基因工程制藥工藝推選優(yōu)秀ppt

基因工程(jīyīngōngchéng)制藥工藝第一頁，共22頁。第六章基因工程(jīyīngōngchéng)制藥工藝6.1基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)6.2基因工程大腸桿菌的構(gòu)建(ɡòujiàn)6.3基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制第二頁，共22頁。6.3基因工程(jīyīngōngchéng)菌發(fā)酵培養(yǎng)與控制6.3.1培養(yǎng)基組成與控制6.3.2培養(yǎng)工藝與控制6.3.3產(chǎn)物(chǎnwù)誘導(dǎo)表達與終點控制第三頁，共22頁。6.3.1培養(yǎng)基組成(zǔchénɡ)與控制營養(yǎng)與環(huán)境作用：碳源、氮源、無機鹽和生長因子工藝(gōngyì)作用：消泡劑篩選與表達：選擇劑，誘導(dǎo)物第四頁，共22頁。1、碳源大腸桿菌(dàchánɡɡǎnjūn)：蛋白胨等蛋白質(zhì)的降解物作為碳源。酵母：利用葡萄糖、半乳糖等單糖類物質(zhì)。添加低濃度的單糖和雙糖及其他有機物如甘油等對菌體生長具有一定的促進作用。濃度稍高后就表現(xiàn)出底物抑制作用。葡萄糖優(yōu)先利用會造成培養(yǎng)基的酸化。第五頁，共22頁。2、氮源直接很好地吸收利用銨鹽等，一般(yībān)不能利用硝態(tài)氮。幾乎都能利用有機氮源。不同工程菌對氮源利用能力差別很大，具有很高的選擇性。大腸桿菌：利用大分子有機氮源，酵母粉等。酵母：利用氨基酸為氮源。第六頁，共22頁。3、無機鹽磷、硫、鉀、鈣、鎂、鈉等大量(dàliàng)元素和鐵、銅、鋅、錳、鉬等微量元素的鹽離子形態(tài)。基因工程菌生長提供必需的礦物質(zhì)。第七頁，共22頁。4、選擇(xuǎnzé)劑維持工程菌的純正性和質(zhì)粒的穩(wěn)定性的化合物。兩類：營養(yǎng)缺陷互補標(biāo)記和抗生素抗性選擇標(biāo)記發(fā)酵培養(yǎng)過程中質(zhì)粒易丟失，使之成為宿主菌。為了保證(bǎozhèng)質(zhì)粒的穩(wěn)定性，不丟失，根據(jù)質(zhì)粒的標(biāo)記基因，添加或缺陷選擇劑。第八頁，共22頁?；蚬こ檀竽c桿菌含有抗生素抗性基因，抗生素作為選擇(xuǎnzé)劑：卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、博來霉素等?；蚬こ探湍妇Ｓ冒被釥I養(yǎng)缺陷型，缺陷亮氨酸、組氨酸、賴氨酸、色氨酸等。第九頁，共22頁。5、誘導(dǎo)(yòudǎo)物誘導(dǎo)表達型工程菌：在細(xì)胞生長到一定階段，必需添加誘導(dǎo)物，以解除目標(biāo)(mùbiāo)基因的抑制狀態(tài)，活化基因，進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成產(chǎn)物。誘導(dǎo)物成為產(chǎn)物表達必不可少的。lac啟動子表達系統(tǒng)：IPTG誘導(dǎo)。甲醇營養(yǎng)型酵母：加入甲醇進行誘導(dǎo)。第十頁，共22頁。6.3.2培養(yǎng)(péiyǎng)工藝與控制溫度(wēndù)溶解氧pH第十一頁，共22頁。誘導(dǎo)表達型工程菌：在細(xì)胞生長到一定階段，必需添加誘導(dǎo)物，以解除目標(biāo)(mùbiāo)基因的抑制狀態(tài)，活化基因，進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成產(chǎn)物?；蚬こ檀竽c桿菌含有抗生素抗性基因，抗生素作為選擇(xuǎnzé)劑：卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、博來霉素等。細(xì)菌喜歡偏堿性：大腸桿菌適宜pH為6.3產(chǎn)物(chǎnwù)誘導(dǎo)表達與終點控制甲醇營養(yǎng)型酵母：加入甲醇進行誘導(dǎo)。釀酒酵母生長最適溫度30℃，最高溫度40℃。與信號肽序列融合，組成性分泌表達整合到染色體中，嚴(yán)謹(jǐn)控制，分泌表達分階段控制pH：根據(jù)試驗結(jié)果來確定(quèdìng)生長最適pH和產(chǎn)物最適pH，以達到最佳生產(chǎn)。一般情況下，目標(biāo)產(chǎn)物(chǎnwù)對宿主是不利的不同工程菌對氮源利用能力差別很大，具有很高的選擇性。甲醇營養(yǎng)型酵母：加入甲醇進行誘導(dǎo)。2培養(yǎng)(péiyǎng)工藝與控制干擾素是在酸性條件下穩(wěn)定，而在堿性條件下容易降解?；蚬こ檀竽c桿菌含有抗生素抗性基因，抗生素作為選擇(xuǎnzé)劑：卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、博來霉素等。2、溫度(wēndù)誘導(dǎo)表達1、溫度(wēndù)對工程菌生長的影響符合(fúhé)三基點原則：最低，最適，最高。大腸桿菌和釀酒酵母生長最低溫度10℃。大腸桿菌生長最適溫度37℃，最高溫度45℃。釀酒酵母生長最適溫度30℃，最高溫度40℃。第十二頁，共22頁。誘導(dǎo)時間：菌體生長的對數(shù)(duìshù)期或稍后一些，升高溫度，合成產(chǎn)物。了解發(fā)酵過程中各個階段的適宜pH以后，進一步設(shè)法控制pH在合適的范圍內(nèi)。3產(chǎn)物(chǎnwù)誘導(dǎo)表達與終點控制與信號肽序列融合，組成性分泌表達大腸桿菌：利用大分子有機氮源，酵母粉等。生長期維持(wéichí)37℃，生產(chǎn)期提高溫度42℃。當(dāng)產(chǎn)率最大時，結(jié)束發(fā)酵。細(xì)菌喜歡偏堿性：大腸桿菌適宜pH為6.酵母：利用氨基酸為氮源。細(xì)菌(xìjūn)：IPTG誘導(dǎo)高度嚴(yán)謹(jǐn)控制無毒蛋白的高水平表達生長與生產(chǎn)溫度不一致。較高溫度表達量大，易形成包涵體。策略：較低溫(dīwēn)度下有利于表達可溶性蛋白質(zhì)。對于熱敏感的蛋白質(zhì)，高溫會降解破壞。策略：生產(chǎn)期可采用先高溫，然后低溫(dīwēn)，變溫表達，避免蛋白質(zhì)降解。第十三頁，共22頁。兩端變溫發(fā)酵培養(yǎng)：前期：較高溫度發(fā)酵，獲得足夠高的菌體密度。后期：較低溫度發(fā)酵，對菌體合成目標(biāo)產(chǎn)物的抑制不明顯，但可有效抑制目標(biāo)產(chǎn)物的降解和包涵體形成，總體提高工程菌的生產(chǎn)能力。溫度誘導(dǎo)型大腸桿菌表達系統(tǒng)：生長期維持(wéichí)37℃，生產(chǎn)期提高溫度42℃。第十四頁，共22頁。2、pH值對發(fā)酵(fājiào)的影響細(xì)菌喜歡偏堿性：大腸桿菌適宜pH為6.5-7.5真菌喜歡微酸性：酵母適宜pH為5.0-6.0pH值影響產(chǎn)物穩(wěn)定性，最適生長和最適生產(chǎn)pH不同。干擾素是在酸性條件下穩(wěn)定，而在堿性條件下容易降解。酸性環(huán)境有利于發(fā)揮菌株生產(chǎn)能力。乙酸的產(chǎn)生(chǎnshēng)使菌體生長速率下降，也抑制基因表達。第十五頁，共22頁。了解發(fā)酵過程中各個階段的適宜pH以后，進一步設(shè)法控制pH在合適的范圍內(nèi)。分階段控制pH：根據(jù)試驗結(jié)果來確定(quèdìng)生長最適pH和產(chǎn)物最適pH，以達到最佳生產(chǎn)。第十六頁，共22頁。3、溶解氧工程菌是好氧微生物，生長過程需要大量氧。無氧呼吸會導(dǎo)致大量的能量消耗，同時產(chǎn)生有機酸，對細(xì)胞生長極為不利，甚至有毒害。從供應(yīng)量和需要量（菌體生長、質(zhì)粒穩(wěn)定性、產(chǎn)物積累）二個方面考慮，使之需氧不超過設(shè)備的供氧能力，在臨界溶解氧濃度(nóngdù)之上。調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量。第十七頁，共22頁。6.3.3產(chǎn)物誘導(dǎo)(yòudǎo)與終點控制一般情況下，目標(biāo)產(chǎn)物(chǎnwù)對宿主是不利的常用策略：誘導(dǎo)表達根據(jù)啟動子類型和目標(biāo)產(chǎn)物(chǎnwù)表達的調(diào)控模式而定當(dāng)產(chǎn)率最大時，結(jié)束發(fā)酵。第十八頁，共22頁。在生產(chǎn)(shēngchǎn)中應(yīng)嚴(yán)格控制適宜的誘導(dǎo)時間：非常重要誘導(dǎo)物的濃度及其發(fā)酵(fājiào)溫度，影響表達量，產(chǎn)物存在形式。第十九頁，共22頁。工程菌啟動子表達特點誘導(dǎo)條件大腸桿菌lac高度嚴(yán)謹(jǐn)控制蛋白的轉(zhuǎn)錄與表達IPTG大腸桿菌T7高度嚴(yán)謹(jǐn)控制無毒蛋白的高水平表達IPTG大腸桿菌PL、PR高度嚴(yán)謹(jǐn)轉(zhuǎn)錄控制有毒蛋白的表達高溫（42℃）大腸桿菌phoA與信號肽序列融合，組成性分泌表達無需誘導(dǎo)釀酒酵母GAL高拷貝附加質(zhì)粒，嚴(yán)謹(jǐn)控制，分泌系統(tǒng)半乳糖畢赤酵母AOX1整合到染色體中，嚴(yán)謹(jǐn)控制，分泌表達甲醇畢赤酵母GAP組成性分泌表達無需誘導(dǎo)第二十頁，共22頁。1、化學(xué)誘導(dǎo)(yòudǎo)表達