見錯誤舉例材料切得過小。材料消毒時間過長。切材料時下面沒墊濾紙。鑷子、刀在酒精燈上燒過立即放到盛酒精的燒杯里。操作時，手、三角燒瓶在盛材料的培養(yǎng)皿上方活動，容易把菌帶到材料上。把接種的切塊壓入培養(yǎng)基里面。接種時瓶口垂直向上，手、鑷子上的臟物掉到瓶里。七、絕不能犯的錯誤

次氯酸鈉回收倒入酒精桶里。六、常見錯誤舉例材料切得過小。七、絕不能犯的錯誤

八、課后作業(yè)及預(yù)習(xí)組織培養(yǎng)的觀察培養(yǎng)期間要進(jìn)行觀察與記錄，請拷記錄表。課后作業(yè)有幾種常用的外植體消毒液？主要原理是什么？效果如何？預(yù)習(xí)葉綠體色素的提取與理化性質(zhì)的鑒定。八、課后作業(yè)及預(yù)習(xí)組織培養(yǎng)的觀察材料處理

1）配75%酒精（或配次氯酸鈉溶液）；

2）把胡蘿卜切成約4cm的段；3）去除表皮、木質(zhì)部和髓，切成約40×20×12mm方塊，4條。消毒和清洗

4）把切好的外植體及配好的酒精，帶到203無菌操作臺上；5）準(zhǔn)備好次氯酸鈉；6）將切好的外植體或水稻種子，放在100mL的燒杯里，加入75％酒精，浸泡30秒；

7）然后將外植體或水稻種子轉(zhuǎn)入2％次氯酸鈉中，浸泡25~30分鐘，不能超過30分鐘；

8）取出材料，放入培養(yǎng)皿，用滅菌水洗4~5分鐘，重復(fù)3次，用濾紙吸干。接種與培養(yǎng)

9）把洗凈的材料用燒過的鑷子夾到盛有濾紙的培養(yǎng)皿中，去除表面一層，然后切成約8×8×10mm的塊；水稻種子剝?nèi)ネ鈿?，用刀片切取種胚。

10）用鑷子將外植體或種胚放到培養(yǎng)基上，3-4塊/瓶；

11）蓋好封口膜和牛皮紙，放回202，23~28℃，避光培養(yǎng)。實驗步驟材料處理實驗步驟植物的組織培養(yǎng)第二節(jié)胡蘿卜的組織培養(yǎng)植物的組織培養(yǎng)預(yù)備任務(wù)1人/1個無菌操作臺。每組取如下工具放于203室無菌操作臺上先行滅菌培養(yǎng)皿、鑷子、無菌水和培養(yǎng)基；帶1個500mL的燒杯，作廢液缸；1個250mL的燒杯裝工業(yè)酒精150mL；帶1個100mL的燒杯。注意放置物品時，先關(guān)滅紫外燈，放好后，關(guān)上門，再開啟紫外燈；

預(yù)備任務(wù)1人/1個無菌操作臺。一、組織培養(yǎng)基本原理

全能性

植物體的每一個完整的細(xì)胞都擁有形成完整植株的全部遺傳信息，在一定的條件下都具有產(chǎn)生一株完整個體的潛在能力。去分化去除外植體原有的分化性狀，重新進(jìn)入新的發(fā)育分化狀態(tài)。一、組織培養(yǎng)基本原理

全能性組織培養(yǎng)的特點：取材少，培養(yǎng)材料經(jīng)濟；人為控制培養(yǎng)條件，不受自然條件影響；生長周期短，繁殖率高；管理方便，利于自動化控制。組織培養(yǎng)應(yīng)用：在理論上是研究細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、育種學(xué)、生物化學(xué)和藥物學(xué)等學(xué)科的重要手段；在生產(chǎn)上在農(nóng)學(xué)、園藝、林業(yè)和次生代謝產(chǎn)物工程等生產(chǎn)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。組織培養(yǎng)的特點：取材少，培養(yǎng)材料經(jīng)濟；人為控制培養(yǎng)條件，不受二、組織培養(yǎng)的方法和步驟

選擇原則：根據(jù)培養(yǎng)目的、易于誘導(dǎo)、帶菌少。

生理狀態(tài)：幼嫩的組織

取材季節(jié)：易成活，生長旺盛季節(jié)，內(nèi)源激素含量高，易分化

植物的長勢：生長健壯的組織

外植體大?。簯?yīng)根據(jù)培養(yǎng)目的而定胚胎培養(yǎng)或脫除病毒，則外植體宜小；快速繁殖，外植體宜大。一般外植體大小在0.5～1.0

cm為宜。1、培養(yǎng)材料的采集二、組織培養(yǎng)的方法和步驟

選擇原則：1、培養(yǎng)材料的采集2、外植體的表面消毒處理外植體的表面清洗：洗衣粉清洗，吐溫。外植體表面滅菌（一般采用2次滅菌法）先用70%酒精浸10～30s；轉(zhuǎn)到其它消毒溶液，滅菌液要充分浸沒材料。無菌水涮洗涮洗要每次3min左右，視采用的消毒液種類，涮洗3-l0次左右。2、外植體的表面消毒處理外植體的表面清洗：洗衣粉清洗，吐溫。滅菌劑使用濃度（%）去除難易滅菌時間滅菌效果酒精70-75易0.1-3好氯化汞0.1-0.2較難2-10最好漂白粉飽和溶液易5-30很好次氯酸鈣9-10易5-30很好次氯酸鈉2（活性氯）易5-30很好過氧化氫10-12最易5-15好抗菌素4-50mg/L中30-60較好滅菌劑使用濃度去除難易滅菌時間滅菌效果酒精70-75易0.13、制備外植體與接種將已消毒的材料，用無菌刀、剪、鑷子等，在無菌的環(huán)境下，剝?nèi)パ康镊[片、嫩枝的外皮和種皮胚乳等，葉片則不需剝皮。在操作中嚴(yán)禁用手接觸材料。在無菌壞境下，將切好的外植體立即接在培養(yǎng)基上，每瓶接種2~4個，防止交叉污染。接種后，瓶、管用無菌藥棉或蓋封口，培養(yǎng)皿用無菌膠帶封口。

3、制備外植體與接種將已消毒的材料，用無菌刀、剪、鑷子等，在三、無菌操作步驟接種3天前用甲醛熏蒸接種室，并于接種前3小時打開紫外線燈進(jìn)行殺菌；接種前20分鐘，打開超凈工作臺的風(fēng)機以及臺上的紫外燈；接種員洗凈雙手，在緩沖間換好專用實驗服，換穿拖鞋等；上工作臺后，用酒精棉球搽拭雙手（特別是指甲處）和工作臺面；用酒精棉球搽拭接種工具，再將鑷子和剪刀從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端處，對培養(yǎng)皿要過火烤干；接種時，接種員雙手不能離開工作臺，不能說話、走動和咳嗽等；接種完畢后要清理干凈工作臺，可用紫外線燈滅菌30分鐘，若連續(xù)接種，每5天要大強度滅菌一次。三、無菌操作步驟接種3天前用甲醛熏蒸接種室，并于接種前3小時四、本實驗—胡蘿卜的接種培養(yǎng)把胡蘿卜切成約40mm的段；去除表皮，去除木質(zhì)部和髓；切成約40×20×10mm的條狀，共切4塊。1、胡蘿卜的切塊處理皮層韌皮部形成層木質(zhì)部四、本實驗—胡蘿卜的接種培養(yǎng)把胡蘿卜切成約40mm的段；1、胡蘿卜：把切好的材料，放在100mL的燒杯里，加入75％酒精（現(xiàn)配100mL），浸泡30秒；然后將外植體轉(zhuǎn)入2％次氯酸鈉中（100mL燒杯裝約70mL次氯酸鈉），浸泡25－30分鐘；取出材料，放入培養(yǎng)皿，用無菌水洗4－5分鐘，重復(fù)3次。水稻種子取成熟種子，剝?nèi)ネ鈿び?0％乙醇浸30秒，轉(zhuǎn)至2％次氯酸鈉溶液浸泡30分鐘后，用無菌水沖洗4～5次，置無菌濾紙上吸干多余水分。2、消毒和清洗（203無菌室）胡蘿卜：2、消毒和清洗（203無菌室）把洗凈的材料用燒過的鑷子夾到盛有濾紙的培養(yǎng)皿里，去除表面一層，然后切成約8×8×10mm的塊；把切好的材料，用燒過的鑷子夾到錐形瓶里，3-4塊/瓶，包好封口膜和牛皮紙；將培養(yǎng)基放到202，在23~28℃恒溫避光條件下培養(yǎng)。3、接種與培養(yǎng)把洗凈的材料用燒過的鑷子夾到盛有濾紙的培養(yǎng)皿里，去除表面一層五、注意事項防火實驗中要常用酒精消毒、用酒精燈燒鑷子、刀具，注意安全；手上涂酒精，要干后才能接近火源。無菌操作材料經(jīng)次氯酸鈉消毒后，還需嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作；為防止染菌，手要用酒精擦干凈，鑷子和刀經(jīng)常在火焰上燒；錐形瓶、手不要放在盛材料的培養(yǎng)皿上方。廢液處理

實驗完后，75%酒精和工業(yè)酒精，均應(yīng)倒回到工業(yè)酒精的罐中；升汞有劇毒，小心不要濺出，廢液倒回原處；酒精和升汞千萬別搞混。五、注意事項防火六、常見錯誤舉例材料切得過小。材料消毒時間過長。切材料時下面沒墊濾紙。鑷子、刀在酒精燈上燒過立即放到盛酒精的燒杯里。操作時，手、三角燒瓶在盛材料的培養(yǎng)皿上方活動，容易把菌帶到材料上。把接種的切塊壓入培養(yǎng)基里面。接種時瓶口垂直向上，手、鑷子上的臟物掉到瓶里。七、絕不能犯的錯誤

次氯酸鈉回收倒入酒精桶里。六、常見錯誤舉例材料切得過小。七、絕不能犯的錯誤

八、課后作業(yè)及預(yù)習(xí)組