高尚先-轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)-個(gè)體化檢測(cè)現(xiàn)狀及展望20130516課件

轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)--個(gè)體化檢測(cè)現(xiàn)狀及展望中國(guó)食品藥品檢定研究院高尚先轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)--個(gè)體化檢測(cè)現(xiàn)狀及展望轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)簡(jiǎn)介個(gè)體化診療個(gè)體化檢測(cè)技術(shù)個(gè)體化檢測(cè)試劑管理和審批展望2轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)（TranslationalMedicine）：1992年，美國(guó)《科學(xué)》雜志首次提出“從實(shí)驗(yàn)室到病床（BenchtoBedside）”的概念，1996年，在《柳葉刀》雜志上，第一次出現(xiàn)了“轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)”這個(gè)名詞，2003年NIH的Zerhouni在Science上發(fā)表文章TheNIHRoadmap后，引起了學(xué)界對(duì)轉(zhuǎn)化性研究的高度重視。轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)是把醫(yī)學(xué)生物學(xué)基礎(chǔ)研究成果迅速有效的轉(zhuǎn)化為可在臨床實(shí)際應(yīng)用的理論、技術(shù)、方法和藥物的過(guò)程。即從實(shí)驗(yàn)室到病床（BenchtoBedside）再?gòu)牟〈驳綄?shí)驗(yàn)室（BedsidetoBench）的連續(xù)過(guò)程，簡(jiǎn)稱為“B-to-B或B2B”及從實(shí)驗(yàn)室到公眾健康（BenchtoPublic,B2P）

轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)：基礎(chǔ)研究→臨床應(yīng)用，“驅(qū)動(dòng)臨床研究引擎的激發(fā)器”實(shí)驗(yàn)室成果→產(chǎn)業(yè)化

雙向、開放

現(xiàn)代和未來(lái)醫(yī)學(xué)研究的主要模式

一、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)簡(jiǎn)介——轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)概念“4P”醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)循證醫(yī)學(xué)經(jīng)驗(yàn)醫(yī)學(xué)一、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)簡(jiǎn)介——醫(yī)學(xué)模式轉(zhuǎn)變5一、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)簡(jiǎn)介——“4P醫(yī)學(xué)”

Personalized個(gè)體化

Predictive

預(yù)測(cè)Preemptive干預(yù)

Participatory參與

新醫(yī)學(xué)模式BradleyWG,etal.Radiology.2011Feb;258(2):571-826當(dāng)代醫(yī)療模式的轉(zhuǎn)換對(duì)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究具有更新、更高的要求：填平基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)之間的鴻溝，讓患者和公眾從醫(yī)學(xué)的進(jìn)步中獲得最大收益，是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)追求的崇高目標(biāo)。一、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)簡(jiǎn)介——轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的研究?jī)?nèi)容

轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)是生物醫(yī)學(xué)發(fā)展特別是基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)以及生物信息學(xué)發(fā)展的時(shí)代產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的中心環(huán)節(jié)是生物標(biāo)志物的研究。

開發(fā)和利用各種組學(xué)方法以及分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選各種生物標(biāo)志物，用于疾病危險(xiǎn)度估計(jì)、疾病診斷與分型、治療反應(yīng)和預(yù)后的評(píng)估，以及治療方法和新藥物的開發(fā)。

7一、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)簡(jiǎn)介——三個(gè)方面推動(dòng)“4P”

1.分子標(biāo)志物的鑒定和應(yīng)用

基于各種組學(xué)方法篩選出早期診斷疾病，預(yù)測(cè)疾病(個(gè)體疾病敏感性預(yù)測(cè))，判斷藥物療效和評(píng)估患者預(yù)后的生物標(biāo)志物及藥物靶標(biāo)。

2.基于分子分型的個(gè)體化治療

惡性腫瘤和心腦血管病及糖尿病等大多數(shù)慢性病是多病因疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、疾病異質(zhì)性很大。因此，對(duì)這些疾病不能采用單一方法(如同一藥物、相同的劑量)來(lái)進(jìn)行疾病診治。。基于患者的遺傳、分子生物學(xué)特征和疾病基本特征進(jìn)行分子分型，以此為基礎(chǔ)實(shí)施個(gè)體化的治療是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的目標(biāo)。分子醫(yī)學(xué)(molecularmedicine)和個(gè)體化醫(yī)學(xué)(personalizedmedicine)都是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究產(chǎn)生的結(jié)果。

3.疾病治療反應(yīng)和預(yù)后的評(píng)估與預(yù)測(cè)

由于遺傳、營(yíng)養(yǎng)、免疫等因素的差別，同一種疾病的患者，對(duì)同一種治療方法或同一種藥物的效果和預(yù)后可表現(xiàn)出較大的差異。在分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)上，我們可利用經(jīng)評(píng)估有效的生物標(biāo)志物(如患者的基因分型、生化各種表型指標(biāo)等)，進(jìn)行患者藥物敏感性和預(yù)后的預(yù)測(cè)，選擇敏感的藥物和適當(dāng)?shù)膭┝?，以提高療效和改善預(yù)后。通過(guò)臨床與實(shí)驗(yàn)室關(guān)聯(lián)性研究(clinical—laboratorycorrelativestudies)找出規(guī)律，闡明疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，以循證醫(yī)學(xué)的原則實(shí)施醫(yī)療工作。

8二、個(gè)體化醫(yī)學(xué)個(gè)體化診斷個(gè)體化治療在檢測(cè)個(gè)體基因差別的基礎(chǔ)上，預(yù)測(cè)疾病的易感性，對(duì)疾病進(jìn)行特異性診斷，評(píng)估藥物的反應(yīng)性，并依此為患病個(gè)體制定特異性治療方案，真正做到因人施治。

10個(gè)體化治療藥物FDA已批準(zhǔn)與個(gè)體化治療相關(guān)藥物113種，預(yù)計(jì)可開發(fā)的有5000種目前針對(duì)個(gè)體化檢測(cè)靶點(diǎn)已經(jīng)開展的檢測(cè)有28個(gè)（包括基因多態(tài)性靶點(diǎn)8個(gè)）遺傳變異包括基因突變和基因多態(tài)性Http://靶向藥物----個(gè)體化治療

一、EGF/EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

EGF/EGFR和VEGF/VEGFR通路的靶向治療藥物，是目前應(yīng)用最為廣泛的。

圖1EGF/EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

目前臨床應(yīng)用較多的針對(duì)EGFR和HER2的靶向抑制劑主要有兩類。一類為阻斷胞外受體功能區(qū)的單克隆抗體，如靶向EGFR的愛必妥（Erbitux）和維克替比（Vectibix）及靶向HER2的單克隆抗體trastuzumab（赫賽汀）。這類藥物起作用的指征是對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)（EGFR或HER2）表達(dá)呈陽(yáng)性。另外一類靶向藥物為抑制EGFR和HER2胞內(nèi)TK功能區(qū)自磷酸化的小分子藥物。易瑞沙(Iressa)和特羅凱(Tavceva)，通過(guò)選擇性抑制酪氨酸激酶活化，從而抑制EGFR激活。這類藥物主要用在結(jié)直腸癌和非小細(xì)胞肺癌的治療中。相關(guān)診斷試劑

14圖2VEGF信號(hào)通路

二、VEGF/VEGFR信號(hào)通路在大多數(shù)實(shí)體腫瘤中可檢測(cè)到VEGF的過(guò)度表達(dá)。根據(jù)干預(yù)環(huán)節(jié)的不同，相應(yīng)的抗血管生成藥分為五類：（1）抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生或遷移（2）阻止血管細(xì)胞外基質(zhì)降解（3）抑制VEGF和(或)VEGFR的產(chǎn)生（4）干擾VEGF和VEGFR的相互作用（5）抑制胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子從而阻斷VEGF/VEGFR信號(hào)通路。如VEGF的單抗－貝伐單抗（bevacizumab）、VEGFR1,2,3受體抑制劑－舒尼替尼（sunitinib）和索拉非尼（sorafenib）不但抑制VEGF受體，而且是Raf癌基因通路的抑制劑。FDA批準(zhǔn)；結(jié)腸癌癌、非小細(xì)胞型肺癌和腎細(xì)胞癌的治療。國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)診斷試劑批準(zhǔn)上市相關(guān)科研用診斷試劑VEGFRmRNA表達(dá)水平2.2個(gè)體化診斷NoclincialcancerbiomarkerisabsolutelyspecificIsaacS.ChanandGeoffreyS.Ginsburg.PersonalizedMedicine:ProgressandPromise.Annu.Rev.GenomicsHum.Genet.2011.12:7.1–7.281617基因型和基因表型檢測(cè)常見個(gè)體化藥物靶點(diǎn)及檢測(cè)方法NationalInstituteofFoodandDrugControl18藥物名稱靶標(biāo)檢測(cè)內(nèi)容適用標(biāo)本化療藥物順鉑/卡鉑ERCC1、GSTmRNA水平手術(shù)/穿刺樣本BRCA1mRNA水平/突變手術(shù)/穿刺樣本XRCC1基因多態(tài)性血液異環(huán)磷酰胺CYP2CI9*2、CYP2C9*3基因多態(tài)性血液絲裂霉素NQO1*2、NQO1*3基因多態(tài)性血液依托泊苷TOPOⅡa、MDR-1mRNA水平手術(shù)/穿刺樣本CYP3A4*4、UGT1A1基因多態(tài)性血液長(zhǎng)春瑞濱TUBB3、STMN1mRNA水平手術(shù)/穿刺樣本紫杉醇/多西紫杉醇TUBB3、STMN1、mRNA水平手術(shù)/穿刺樣本CYP2C8*3基因多態(tài)性血液伊立替康UGT1A1*28、UGT1A1*6基因多態(tài)性血液吉西他濱RRM1mRNA水平手術(shù)/穿刺樣本培美曲賽TSmRNA水平手術(shù)/穿刺樣本常見化療藥物與檢測(cè)靶點(diǎn)20臨床研究已證實(shí)ERCC1參與鉑類耐藥發(fā)生，其表達(dá)水平與多種癌癥鉑類化療療效和生存期呈負(fù)相關(guān)，即表達(dá)水平低的患者對(duì)鉑類藥物敏感，反之表達(dá)水平高的患者表現(xiàn)耐藥。美國(guó)國(guó)家癌癥綜合治療聯(lián)盟（NCCN）2009年版臨床治療指南中明確指出：接收鉑類化療前進(jìn)行ERCC1mRNA檢測(cè)可提高治療有效率和患者生存率。ERCC1（ExcisionRepairCrossComplementGroup1，核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1）化療藥物和成熟位點(diǎn)：鉑類藥物與基因-ERCC121伊立替康（轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌）代謝伊立替康(前藥-無(wú)活性)酯酶SN-38(活性)UGT1A1(肝臟內(nèi))SN-38G膽汁(TA)6TAA(TA)7TAAUGT1A1活性SN-38濃度6/6野生型7/7突變型23結(jié)腸癌患者，考慮使用伊立替康時(shí)進(jìn)行UGT1A1基因型檢測(cè)肺癌個(gè)體化檢測(cè)不清楚不清楚1987年KRAS突變2004年EGFR突變KRASKRAS

EGFR2009年肺腺癌分子分型KRASHER2BRAFALKfusionPIK3CAMEK1ROSfusionPDGFRamp不清楚突變預(yù)測(cè)EGFRexon19del/L858RSenstoEGFRTKIsKRASRestoEGFRTKIsEGFRT790M/D761Y/T854ARestoEGFRTKIs;senstonewTKIs?METamplificationSenstoMETTKIsMEK1SenstoMEKinhibitorsHER2SenstoHER2TKIsBRAFSenstoBRAFinhibitorsALKfusionsSenstoALKinhibitorsPDGFRa

amplificationSenstoPDGFRinhibitorsPIK3CAPIK3CAinhibitors?ROSfusionSenstoROSinhibitors?肺腺癌的個(gè)體化分子靶向治療26非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）與EGFR基因突變ModernPathology(2012)25,347–36927EML4-ALK融合基因檢測(cè)EML4-ALK融合基因約占NSCLC的4%（0.4-11.6%）28國(guó)內(nèi)外個(gè)體化檢測(cè)試劑現(xiàn)狀預(yù)測(cè)性

例唐氏綜合癥篩查試劑盒,FDA批準(zhǔn)的蛋白HE4和CA125檢測(cè)聯(lián)合卵巢惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算法（ROMA），在測(cè)定絕經(jīng)前后女性卵巢癌風(fēng)險(xiǎn)性上具有很高的準(zhǔn)確性。診斷性例常見腫瘤標(biāo)志物CEA、AFP、CA系列等診斷試劑，胃癌標(biāo)志物Hab18G/CD147等藥物療效例白血病融合基因、拉米夫定耐藥突變、利福平耐藥突變,華法林藥物敏感等檢測(cè)試劑盒NationalInstituteofFoodandDrugControlHttp://藥物靶點(diǎn)例EGFR、K-ras、Braf突變檢測(cè)試劑盒等，尚有10余種處于注冊(cè)批準(zhǔn)階段,如ERCCI、BRCA等轉(zhuǎn)移性例循環(huán)腫瘤細(xì)胞、CK-19、CK-18等檢測(cè)試劑盒;易感性尚無(wú)診斷試劑盒獲批按照診斷試劑注冊(cè)管理辦法該類診斷試劑基本上都屬于三類，且種類繁多三、個(gè)體化檢測(cè)技術(shù)形態(tài)學(xué)

免疫分型

免疫球蛋白電泳免疫組化

基因定性、定量基因突變檢測(cè)

MSI（微衛(wèi)星不穩(wěn)定性）

WHO規(guī)范化腫瘤綜合檢測(cè)，應(yīng)用MICM分類標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合了形態(tài)學(xué)(M)免疫學(xué)(I)細(xì)胞遺傳學(xué)(C)，分子生物學(xué)（M），使分型更加準(zhǔn)確免疫學(xué)細(xì)胞遺傳學(xué)分子生物學(xué)

常規(guī)病理

血細(xì)胞涂片

核型分析

熒光原位雜交MICM未來(lái)-預(yù)測(cè)性檢測(cè)多方法平臺(tái)/多因素檢測(cè)/多基因信號(hào)/多樣本類型–尿樣、唾液、呼吸、其他/增加診斷性影像檢查的應(yīng)用32PCR-Sequencing

(20%)PCRpurificationSequencingreactionpurificationsequencingdataanalysisEGFR19DelsEGFR21L858R33PCR-MASSSensitivity(5％）PCR

extentionMASS34ARMSPCR(1%)Specific

for

mutation35real-timeScorpionsARMSPCR363.2國(guó)內(nèi)現(xiàn)有EGFR基因突變檢測(cè)方法372012衛(wèi)生部臨檢中心室間質(zhì)評(píng)臨床實(shí)驗(yàn)室使用技術(shù)方法回報(bào)EGFR基因突變檢測(cè)使用儀器實(shí)時(shí)熒光PCR儀測(cè)序儀焦磷酸測(cè)序儀其它AgilentMx3000PABI3730/ABI3730xlQIAGENPyroMarkQ24Luminex?200TMBIO-RADCFX-96beckmancoulterCEQ8800遺傳定量分析系統(tǒng)PyroMarkQ96ID變性高效液相色譜儀WAVE4500ABIStepOnePlusABI3100-AvantABI7300BECKMANCEQ8000ABI7500AB3500/ABI3500XLABI7500FASTBio-RadMINI-OPCTIONIIQIAGENRotor-Gene?QLightCycle480382012衛(wèi)生部臨檢中心室間質(zhì)評(píng)臨床實(shí)驗(yàn)室使用儀器回報(bào)個(gè)體化檢測(cè)技術(shù)方法多樣化，多種方法并存，包括：ARMS、流式熒光雜交法、PCR-直接測(cè)序、PCR-焦磷酸測(cè)序法、實(shí)時(shí)熒光PCR法、HRM、DHPLC等。但是很多實(shí)驗(yàn)室使用自制的試劑，實(shí)驗(yàn)流程也缺乏一定的規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)，必須避免個(gè)體化用藥形成一種沒有規(guī)范管理下的混亂狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)整個(gè)行業(yè)的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化勢(shì)在必行。393.3新方法研究一步法酶切富集突變體ARMSreal-timePCR

人為引入酶切位點(diǎn)實(shí)時(shí)內(nèi)切酶酶切富集突變體ARMSreal-timePCR阻斷劑富集突變體ARMSreal-timePCR

40一步法酶切富集突變體ARMSreal-timePCR酶切：37℃溫育30min；Nest-PCR富集：95℃15sec，65℃20sec，72℃60sec，5-10Cycles；ARMS引物檢測(cè)突變位點(diǎn)：95℃15sec，60℃30sec，40Cycles；Nest-FNest-R400-500bpARMSPrimer-R優(yōu)點(diǎn)：酶切、富集、熒光定量PCR在同一反應(yīng)體系中，一步法完成檢測(cè)。提高了特異性和選擇性。41一步法酶切富集ARMS-Taqman方法的建立L858R檢測(cè)曲線在5000Copies的L858R野生型質(zhì)粒背景下，依次存在10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0%突變率，可檢出0.1%突變率Theagreementsofbothtestswere96.7%and93.5%withaKappavalueof0.889and0.716forL858RandE746A750del,LungCancer2011(74):226-23242人為引入酶切位點(diǎn)實(shí)時(shí)內(nèi)切酶酶切富集突變體ARMSreal-timePCRMismatchprimerPCRWildtypedigestionWildMutationaddaenzymesiteNoenzymesiteDigestionandPCRwereperformedinarunInterJournalofCancer2012NoCycleNestCycle43在106Copies/l的野生型質(zhì)粒背景下，依次存在1%、1‰、0.1‰、0.01‰、0%突變率，可檢出0.01‰突變率——T790M(EuropeanJournalofCancer2012submitteddata)NoBlockerBlocker阻斷劑富集突變體ARMSreal-timePCR443.4個(gè)體化檢測(cè)技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)——測(cè)序技術(shù)45第一代測(cè)序儀僅僅是提供一個(gè)電泳和電泳后分析的平臺(tái)第二代測(cè)序儀則利用微加工處理和光電子成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)邊反應(yīng)邊測(cè)序第三代測(cè)序儀則將反應(yīng)體系進(jìn)一步縮小到了微納米量級(jí)的尺度，同時(shí)利用物理原理實(shí)現(xiàn)了單分子識(shí)別未來(lái)的第四代測(cè)序技術(shù)幾乎完全拋棄了生化反應(yīng)，通過(guò)力學(xué)、電學(xué)等對(duì)DNA分子中的堿基直接判讀個(gè)體化檢測(cè)技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)——蛋白質(zhì)組學(xué)腫瘤患者和正常人差異蛋白：診斷腫瘤原位與轉(zhuǎn)移比較：腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白……

主要技術(shù)應(yīng)用46個(gè)體化檢測(cè)技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)——外周血檢測(cè)替代檢測(cè)方案：手術(shù)后、不愿穿刺患者、對(duì)獲得性耐藥進(jìn)行檢測(cè)研究結(jié)果血漿和組織切片檢測(cè)陽(yáng)性突變率不一致，突變一致性為30%,檢測(cè)出不同突變類型不建議作為常規(guī)檢測(cè)樣本類型,在無(wú)法獲得腫瘤組織樣本的情況下的參考血漿/血清游離DNA一些腫瘤患者血漿中有足夠的游離DNA(是正常人的10倍)。血漿中的游離DNA主要由凋亡和壞死的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，其遺傳學(xué)特性與腫瘤基因組DNA相似。組織合計(jì)突變無(wú)突變血液突變909無(wú)突變207191合計(jì)2971100(unpublisheddata)4748乳腺癌個(gè)體化檢測(cè)個(gè)體化檢測(cè)試劑發(fā)展趨勢(shì)—新型標(biāo)記物不斷涌現(xiàn)MitchDowsett,etal.Emergingbiomarkersandnewunderstandingoftraditionalmarkersinpersonalizedtherapyinbreastcancer.ClinCancerRes.2008,14(24).傳統(tǒng)的標(biāo)志物生物標(biāo)志物臨床意義雌激素受體激素治療預(yù)測(cè)因子孕激素受體ER+腫瘤預(yù)后

新發(fā)現(xiàn)標(biāo)志物HER2赫賽汀治療預(yù)測(cè)因子雌激素受體陽(yáng)性患者的“21基因檢測(cè)”（OncotypeDx）淋巴結(jié)陰性、ER+腫瘤化療效果預(yù)測(cè)淋巴結(jié)陰性、ER+腫瘤復(fù)發(fā)、預(yù)后高通量基因檢測(cè)系統(tǒng)MammaPrint淋巴結(jié)陰性腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)、纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)過(guò)表達(dá)表示淋巴結(jié)節(jié)陰性腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高基因組學(xué)等級(jí)指數(shù)隨時(shí)間遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)3.5檢測(cè)試劑盒主要技術(shù)指標(biāo)核酸擴(kuò)增檢測(cè)用試劑（盒）行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)基因突變檢測(cè)試劑盒主要技術(shù)指標(biāo)49核酸擴(kuò)增檢測(cè)用試劑（盒）行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)不適用于基因分型、基因芯片和病毒基因分型/突變檢測(cè)用試劑（盒）及血源篩查的試劑（盒）技術(shù)要求要點(diǎn)外觀溯源性（不適用）測(cè)量系統(tǒng)的線性（不適用）準(zhǔn)確度分析特異性亞型檢測(cè)能力（不適用）精密度檢測(cè)限/定量限（針對(duì)定量試劑）（正式名稱均不稱靈敏度）干擾物質(zhì)穩(wěn)定性基因突變檢測(cè)試劑盒主要技術(shù)指標(biāo)外觀和裝量重復(fù)性/精密度準(zhǔn)確度（突變型的檢測(cè)能力）分析特異性（如正常野生型基因組、突變型之間）檢測(cè)限（針對(duì)定性試劑，檢出突變型的copies/test）選擇性（針對(duì)突變型和野生型不同比例設(shè)定的技術(shù)要求如5%）檢測(cè)限和選擇性可放在一起進(jìn)行檢測(cè)Http://目前體細(xì)胞突變檢測(cè)遇到的問題分析特異性：不同的突變型之間，部分試劑盒存在交叉反應(yīng)野生型基因組背景正常提取濃度的野生型基因組部分試劑盒有明顯的非特異反應(yīng)選擇性：病理組織中突變體的分布不均一，影響選擇性突變比例對(duì)藥物應(yīng)用指征關(guān)系不明確外周血檢測(cè)突變的可行性523.6個(gè)體化檢測(cè)試劑質(zhì)量保證:樣本標(biāo)本

組織：腫瘤細(xì)胞的比例(70%以上)1）新鮮2）石蠟：良好的內(nèi)控

細(xì)胞

外周血53個(gè)體化檢測(cè)試劑質(zhì)量保證:重復(fù)性影響因素樣本的異質(zhì)性及代表性標(biāo)本的穩(wěn)定性（新鮮樣本的保質(zhì)如運(yùn)輸、存儲(chǔ)等）操作規(guī)范化試劑盒各組分的穩(wěn)定性

個(gè)體化檢測(cè)試劑質(zhì)量保證——特異性、選擇性

分析特異性避免突變型之間的交叉反應(yīng)；減少野生型基因組背景的非特異反應(yīng)檢測(cè)限與分析特異性通常檢測(cè)限與分析特異性是一對(duì)矛盾檢測(cè)限：突變型的copies

臨床樣本檢測(cè)限/選擇性：測(cè)序20%<20%,對(duì)比試劑或臨床療效驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)限突變型質(zhì)粒copies/test實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)限/選擇性：質(zhì)粒1%-0.1%

背景:10ng

5%、1%100ng-500ng提高特異性

選擇性不降或提高0.1%?高特異性高選擇性可能用于外周血檢測(cè)3.7個(gè)體化檢測(cè)試劑臨床應(yīng)用:EGFR突變豐度/選擇性探討基因突變豐度與臨床應(yīng)用的指導(dǎo)意義WuYilongetalJOURNALOFCLINICALONCOLOGYVOLUME29NUMBER24AUGUST20201156體細(xì)胞突變不同檢測(cè)方法比較

檢測(cè)限/選擇性：針對(duì)組織標(biāo)本是否越高越好？

細(xì)胞周期的劃分：G1期→S期→G2期→M期，以及G0期。

G1期:進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)及準(zhǔn)備染色體復(fù)制，S期:進(jìn)行染色體復(fù)制,使DNA成為相同的兩份，G2期:制造蛋白質(zhì),準(zhǔn)備細(xì)胞分裂的所需物質(zhì)，M期：有絲分裂；為進(jìn)行核裂(染色體分離)和質(zhì)裂(細(xì)胞質(zhì)分裂)的階段。

當(dāng)細(xì)胞處于G0期時(shí)就會(huì)停止細(xì)胞一切的復(fù)制分裂過(guò)程化療藥只對(duì)處于增殖期的腫瘤細(xì)胞起作用，而對(duì)休眠期的腫瘤細(xì)胞是不起作用的厄洛替尼（TKI，針對(duì)NSCLC）誘導(dǎo)細(xì)胞停滯在G1期，而許多化療藥物作用在其他細(xì)胞周期，如多西他賽誘導(dǎo)細(xì)胞停滯在M期并凋亡，因此當(dāng)這兩類藥物被聯(lián)合使用時(shí)可能存在拮抗作用：厄洛替尼引起的G1期停滯，使較少細(xì)胞能夠進(jìn)入其他細(xì)胞周期時(shí)相，從而阻斷多西他賽對(duì)M期細(xì)胞的活性。這可能解釋為什么這兩類藥物聯(lián)合應(yīng)用但沒有產(chǎn)生協(xié)同作用?；熕幒蚑KI不能聯(lián)合應(yīng)用EGFR基因突變比例研究技術(shù)手段：ARMSrealtimePCR體系SequenomMassARRAY體系A(chǔ)RMS體系擴(kuò)增曲線：從左到右依次為100%、80%、40%、20%、10%、5%、0%的L858R突變質(zhì)譜對(duì)模擬樣本分析峰圖：從左到右依次為100%、80%、40%、20%、10%、5%、0%、陰性對(duì)照59(unpublisheddata)EGFR基因L858R突變比例檢測(cè)結(jié)果(unpublisheddata)L858RmutationNumberPercent（%）＞20%1571.410-20%314.3＜10%314.3Total21100L858Rmutation（21/151）、19DELmutation（35/151）60EGFR基因T790M耐藥突變比例檢測(cè)結(jié)果61(unpublisheddata)3.8基因突變類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)62室間質(zhì)量評(píng)價(jià)質(zhì)控品包含常見突變滿足大多數(shù)檢測(cè)方法要求盡可能模擬全部檢測(cè)過(guò)程可以使用突變細(xì)胞系、組織切片等國(guó)家基因突變類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)盡可能覆蓋大多數(shù)突變滿足絕大多數(shù)檢測(cè)方法要求盡可能考核試劑盒的全部性能指標(biāo)，包含準(zhǔn)確性、分析特異性、檢測(cè)限/選擇性等可以使用重組質(zhì)粒、突變細(xì)胞系，如組織切片具有可行性是最好選擇EGFR基因突變候選國(guó)家參考品63突變細(xì)胞株：如EGFR突變細(xì)胞系SW48、H1975、H1650包含的突變位點(diǎn)有19號(hào)外顯子缺失、18外顯子G719S和20外顯子T790M、21外顯子L858R四個(gè)突變位點(diǎn)質(zhì)粒：各種突變型和野生型質(zhì)粒，如EGFR突變國(guó)家參考品組成：29種EGFR突變體參考品、5份野生型參考品、1份重復(fù)性EGFR突變體參考品。人類基因組背景：不同濃度野生型背景對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響明顯

EGFR基因突變候選國(guó)家參考品的應(yīng)用10ng野生型基因組背景的29種突變體參考品檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確；在高濃度野生型基因組（300ng）背景下，出現(xiàn)假陽(yáng)性64四、個(gè)體化檢測(cè)試劑管理和審批管理辦法技術(shù)指導(dǎo)原則質(zhì)量評(píng)價(jià)654.1個(gè)體化檢測(cè)相關(guān)體外診斷試劑注冊(cè)審批管理涉及個(gè)體化檢測(cè)體外診斷試劑的注冊(cè)審批按照《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（試行）進(jìn)行管理美國(guó)體外診斷產(chǎn)品（含體外診斷試劑）按醫(yī)療器械管理。

分為I類、Ⅱ類、Ⅲ類。I類、Ⅱ類、Ⅲ類產(chǎn)品的生產(chǎn)均應(yīng)符合GMP規(guī)范（除豁免GMP的I類產(chǎn)品外）。上市前的監(jiān)管還包括要求進(jìn)行符合要求的臨床研究。歐盟歐盟根據(jù)體外診斷產(chǎn)品危險(xiǎn)性不同，將其分為A類、B類和不需經(jīng)審評(píng)委員會(huì)審評(píng)的產(chǎn)品三類，實(shí)行分類管理。歐盟對(duì)體外診斷產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程按ISO9001和EN46001的要求進(jìn)行管理。中國(guó)

《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（試行），分為I類、Ⅱ類、Ⅲ類，Ⅱ類、Ⅲ類按要求進(jìn)行臨床試驗(yàn)。Http://個(gè)體化檢測(cè)方法的建立、確證和臨床應(yīng)用篩選靶標(biāo)建立檢測(cè)方法確證候選生物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)臨床試驗(yàn)注冊(cè)檢測(cè)方法獲得批準(zhǔn)取證確證向?qū)嶒?yàn)室推廣市場(chǎng)臨床/實(shí)驗(yàn)室培訓(xùn)在臨床試驗(yàn)法規(guī)方面，由于新技術(shù)、新產(chǎn)品的不斷出現(xiàn)，在臨床設(shè)計(jì)方面有著其特殊性，現(xiàn)有的《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》法規(guī)對(duì)臨床例數(shù)的規(guī)定與產(chǎn)品臨床試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)的科學(xué)性有時(shí)存在很大的矛盾，如檢測(cè)的不同樣本類型、陽(yáng)性率低的罕見分型等的納入例數(shù)要求并不明確，這些問題都是有待新法規(guī)或藥監(jiān)部門的技術(shù)指導(dǎo)原則出臺(tái)來(lái)解決。由于個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目涉及范圍較廣、發(fā)展較快，絕大部分的相關(guān)檢測(cè)還沒有經(jīng)過(guò)國(guó)家藥監(jiān)部門批準(zhǔn)的商品試劑盒，可考慮借鑒發(fā)達(dá)國(guó)家在這方面的經(jīng)驗(yàn)，建立類似美國(guó)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證的監(jiān)管機(jī)制。即實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的檢測(cè)符合特定實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系要求即可作為該項(xiàng)技術(shù)進(jìn)入臨床應(yīng)用的許可，但不允許外售給其他實(shí)驗(yàn)室或醫(yī)療機(jī)構(gòu)并在有同類項(xiàng)目獲得批準(zhǔn)后即撤銷該項(xiàng)目在實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用認(rèn)證。從而滿足臨床需求，促進(jìn)我國(guó)個(gè)體化診斷和治療科學(xué)高效產(chǎn)業(yè)化。同時(shí)完善監(jiān)管技術(shù)，加強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)研究，更好的為產(chǎn)業(yè)和臨床服務(wù)。68臨床試驗(yàn)1000例陽(yáng)性大于300例罕見型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義對(duì)照試劑金標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序20%；<20%,對(duì)照試劑或臨床療效驗(yàn)證

4.2技術(shù)指導(dǎo)原則FDA發(fā)布的與生物標(biāo)志物診斷試劑相關(guān)的指導(dǎo)原則：心臟移植基因表達(dá)分析測(cè)試系統(tǒng)GuidanceforIndustryandFDAStaff-ClassIISpecialControlsGuidanceDocument:CardiacAllograftGeneExpressionProfilingTestSystems2009藥理學(xué)試驗(yàn)及遺傳標(biāo)記的基因測(cè)試指南GuidanceonPharmacogeneticTestsandGeneticTestsforHeritableMarkers2007乳腺癌預(yù)后的基因表達(dá)分析GuidanceforIndustryandFDAStaff-ClassIISpecialControlsGuidanceDocument:GeneExpressionProfilingTestSystemforBreastCancerPrognosis；2007CFTR基因突變檢測(cè)系統(tǒng)ClassIISpecialControlsGuidanceDocument:CFTRGeneMutationDetectionSystems2005與宮頸癌關(guān)聯(lián)的HPV檢測(cè)相關(guān)GuidanceforIndustryandFoodandDrugAdministrationStaff-EstablishingthePerformanceCharacteristicsofInVi