生物制藥第四章課件

2010年6月

生物制藥溫州醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院王慧利2010年6月

生物制藥溫州醫(yī)學(xué)院1內(nèi)容第一章緒論第二章生物藥物概論

第三章生物制藥工藝學(xué)第四章基因工程制藥第五章

抗體工程制藥第六章動(dòng)物細(xì)胞制藥

第七章植物細(xì)胞制藥第八章酶工程制藥

第九章海洋生物制藥

第十章利用現(xiàn)代生物技術(shù)改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)內(nèi)容第一章緒論2第四章基因工程制藥第一節(jié)基因工程概念，歷史和基本原理第二節(jié)基因工程用到的酶，載體第三節(jié)基因工程技術(shù)環(huán)節(jié)和常用技術(shù)1目的基因獲得2目的基因與載體連接3外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞4重組子的鑒定和篩選5常用技術(shù)第四節(jié)基因工程在制藥中的應(yīng)用1重組藥物2轉(zhuǎn)基因動(dòng)（植）物

第四章基因工程制藥第一節(jié)基因工程概念，歷史和基本原理3（一）基因工程（geneengineering）的概念

又稱為遺傳工程、重組DNA技術(shù)，是按著人們的科研或生產(chǎn)需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遺傳物質(zhì)（DNA片段），在體外切割，拼接形成重組DNA,然后將重組DNA與載體重新組合，再將其引入到?jīng)]有該DNA的受體細(xì)胞中，進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，生產(chǎn)出符合人類(lèi)需要的產(chǎn)品或創(chuàng)造出生物的新性狀，并使之穩(wěn)定地遺傳給下一代。按目的基因的克隆和表達(dá)系統(tǒng)，分為原核生物基因工程，酵母基因工程，植物基因工程和動(dòng)物基因工程。基因工程具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)開(kāi)辟了新的應(yīng)用途徑，也為遺傳病的診斷和治療提供了有效方法?；蚬こ踢€可應(yīng)用于基因的結(jié)構(gòu)，功能與作用機(jī)制的研究，有助于生命起源和生物進(jìn)化等重大問(wèn)題的探討。

第一節(jié)基因工程概念發(fā)展歷史和基本原理（一）基因工程（geneengineering）的概念第一4基因工程有兩個(gè)重要的特征第一是可把來(lái)自任何生物的基因轉(zhuǎn)移到與其毫無(wú)關(guān)系的任何其他受體細(xì)胞中，因此可以實(shí)現(xiàn)按照人們的愿望，改造生物的遺傳特性，創(chuàng)造出生物的新性狀；第二是某一段DNA可在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，為準(zhǔn)備大量純化的DNA片段提供了可能，拓寬了分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域。

基因工程誕生的意義：基因工程的誕生打破了物種的界限，實(shí)現(xiàn)了物種間的基因交流;在實(shí)驗(yàn)室里對(duì)生物直接進(jìn)行改造，為生命科學(xué)的研究開(kāi)辟了新的領(lǐng)域、注入了新的方法;為提高人類(lèi)的生活質(zhì)量和健康水平開(kāi)辟了新的途徑，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用前景.基因工程有兩個(gè)重要的特征

基因工程誕生的意義：51基因工程誕生的理論基礎(chǔ)（理論上的三大發(fā)現(xiàn)）（1）40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，從而明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問(wèn)題；（2）50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制，解決了基因的自我復(fù)制和傳遞的問(wèn)題；（3）50年代末期和60年初，相繼提出了中心法則和操縱子學(xué)說(shuō)，并成功的破譯了遺傳密碼，從而闡明了遺傳信息的流向和表達(dá)問(wèn)題。

（二）基因工程發(fā)展歷史1基因工程誕生的理論基礎(chǔ)（理論上的三大發(fā)現(xiàn)）（二）基因工6

1）限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)1970年當(dāng)時(shí)在Wisconsin大學(xué)的H.G.Khorana實(shí)驗(yàn)室的一個(gè)小組，發(fā)現(xiàn)T4DNA連接酶具有更高的連接活性，有時(shí)甚至能催化完全分離的兩段DNA分子進(jìn)行末端的連接。1972年在舊金山H.W.Boyer實(shí)驗(yàn)室首先發(fā)現(xiàn)的EcoRI核酸內(nèi)切限制酶具有特別重要的意義。HindⅢ的發(fā)現(xiàn)打破了基因工程的禁錮，1967年在世界上有5個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶。2）載體的發(fā)現(xiàn)因?yàn)槎鄶?shù)重組DNA片段不具備自我復(fù)制的能力，需要一個(gè)運(yùn)送重組DNA分子到細(xì)胞中去的車(chē)子——載體（vector），載體是特定的能自我復(fù)制的DNA分子。3）逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)1970年，Baltimore和Temin等同時(shí)各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶,打破了中心法則，使真核基因的制備成為可能。2技術(shù)上的三大發(fā)明DNA分子切割與連接技術(shù)的建立構(gòu)成現(xiàn)代基因工程的技術(shù)核心!!!

1）限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)2技術(shù)上的三大發(fā)明7

（1）在70年代，將外源DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象獲得成功，1972年斯坦福大學(xué)的S.Cohen等人報(bào)道，經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌細(xì)胞同樣也能夠攝取質(zhì)粒的DNA,從此，大腸桿菌便成了分子克隆的良好的轉(zhuǎn)化受體。不到四年，世界上第一家基因工程公司“Genetech”注冊(cè)登記，意味著基因工程的實(shí)際應(yīng)用已跨入商業(yè)運(yùn)作的門(mén)檻。(2)1972年美國(guó)斯坦福大學(xué)的Berg獲得了SV40和λDNA重組的DNA分子，率先完成了世界上第一次成功的DNA體外重組實(shí)驗(yàn)，并因此與W.Gilbert,F.Sanger分享了1980年度的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)(3)1973年美國(guó)斯坦福大學(xué)的Cohen等人，將大腸桿菌R6-5質(zhì)粒DNA（含卡那霉素抗性基因）和大腸桿菌pSC101質(zhì)粒DNA（含四環(huán)素素抗性基因）重組后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，產(chǎn)生同時(shí)表現(xiàn)出兩種抗性的細(xì)菌。(4)Cohen與Boyer等合作，將非洲爪蟾編碼核糖體的基因同pSC101質(zhì)粒構(gòu)成重組DNA分子，并導(dǎo)入大腸桿菌，證實(shí)動(dòng)物基因進(jìn)入了細(xì)菌細(xì)胞，并在細(xì)菌細(xì)胞中增殖和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生相應(yīng)的mRNA。(5)BergP、Cohen和Boyer等人的工作在世界上最早實(shí)現(xiàn)了DNA體外重組，建立了第一個(gè)基因克隆系統(tǒng)（質(zhì)?！竽c桿菌），導(dǎo)致了一個(gè)全新的生物技術(shù)學(xué)科和產(chǎn)業(yè)——基因工程的誕生。

3基因工程技術(shù)的建立

（1）在70年代，將外源DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象獲84DNA測(cè)序技術(shù)的建立進(jìn)一步促進(jìn)了基因工程的發(fā)展在分子生物學(xué)研究中，DNA的序列分析是進(jìn)一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ)。目前用于測(cè)序的技術(shù)主要有Sanger（1977）發(fā)明的雙脫氧核糖核酸鏈末端終止法，目前Sanger測(cè)序法得到了廣泛的應(yīng)用。Sanger法是根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開(kāi)始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，并且在每個(gè)堿基后面進(jìn)行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長(zhǎng)度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得可見(jiàn)的DNA堿基序列。

Sanger法測(cè)序的原理就是，每個(gè)反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之?dāng)U增，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)使之終止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基團(tuán)，使延長(zhǎng)的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止，終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對(duì)濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長(zhǎng)幾個(gè)至千以上個(gè)，相差一個(gè)堿基一系列片斷。它們具有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的的核苷酸上，可通過(guò)高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。4DNA測(cè)序技術(shù)的建立進(jìn)一步促進(jìn)了基因工程的發(fā)展在分子生物9（三）基因工程基本原理和流程按設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，從供體中提取或人工合成目的基因，利用限制性內(nèi)切核酸酶和連接酶的性質(zhì)，對(duì)基因片段和載體質(zhì)粒進(jìn)行切割和連接，建成重組DNA，再轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，目的基因在細(xì)胞中表達(dá)獲得新的遺傳性狀（三）基因工程基本原理和流程按設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，從供體中提取或人工10生物制藥第四章課件11第二節(jié)

基因工程中常用的工具酶和載體一、限制性內(nèi)切酶

○基因工程中常用作用于核酸的酶，包括水解酶、修飾酶、聚合酶等水解酶分為內(nèi)切酶和外切酶

○內(nèi)切酶在核酸鏈內(nèi)部切割，生成寡核苷酸；外切酶從核酸鏈的末端開(kāi)始，漸進(jìn)式地水解核酸鏈，逐漸釋放單核苷酸。（一）基因工程中常用的工具酶第二節(jié)

基因工程中常用的工具酶和載體一、限制性內(nèi)切酶

12限制性內(nèi)切核酸酶

(restrictionenzymes)能識(shí)別雙鏈DNA分子中一段特異的核苷酸序列，在這一段序列內(nèi)將雙鏈DNA分子切斷。功能：與甲基化酶一起降解外來(lái)DNA分子，以限制(restriction)或阻止病毒侵染，是細(xì)菌細(xì)胞為防御異源遺傳物質(zhì)進(jìn)入的一種有效方式。限制性內(nèi)切核酸酶

(restrictionenzymes)13限制性內(nèi)切酶分類(lèi)第Ⅰ類(lèi)限制性酶：每隔一段DNA序列隨機(jī)切割雙鏈DNA分子，沒(méi)有序列特異性第Ⅱ類(lèi)限制性酶：能識(shí)別一段特異的DNA序列，準(zhǔn)確地酶切雙鏈DNA的特異序列A：形成粘性末端產(chǎn)物：識(shí)別的序列是對(duì)稱的，即在一條鏈中從5’到3’方向的序列，與其互補(bǔ)鏈從5’到3’方向的序列完全相同。這種從兩個(gè)方向閱讀而序列相同的序列稱為回紋對(duì)稱序列(palindrome)（EcoRⅠ）B：形成平端產(chǎn)物：另一類(lèi)酶，如SmaⅠ，它們酶切DNA雙鏈后，產(chǎn)生的DNA片段具有平齊末端(bluntends)限制性內(nèi)切酶分類(lèi)第Ⅰ類(lèi)限制性酶：每隔一段DNA序列隨機(jī)切割雙14限制性酶EcoRI識(shí)別位點(diǎn)（粘性末端）限制性酶EcoRI識(shí)別位點(diǎn)（粘性末端）15EcoRI酶切不同來(lái)源的DNA及退火重組EcoRI酶切不同來(lái)源的DNA及退火重組16平齊末端（SmaⅠ）平齊末端（SmaⅠ）17限制性內(nèi)切酶的命名屬名＋種名＋菌株類(lèi)型＋發(fā)現(xiàn)的順序限制性內(nèi)切酶的命名屬名＋種名＋菌株類(lèi)型＋發(fā)現(xiàn)的順序18DNA聚合酶的特性DNA聚合酶的特性19

該酶的用途是將帶匹配黏端的雙鏈DNA或平端雙鏈DNA片段的5’-P與另一也帶相應(yīng)缺口的DNA片段的3′-OH連接起來(lái)

三、DNA連接酶

3’5‘5’3‘OHPPOH3’5‘5’3‘OPPODNA連接酶

該酶的用途是將帶匹配黏端的雙鏈DNA或平端雙鏈DNA片段的20不匹配黏端的連接先補(bǔ)平或修平后再連接3‘5‘5‘3‘補(bǔ)平修平Klenow(S1或Klenow)不匹配黏端的連接先補(bǔ)平或修平后再連接3‘5‘5‘3‘補(bǔ)平21（二）

基因工程載體

●載體是指將外源DNA片段運(yùn)送進(jìn)宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的運(yùn)載工具

●克隆載體——克隆了外源DNA后，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖，使克隆的DNA片段數(shù)量大大增加

●表達(dá)載體——將外源基因或DNA片段在宿主細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)

○插入型載體——將外源基因或DNA插入其中

○置換型載體——切除載體部分DNA，代之以外源基因或DNA。（二）

基因工程載體

●載體是指將外源DNA片段運(yùn)送22載體必須具備的條件1、能自我復(fù)制：能在宿主細(xì)胞中大量復(fù)制，得到大量的重組DNA分子2、多克隆位點(diǎn)：載體上的內(nèi)切酶位點(diǎn)對(duì)于一種酶來(lái)說(shuō)只能有一個(gè)（置換型載體上被置換片段的兩側(cè)各有一個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)）3、克隆載體要有復(fù)制起點(diǎn)，表達(dá)載體要有啟動(dòng)子4、載體上要有報(bào)告基因或選擇標(biāo)記基因，以便進(jìn)行重組體篩選和鑒定5、在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高且多拷貝。保證重組體穩(wěn)定，高效傳代而不丟失載體必須具備的條件1、能自我復(fù)制：能在宿主細(xì)胞中大量復(fù)制23

一、質(zhì)粒載體

○質(zhì)粒是一種存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中，獨(dú)立于細(xì)菌染色體而自然存在的，在細(xì)菌體內(nèi)能進(jìn)行自我復(fù)制、易分離和導(dǎo)入的DNA環(huán)狀雙鏈分子

○質(zhì)粒大小相差很大（從小于1Kb到大于500Kb），都有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。

○親緣關(guān)系密切的兩種質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地共存，稱為質(zhì)粒的不親和性。

○只能在特定宿主細(xì)胞中復(fù)制的稱為窄宿主范圍質(zhì)粒；可以在多種宿主細(xì)胞中復(fù)制的稱為廣宿主范圍質(zhì)粒。

一、質(zhì)粒載體

○質(zhì)粒是一種存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)24

●嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)?！總€(gè)細(xì)胞中有1-2個(gè)拷貝，具有自身傳遞能力，分子量大。

●松弛型質(zhì)?！總€(gè)細(xì)胞中有10-100個(gè)拷貝，不具有自身傳遞能力，分子量小?；蚬こ坛Ｓ么祟?lèi)質(zhì)粒?！鸪Ｓ玫馁|(zhì)粒有：pBR322、Psc101、ColE1、Psc134等。○質(zhì)粒載體一般能克隆10Kb左右的DNA片段?？寺≥d體表達(dá)載體●嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)?！總€(gè)細(xì)胞中有1-2個(gè)拷貝，具有自身傳25基因工程制藥的關(guān)鍵技術(shù)獲得目的基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒產(chǎn)物分離純化構(gòu)建基因工程菌或細(xì)胞培養(yǎng)工程菌半成品和成品鑒定及包裝除菌過(guò)濾基因工程制藥流程：上游技術(shù)下游技術(shù)上游DNA重組設(shè)計(jì)下游的操作工藝和設(shè)備原則簡(jiǎn)化一、基因工程菌的上游構(gòu)建包括外源基因重組、克隆、表達(dá)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建基因工程制藥的關(guān)鍵技術(shù)獲得目的基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒產(chǎn)物26（一）PCR的原理和應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR）1．原理特點(diǎn)：在體外模擬細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的DNA復(fù)制過(guò)程（Mullis，1984）第三節(jié)基因工程技術(shù)環(huán)節(jié)和常用技術(shù)（一）PCR的原理和應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymeras27（一）PCR的原理和應(yīng)用（一）PCR的原理和應(yīng)用28（1）變性（denaturation）：模板DNA經(jīng)熱變性，雙鏈被解開(kāi)，成為兩條單鏈。（2）退火（annealing）：溫度下降，變性DNA復(fù)姓，使寡核苷酸引物即與模板DNA中所要擴(kuò)增序列兩端的堿基配對(duì)。1．原理（3）延伸（extension）：

在適宜條件下（包括DNA聚合酶和核苷酸單體），引物3端向前延伸，合成與模板堿基序列完全互補(bǔ)的DNA鏈。（4）重復(fù)變性、退火和延伸三步操作：DNA片段呈2的指數(shù)增長(zhǎng)，在1－2小時(shí)內(nèi)重復(fù)25－30次循環(huán)，擴(kuò)增的DNA片段拷貝數(shù)可增加至106～107倍。（1）變性（denaturation）：模板DNA經(jīng)熱變性，292.PCR技術(shù)的關(guān)鍵酶DNA聚合酶（1）Klenow聚合酶（大腸桿菌DNA聚合酶片段）（2）TaqDNA聚合酶（水生棲熱菌（Thermusaquaticus）中分離，1988年薩奇（R.K.SaiKi））（3）pfuDNA聚合酶（火球菌（PyrococcusFuriosus）中分離）（4）VentDNA聚合酶（Thermococcuslitoralis）2.PCR技術(shù)的關(guān)鍵酶DNA聚合酶（1）Kle30

（二）

目的基因的獲取

●利用PCR克隆目的基因

1、常規(guī)的PCR·2、反向PCR（inversePCR,I-PCR）克隆基因組DNA片段，I-PCR是根據(jù)已知序列擴(kuò)增其旁側(cè)序列的方法。所用的引物與正常的PCR引物方向相反

3、反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)合成cDNA

·RT-PCR是以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，再?gòu)?fù)制成雙鏈DNA（二）

目的基因的獲取

●利用PCR克31

●

基因的人工合成

○如果已知某基因的核苷酸序列，或者通過(guò)基因產(chǎn)物的氨基酸序列推導(dǎo)出基因的核苷酸序列，就可將單核苷酸或寡核苷酸一個(gè)一個(gè)縮合起來(lái)，成為一個(gè)基因的核苷酸序列。連接的兩個(gè)分子各有一端被封閉。

○先合成分別屬于雙鏈序列的8-12堿基的片段，兩個(gè)片段的對(duì)應(yīng)部分配對(duì)后留有粘性末端，第三個(gè)片段再連接上去，不斷延伸直至全部合成●基因的人工合成

○如果已知某基因的核苷酸序列，或32

（二）載體與基因的連接

常用的連接方式有：粘性末端連接法、平頭末端連接法、人工接頭連接法、同聚物加尾連接法。

（一）粘性末端連接法

○相同限制酶切位點(diǎn)連接法

同一的限制酶切割不同DNA會(huì)產(chǎn)生相同的粘性末端，在連接酶的作用下，不同DNA相同的粘性末端形成磷酸二酯鍵而連接起來(lái)平頭末端連接法、人工接頭連接法、同聚物加尾連接法。

（二）載體與基因的連接平頭末端連接法33RT-PCR反向-PCRRT-PCR反向-PCR34

●化學(xué)轉(zhuǎn)化法

利用氯化鈣誘導(dǎo)細(xì)胞（原核）進(jìn)入感受態(tài)，外源DNA直接與感受態(tài)細(xì)胞混合，處于感受態(tài)的細(xì)胞可以吸收外來(lái)的DNA?！耠娹D(zhuǎn)移法

受體細(xì)胞與外源DNA按一定比例混合后，放入電脈沖槽中，經(jīng)用脈沖電壓刺激，外源DNA即可進(jìn)入細(xì)胞（三）外源DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞（基因轉(zhuǎn)移）

不需載體的基因轉(zhuǎn)移 ●化學(xué)轉(zhuǎn)化法（三）外源DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞（基因轉(zhuǎn)移）

35生物制藥第四章課件36生物制藥第四章課件37

●脂質(zhì)體介導(dǎo)法·脂質(zhì)體是磷脂在水中形成的一種由脂類(lèi)雙分子層圍成的囊狀結(jié)構(gòu)

·形成囊狀結(jié)構(gòu)可將DNA包在其中

·帶有外源DNA的脂質(zhì)體通過(guò)細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入受體細(xì)胞，達(dá)到基因轉(zhuǎn)移的目的●血影細(xì)胞介導(dǎo)法

·血影細(xì)胞：哺乳動(dòng)物細(xì)胞溶血，使血紅蛋白大量逸出，最后成為僅有被細(xì)胞膜包被的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)

·血紅蛋白大量逸出時(shí)，外源DNA也容易進(jìn)入。讓血影細(xì)胞與受體細(xì)胞在適當(dāng)條件下發(fā)生細(xì)胞融合，從而使外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞●

磷酸鈣沉淀法

·細(xì)胞具有攝取磷酸鈣沉淀的雙鏈DNA的能力

·將待轉(zhuǎn)移的DNA加入氯化鈣和磷酸鹽，生成DNA-磷酸鈣沉淀，加入培養(yǎng)液中

·由于細(xì)胞的吞噬作用，DNA-磷酸鈣沉淀物進(jìn)入細(xì)胞，DNA釋出后先進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)、再進(jìn)入細(xì)胞核，整合到受體細(xì)胞的染色體上 ●脂質(zhì)體介導(dǎo)法38Polyethylenimine-basednon-viralgenedeliverysystems化學(xué)試劑介導(dǎo)基因進(jìn)入細(xì)胞非病毒載體聚次乙亞胺Polyethylenimine-basednon-vir39脂質(zhì)體包埋法非病毒載體脂質(zhì)體包埋法非病毒載體40

主要是以重組的動(dòng)物病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒直接感染受體細(xì)胞，把外源DNA引入轉(zhuǎn)導(dǎo)作用：通過(guò)噬菌體和病毒的感染作用將一個(gè)細(xì)胞的遺傳信息傳遞到另一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。逆轉(zhuǎn)錄病毒的特點(diǎn)：

·病毒基因組為單鏈RNA，感染期間為雙鏈DNA

·DNA能整合進(jìn)細(xì)胞并復(fù)制

·DNA在動(dòng)物通過(guò)生殖細(xì)胞傳遞到下一代；·帶有對(duì)復(fù)制有重要意義的基因：gag（結(jié)構(gòu)蛋白）、pol（DNA聚合酶）、env（被膜糖蛋白）借助于載體的基因轉(zhuǎn)移

●

主要是以重組的動(dòng)物病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒直接感染受體細(xì)41腺相關(guān)病毒3其中最被看好的是腺相關(guān)病毒

病毒基因組很小，如2型腺相關(guān)病毒是由4681個(gè)核苷酸組成的單鏈DNA，AAV可感染分裂期及靜止期細(xì)胞，當(dāng)輔助病毒不存在時(shí)，AAV能整合到宿主細(xì)胞基因組的特定區(qū)域，無(wú)致病性，免疫原性弱，因此，它無(wú)毒高效，是目前理想的基因治療載體。腺相關(guān)病毒3其中最被看好的是腺相關(guān)病毒42

（四）重組體的鑒定與篩選一、根據(jù)重組子遺傳重組表性改變檢測(cè)法

1、抗性篩選法

利用載體上的抗性基因?qū)﹃?yáng)性克隆作初步的篩選。如pUC19質(zhì)粒中有Ampr基因，為宿主細(xì)胞提供氨芐青霉素抗性。

將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)——

·大部分受體細(xì)胞沒(méi)有外源DNA導(dǎo)入，其本身又沒(méi)有Ampr基因，所以在培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。

·在含有外源DNA的受體細(xì)胞中，只有含有質(zhì)粒自連或者質(zhì)粒與目的DNA形成重組子的受體細(xì)胞由于含Ampr基因，能在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

（四）重組體的鑒定與篩選432、根據(jù)報(bào)告基因篩選克隆子對(duì)于那些不宜采用克隆載體選擇標(biāo)記篩選克隆子的宿主細(xì)胞，往往在目的基因連入載體之前，先在目的基因的上下游連接一個(gè)報(bào)告基因，這樣導(dǎo)入宿主細(xì)胞后可根據(jù)報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物篩選克隆子。2、根據(jù)報(bào)告基因篩選克隆子44

3、插入失活選擇法

·當(dāng)外源DNA插入到載體的某一基因中間時(shí)，該基因就不能表達(dá)，這種現(xiàn)象稱為插入失活。

·例如，pBR322有四環(huán)素抗性基因（Tetr）和氨芐青霉素抗性基因（Ampr），在Tetr基因內(nèi)有BamHⅠ和SalⅠ兩種限制酶位點(diǎn)，如果在這兩個(gè)位點(diǎn)中有外源DNA插入，都會(huì)導(dǎo)致Tetr基因失活。

·將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞分別培養(yǎng)在含氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基中，便可檢出轉(zhuǎn)化子細(xì)胞。例如，a-互補(bǔ)使菌產(chǎn)生顏色來(lái)篩選

3、插入失活選擇法

·當(dāng)外源DNA插入45生物制藥第四章課件46生物制藥第四章課件47

（五）轉(zhuǎn)化子-核酸分子鑒定法1）瓊脂糖凝膠電泳法：根據(jù)重組DNA分子的大小，其遷移率的差別進(jìn)行鑒定

（五）轉(zhuǎn)化子-核酸分子鑒定法482）限制性內(nèi)切酶分析法：根據(jù)片段的大小和酶譜特征與預(yù)計(jì)的重組DNA酶譜特征比較。2）限制性內(nèi)切酶分析法：根據(jù)片段的大小和酶譜特征與預(yù)計(jì)的重組493）印跡雜交法○Southernblot(Southern印跡試驗(yàn))原理——利用硝酸纖維薄膜（或?yàn)V紙、尼龍膜）具有吸附DNA的功能，先作DNA凝膠電泳，并將凝膠電泳的DNA區(qū)帶吸附到膜上，然后在膜上進(jìn)行同位素標(biāo)記探針與被測(cè)樣品只間的雜交，在通過(guò)放射自顯影對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)?！餘orthern雜交：制備目的基因DNA探針，變性后同克隆子總的RNA雜交。若出現(xiàn)明顯的信號(hào)，可以認(rèn)定進(jìn)入宿主細(xì)胞的目的基因轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的RNA3）印跡雜交法504）原位雜交：可分為克隆和噬菌斑原為雜交，二者的原理相同：轉(zhuǎn)化后得到的菌落和噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，可得到一個(gè)與平板菌落或噬菌斑分布完全一致的復(fù)制品，進(jìn)行菌落裂解、DNA變性、中和、接下來(lái)用放射性核素標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，洗滌移去多余的探針，將濾膜干燥后放射自顯影，可得到雜交陽(yáng)性的菌落或噬菌斑。5）蛋白質(zhì)印跡方法westernblotting：SDS轉(zhuǎn)膜與放射性核素或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的抗體結(jié)合，通過(guò)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，在雜交膜上顯示出明顯信號(hào)，表明宿主中有目的基因的表達(dá)4）PCR法4）原位雜交：可分為克隆和噬菌斑原為雜交，二者的原理相同：轉(zhuǎn)51

6）序列分析法

測(cè)序分手工測(cè)序和自動(dòng)測(cè)序?！な止y(cè)序有雙脫氧測(cè)序法和化學(xué)測(cè)序法，前者廣泛使用。

·自動(dòng)測(cè)序可用全自動(dòng)化的DNA序列測(cè)序儀準(zhǔn)確快速測(cè)定DNA序列。○DNA自動(dòng)測(cè)序

·DNA自動(dòng)測(cè)序儀根據(jù)Sanger的酶促反應(yīng)原理，用4種熒光染料標(biāo)記引物，這4種熒光在受到激光照射時(shí)會(huì)發(fā)出可以辯別的不同顏色。

6）序列分析法

測(cè)序分手工測(cè)序和自動(dòng)測(cè)序。○52與PCR反應(yīng)類(lèi)似。反應(yīng)體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和測(cè)序引物；反應(yīng)過(guò)程：變性－復(fù)性－延伸－終止Sanger雙脫氧終止法與PCR反應(yīng)類(lèi)似。Sanger雙脫氧終止法53*少一個(gè)－OH脫氧核甘酸與雙脫氧核甘酸結(jié)構(gòu)比較*少一個(gè)－OH脫氧核甘酸54Dideoxynucleotides

（雙脫氧核苷酸）ddNTPs是反應(yīng)終止劑可以當(dāng)作正常堿基參與復(fù)制，一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。反應(yīng)體系中dNTPs的濃度遠(yuǎn)高于ddNTPs(一般1：3~4)。Dideoxynucleotides

（雙脫氧核苷酸）ddN55新生鏈隨機(jī)終止GGATCCGGGATTCCＧＧＡＴＡＡ模板CCT●CCTA●CCTAG●CCTAGG●CCTAGGC●CCTAGGCC●

CCTAGGCCC●

CCTAGGCCCT●

CCTAGGCCCTA●

在鏈延伸過(guò)程中，鏈終止劑會(huì)隨機(jī)插入，從而導(dǎo)致鏈延伸的隨機(jī)終止，形成長(zhǎng)短不等的片段，這些片段共同特征是末端是帶不同熒光的終止劑。測(cè)序反應(yīng)：新生鏈隨機(jī)終止GGATCCGG56Sanger測(cè)序熒光檢測(cè)探頭電泳，看誰(shuí)跑得快1各色熒光的終止劑，可以分別取代相應(yīng)的dNTP2測(cè)序反應(yīng)中，終止劑隨機(jī)插入導(dǎo)致鏈終止3毛細(xì)管電泳（可分辨一個(gè)堿基差別），按大小分開(kāi)，短片段跑得快，會(huì)首先被檢測(cè)到，監(jiān)測(cè)器會(huì)檢測(cè)記錄相應(yīng)得熒光信號(hào)4給出序列Sanger測(cè)序熒光檢測(cè)探頭電泳，看誰(shuí)跑得快1各色熒光的終57Sanger第二步：熒光檢測(cè)Sanger第二步：熒光檢測(cè)581）大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建突出的優(yōu)點(diǎn)：①遺傳背景清晰；②能以廉價(jià)培養(yǎng)基高速生產(chǎn)和高密度發(fā)酵；③克隆載體和宿主菌選擇范圍廣。缺點(diǎn)：缺乏翻譯后修飾與加工，蛋白質(zhì)表達(dá)信號(hào)肽不能被切掉，不能分泌表達(dá)，不能糖基化。2）酵母基因工程菌的構(gòu)建特點(diǎn)：①細(xì)胞壁厚，轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)要提取原生質(zhì)球；②對(duì)多種抗生素不敏感一般采用某些營(yíng)養(yǎng)缺陷性遺傳標(biāo)志篩選重組體；③外源基因重組到穿梭質(zhì)粒載體中，利于外源基因在酵母菌中的表達(dá)和操作。④具有對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行加工，修飾、合理的空間折疊等功能，非常利于真核基因的表達(dá)。3）哺乳動(dòng)物細(xì)胞工程細(xì)胞的構(gòu)建優(yōu)點(diǎn)：①具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)的糖基化蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面，最接近于天然蛋白分子；②具有產(chǎn)物胞外分泌功能，便于下游產(chǎn)物分離純化；③具有重組基因的高效擴(kuò)增和表達(dá)能力④具有貼壁生長(zhǎng)特性，具有較強(qiáng)的耐剪切力和滲透壓力。（五）目的產(chǎn)物的表達(dá)與生產(chǎn)1）大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建（五）目的產(chǎn)物的表達(dá)與生產(chǎn)59

●

基因克隆與基因組文庫(kù)的構(gòu)建

○基因組文庫(kù)的概念

·需要將某種生物全部基因組的遺傳信息，儲(chǔ)存在可以長(zhǎng)期保存的、穩(wěn)定的重組體中，以便需要時(shí)即可應(yīng)用。這種保存基因組信息的材料，稱為基因文庫(kù)。

·當(dāng)需要某一目的基因時(shí)，就可在基因組文庫(kù)尋找，一般采用核酸探針的方法，從文庫(kù)中“釣出”某基因?！窕蚩寺∨c基因組文庫(kù)的構(gòu)建

○基因組文庫(kù)的概念

60

●基因組文庫(kù)的構(gòu)建

1．DNA片段的制備分離純化基因組DNA——用限制酶完全酶切或部分酶切

2．DNA片段與載體的連接選擇合適的載體

3．體外包裝和基因組文庫(kù)的擴(kuò)增包裝入噬菌體進(jìn)行感染，或轉(zhuǎn)化使質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞

4．重組DNA的篩選和鑒定

●基因組文庫(kù)的構(gòu)建

1．DNA片段的制備61...............EnzymedigestionIntroduceDNAinto

E.

coliSelectiononantibiotic-containingmediumScreeningbyhybridizationStreptomycesDNA

DNAcarryingtargetgenes基因組文庫(kù)的構(gòu)建1總DNA提取2隨機(jī)酶切3與載體連接4轉(zhuǎn)化大腸桿菌5篩選轉(zhuǎn)化子6轉(zhuǎn)移至96空板7雜交確定陽(yáng)性克隆ABC123456789101112DFGHIEnzymedigestio62第四節(jié)基因工程在醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用

第四節(jié)基因工程在醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用

63（一）重組藥物的研究1重組人胰島素Humulin●關(guān)于胰島素：胰島素是由51個(gè)氨基酸組成的雙鏈多肽激素，分子量為5734道爾頓，A鏈有21個(gè)氨基酸；B鏈有30個(gè)氨基酸。是人體降低血糖的唯一激素），重組胰島素是第一個(gè)重組藥物蛋白類(lèi)藥物，：（1982年美國(guó)批準(zhǔn)第一個(gè)重組蛋白藥物（重組人胰島素Humulin）優(yōu)泌林胰島素的結(jié)構(gòu)（一）重組藥物的研究1重組人胰島素Humulin●關(guān)于胰島64（一）重組藥物的研究●重組人胰島素－－由人胰島素基因在異源細(xì)胞中表達(dá)出來(lái)，和人體分泌的胰島素結(jié)構(gòu)完全相同，發(fā)揮自然來(lái)源的胰島素相同的功能（降低血糖的唯一激素）●技術(shù)路線：胰島素基因（人源，動(dòng)物源）連接到大腸桿菌載體上，在大腸桿菌中表達(dá)出來(lái)多肽1重組人胰島素Humulin（一）重組藥物的研究●重組人胰島素－－由人胰島素基因在異源細(xì)65胰島素作為治療糖尿病的特效和首選藥物，到目前為止已經(jīng)歷了三代的歷史演變：

第一代產(chǎn)品從豬和牛等動(dòng)物胰臟提取而來(lái)。由于異源性過(guò)敏反應(yīng)，該類(lèi)產(chǎn)品療效較差，在發(fā)達(dá)國(guó)家已被淘汰，目前該品在我國(guó)也僅出現(xiàn)在低端市場(chǎng)。

第二代產(chǎn)品為重組人胰島素。從人類(lèi)細(xì)胞中獲取胰島素基因，然后將其插入酵母菌或大腸桿菌等細(xì)菌中進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)復(fù)雜的復(fù)性和酶性等現(xiàn)代化生物基因技術(shù)生產(chǎn)而成，包括常規(guī)人胰島素(R)、中效人胰島素（低魚(yú)精蛋白鋅胰島素）、魚(yú)精蛋白鋅胰島素（PZI）和預(yù)混胰島素（30R、50R）等。

第三代為胰島素類(lèi)似物，通過(guò)對(duì)人的胰島素基因進(jìn)行改構(gòu)獲得。胰島素類(lèi)似物起效更快，作用更持久，完全模擬生理性胰島素分泌模式。胰島素作為治療糖尿病的特效和首選藥物，到目前為止已經(jīng)歷了三代66二、基因工程新型藥物簡(jiǎn)介

2人生長(zhǎng)激素（Humangrowthhormone,hGH）主要用途是治療侏儒癥，臨床試驗(yàn)認(rèn)為對(duì)慢性腎功能衰竭和Turner綜合癥也有很好療效。3干擾素(Interferon，IFN)干擾素是一類(lèi)在同種細(xì)胞上具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)，是一種類(lèi)似多肽激素的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)物質(zhì)，是—種細(xì)胞素。干擾素在臨床上主要用于治療惡性腫瘤和病毒性疾病。4白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)白細(xì)胞介素是一類(lèi)重要的免疫調(diào)節(jié)劑。目前已發(fā)現(xiàn)的白細(xì)胞介素已達(dá)15種之多，它們的生物學(xué)功能十分廣泛。白細(xì)胞介素在臨床上主要用于治療惡性腫瘤和病毒性疾病(如乙型肝炎、艾滋病等)。二、基因工程新型藥物簡(jiǎn)介2人生長(zhǎng)激素（Humangro675集落刺激因子（Colony-stimulatingfactor,CSF）集落刺激因子是一類(lèi)能參與造血調(diào)節(jié)過(guò)程的糖蛋白分子，故又稱造血刺激因子或造血生長(zhǎng)因子。近年來(lái)的研究表明，CSF不僅在造血細(xì)胞的增殖與分化中起重要作用，而且也參與對(duì)成熟細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)，并在宿主抗感染免疫中起著重要作用。CSF在臨床上多用作癌化療的輔佐藥物，如化療后產(chǎn)生的中性白細(xì)胞減少癥，也用于骨髓移植促進(jìn)生血作用，還可用于治療白血病、粒細(xì)胞缺乏癥、再生障礙貧血等多種疾病。6促紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin,EPO）促紅細(xì)胞生成素是一種由腎臟分泌的重要激素，在病理狀態(tài)下，與多種貧血尤其與終末期腎臟疾病貧血密切相關(guān)，在生理情況下，它能促進(jìn)紅細(xì)胞系列的增殖、分化及成熟。臨床上治療慢性腎功能衰竭引起的貧血和治療腫瘤化療后貧血。7腫瘤壞死因子（Tumornecrosisfactou,TNF）TNF除具有抗腫瘤活性外，對(duì)多種正常細(xì)胞還具有廣泛的免疫生物學(xué)活性，臨床上用于治療某些惡性腫瘤，用于臨床診斷。5集落刺激因子（Colony-stimulatingfa688組織型纖溶酶原激活劑（Tissue-typeplasminogenactivator,tPA）tPA是一種絲氨酸蛋白酶，能激活纖溶酶原生成纖溶酶，纖溶酶水解血凝塊中的纖維蛋白網(wǎng)，導(dǎo)致血栓溶解，主要用于治療血栓性疾病。臨床上用于治療急性心急梗塞，急性肺栓塞。9心鈉素（Atrialnatriureticfactor,ANForANP）心鈉素即心房利鈉因子。由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于一種多肽，故又稱心房肽（ANP）。心鈉素具有較強(qiáng)的利鈉、利尿、擴(kuò)張血管和降低血壓的作用。在調(diào)節(jié)體液容量和濃度、控制血壓、維持體液平衡方面起著重要作用，可作為降血壓藥和利尿藥，用于治療充血性心臟衰竭、高血壓、腎功能衰竭、水腫和氣喘等疾病。10重組乙肝疫苗重組乙肝疫苗是以基因工程技術(shù)研制的第二代乙型肝炎疫苗（HB），是基因工程疫苗中最成功的例子。除上述介紹的10種主要基因工程多肽藥物和疫苗外，還有抗血友病因子、凝血因子Ⅷ、超氧化物歧化酶（SOD）、其他基因工程疫苗等。此外，一大批新型的基因工程和蛋白質(zhì)工程藥物正處在不同的研究階段并不斷涌現(xiàn)出來(lái)。8組織型纖溶酶原激活劑（Tissue-typeplasm69●人造血因子：（1）重組人促紅細(xì)胞生成素，適應(yīng)癥是貧血。1989年上市第一個(gè)重組人促紅細(xì)胞生成素Epogen(Amgen)，現(xiàn)有的5個(gè)產(chǎn)品中4個(gè)是“重磅炸彈”，Aranesp(Amgen，Epoetin

α突變體)、Neorecormon(Roche，野生型Epoetin

β)、Procrit(Johnson

&

Johnson，野生型Epoetin

α)和Epogen(野生型Epoetin

α)，2005年銷(xiāo)售合計(jì)為91.5億美元。（2）粒細(xì)胞/單核細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF，適應(yīng)癥是癌癥或癌癥化療引發(fā)的感染預(yù)防和治療。僅有的3個(gè)產(chǎn)品2個(gè)是“重磅炸彈”，Neulasta(Amgen,PEG化的GM-CSF)和Neupogen(Amgen,

GM-CSF突變體)，2005年銷(xiāo)售總額為35億美元。（3）其他造血相關(guān)因子（5個(gè)），適應(yīng)癥主要是兒童發(fā)育不良以及惡性血液病或糖尿病的并發(fā)癥。

●人造血因子：70

●人細(xì)胞因子：（1）α干擾素，適應(yīng)癥為慢性病毒性肝炎和某些癌癥。1986年第一個(gè)重組人α干擾素Roferon(Huffman-La

Roche)上市,現(xiàn)有5個(gè)同類(lèi)產(chǎn)品，其中2個(gè)（組）為“重磅炸彈”，一是Pegasys（Roche，PEG化的重組人α干擾素-2a）,另一組是Schering

Plough的PEG-Intron

A/Intron

A，2005年銷(xiāo)售額合計(jì)約21.6億美元。（2）β干擾素，適應(yīng)癥為多發(fā)性硬化癥（MS）。3個(gè)產(chǎn)品都是重磅炸彈，Rebif(Serono，野生型β干擾素1a)、Avonex(Biogen,

野生型β干擾素1a)和Betaferon/Betaseron

(Schering

AG,

β干擾素1a突變體)，銷(xiāo)售額合計(jì)40億美元[19]。（3）其他細(xì)胞因子（4個(gè)），包括白細(xì)胞介素1、2和11的突變體，適應(yīng)癥為腫瘤化療引起的血小板減少癥、腎細(xì)胞癌和慢性肉芽腫疾病等[20]。

●人細(xì)胞因子：71●人血漿蛋白因子：（1）重組人凝血因子VIII，適應(yīng)癥是血友病A。最早上市的為Recombinate

(Baxter和Genetics,野生型)，現(xiàn)有5個(gè)同類(lèi)產(chǎn)品，最暢銷(xiāo)的是Kogenate（Bayer，野生型）及Advate（Baxter，野生型），2005年銷(xiāo)售分別為8億[21]和6億美元[22]。（2）重組人凝血因子VII，僅上市NovoSeven(Novo

Nordisk)，適應(yīng)癥是血友病和止血，2005年的銷(xiāo)售額近10億美元，2006年上半年銷(xiāo)售增長(zhǎng)19%。（3）重組人凝血因子IX，僅Renefix

(Genetics)1個(gè)，適應(yīng)癥是血友病B。（4）組織血漿酶原激活物tPA，最早上市的為Activase(Genetech),

現(xiàn)有4個(gè)品種，適應(yīng)癥是急性心肌梗死，2005年市場(chǎng)規(guī)模為6-8億美元[23]。（5）C反應(yīng)蛋白，適應(yīng)癥是嚴(yán)重?cái)⊙Y，僅Xigris(Eli

Lilly)（6）重組人抗凝血酶（ATryn）是2006年批準(zhǔn)的、第一個(gè)由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（羊）生產(chǎn)的重組藥物?！袢搜獫{蛋白因子：72●融合蛋白：是為數(shù)很少的以抑制為作用機(jī)理的重組藥物，僅有3個(gè)。1998年批準(zhǔn)的Enbrel(Amgen)是TNF受體和IgG的Fc片段的融合蛋白，含934個(gè)氨基酸，適應(yīng)癥為風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，為“重磅炸彈”，近5年的銷(xiāo)售額約100億美元。1999年上市的免疫毒素Ontak（Ligand）適應(yīng)癥是皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（CTCL），是缺失細(xì)胞結(jié)合域的白喉毒素與IL-2的N端133個(gè)氨基酸的融合蛋白。2003年上市的Amevive（Biogen

Idec）是LEF-3的CD2與IgG的Fc片段的融合蛋白，適應(yīng)癥是牛皮癬。

●融合蛋白：73(二)利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)進(jìn)行藥物生產(chǎn)

獲取外源目的基因外源目的基因?qū)肷臣?xì)胞或胚胎干細(xì)胞選擇攜帶目的基因的細(xì)胞，選擇體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動(dòng)物轉(zhuǎn)基因胚胎的發(fā)育及鑒定篩選所得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物一般過(guò)程(二)利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)進(jìn)行藥物生產(chǎn)

獲取外源目的基因一般74生物制藥第四章課件751、目的基因的制備和轉(zhuǎn)基因的方法目的基因的制備

①逆轉(zhuǎn)錄合成法②化學(xué)合成法③PCR擴(kuò)增法④基因組文庫(kù)

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法

①顯微注射法②病毒載體法③生殖細(xì)胞載體法④胚胎干細(xì)胞法1、目的基因的制備和轉(zhuǎn)基因的方法目的基因的制備

①逆轉(zhuǎn)錄76顯微注射法

顯微注射法是在顯微注射儀上，一側(cè)用吸管固定受精卵，另一側(cè)將注射針插入受精卵原核（一般是雄原核）。拔出顯微注射針解除固定管的負(fù)壓，操作完成。

顯微注射法是最早使用、至今仍在使用的較成熟的基因?qū)敕椒?。其缺點(diǎn)是：整合效率低（小于1%）；不能定點(diǎn)整合，影響基因表達(dá)和遺傳穩(wěn)定性；方法復(fù)雜、設(shè)備昂貴。

顯微注射法

顯微注射法是在顯微注射儀上，一側(cè)77病毒載體法

細(xì)菌質(zhì)粒和噬菌體載體只能將目的基因運(yùn)載至細(xì)菌中擴(kuò)增和表達(dá)。動(dòng)物病毒載體是較理想的真核基因工程載體。

病毒DNA序列中有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，可使其后方的外源基因高產(chǎn)量和高頻率地表達(dá)。常用的有桿狀病毒載體、SV40載體、痘苗病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。病毒載體法

細(xì)菌質(zhì)粒和噬菌體載體只能將目的基因運(yùn)載至細(xì)78生殖細(xì)胞載體法

包括精子載體法、卵子載體法、受精卵載體法、胞漿內(nèi)精子注射法等。

精子載體法是將成熟的精子與外源DNA的載體共同孵育，使精子攜帶外源DNA，受精后外源DNA整合至染色體中。

此法理論上是可行的、也有成功的先例，但成功率不高、效果不穩(wěn)定，有待繼續(xù)探索、完善。

生殖細(xì)胞載體法

包括精子載體法、卵子載體法、79胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法

胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell，ES細(xì)胞）是從胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離得到的多潛能細(xì)胞。

將外源基因?qū)塍w外培養(yǎng)的ES細(xì)胞，經(jīng)篩選后獲得整合穩(wěn)定和表現(xiàn)良好的細(xì)胞，將這些細(xì)胞注射到小鼠胚泡腔中，部分ES細(xì)胞可與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)融合并參與其分化，形成嵌合體。

在嵌合過(guò)程中，帶有外源基因的ES細(xì)胞可能進(jìn)入生殖系，在經(jīng)雜交育種可得到純合體，即為所需的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法

胚胎干細(xì)胞（embryonics80ES細(xì)胞多潛能細(xì)胞。

胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法

ES細(xì)胞多潛能細(xì)胞。

胚胎干細(xì)胞81轉(zhuǎn)基因超級(jí)鼠1982年，英國(guó)的《自然》雜志發(fā)表了一篇文章：有兩個(gè)美國(guó)實(shí)驗(yàn)小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將大鼠生長(zhǎng)激素重組基因?qū)氲叫∈笫芫阎?培育出具快速生長(zhǎng)效應(yīng)的“轉(zhuǎn)基因超級(jí)鼠”。轉(zhuǎn)基因鼠比與它同胎所生的小鼠生長(zhǎng)速度快2～3倍，體積大一倍。轉(zhuǎn)基因鼠轉(zhuǎn)基因超級(jí)鼠轉(zhuǎn)基因鼠822004年日本靜岡縣中小家畜實(shí)驗(yàn)場(chǎng)宣布，該實(shí)驗(yàn)場(chǎng)和北里大學(xué)合作，成功克隆出了體內(nèi)含有水母基因的轉(zhuǎn)基因豬。在用紫外線照射這頭剛誕生的轉(zhuǎn)基因克隆豬時(shí)，豬蹄等部位會(huì)發(fā)出熒光轉(zhuǎn)基因豬2004年日本靜岡縣中小家畜實(shí)驗(yàn)場(chǎng)宣布，該實(shí)驗(yàn)場(chǎng)和北里大學(xué)合83

研究負(fù)責(zé)人之一、俄勒岡保健科學(xué)大學(xué)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物研究中心的杰拉爾德·沙滕介紹說(shuō)，研究人員共對(duì)２２４只猴子的卵母細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因處理，接著對(duì)挑選出的４０個(gè)轉(zhuǎn)基因卵母細(xì)胞進(jìn)行人工授精，然后把這４０個(gè)受精卵分別植入２０只代孕猴媽媽的子宮中，結(jié)果共有５只猴媽媽?xiě)言?。但其中有三只小猴不幸夭折，還有一只未獲成功，只有“安迪”不僅產(chǎn)下后身體健康，而且轉(zhuǎn)基因特征明顯。首例轉(zhuǎn)基因猴完成此項(xiàng)研究的美國(guó)俄勒岡保健科學(xué)大學(xué)提供的新聞公報(bào)稱，這只名為“安迪”的轉(zhuǎn)基因猴于２０００年１０月２日誕生。它目前健康活潑，與另外兩只小猴生活在特制的“公寓”里。

此次添加在“安迪”體內(nèi)的是一種綠色熒光蛋白（ＧＦＰ）標(biāo)志基因。美國(guó)豪斯耳研究所神經(jīng)生物研究室主任林曦解釋說(shuō)，“如果動(dòng)物體內(nèi)含有這種蛋白，在受到特定波長(zhǎng)的光照射時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)特定的熒光”。C整合卵受精的技術(shù)路線

研究負(fù)責(zé)人之一、俄勒岡保健科學(xué)大學(xué)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物研究中843利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行基因藥物生產(chǎn)基因藥物生產(chǎn)第一階段是細(xì)菌基因工程，第二階段是動(dòng)物細(xì)胞基因工程，第三階段是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物—乳腺生物反應(yīng)器。具有以下特點(diǎn)：

⑴乳腺是自我封閉系統(tǒng)，乳腺表達(dá)的蛋白質(zhì)不回流到血液循環(huán)系統(tǒng)，避免外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)對(duì)動(dòng)物本身的影響；

⑵乳腺組織是一種有效的蛋白質(zhì)合成器。一頭奶牛一年可生產(chǎn)乳蛋白250—300Kg，一只綿羊或山羊一年可生產(chǎn)乳蛋白25—30Kg。如果有百分之一的乳蛋白代換成醫(yī)用蛋白，產(chǎn)量十分可觀。

⑶乳腺分泌的基因產(chǎn)物不但產(chǎn)量高，而且易提純。表達(dá)的蛋白經(jīng)過(guò)充分的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性。生物活性接近天然產(chǎn)品。

⑷在動(dòng)物乳腺表達(dá)的外源基因可以遺傳，可用常規(guī)技術(shù)繁殖生產(chǎn)群體。3利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行基因藥物生產(chǎn)基因藥物生產(chǎn)具有以下特點(diǎn)：85乳腺生物反應(yīng)器乳腺生物反應(yīng)器864、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究存在的問(wèn)題

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的低效性轉(zhuǎn)入基因引起完整基因突變轉(zhuǎn)入基因表達(dá)混亂病毒轉(zhuǎn)基因?qū)λ拗鞯挠绊戅D(zhuǎn)基因動(dòng)物模型與預(yù)期不符乳腺反應(yīng)器的完善轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及產(chǎn)品的認(rèn)可你接受轉(zhuǎn)基因食品或藥物嗎？4、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究存在的問(wèn)題轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的低效性你接受轉(zhuǎn)基因87

第四章就到這里了！

第四章就到這里了！882010年6月

生物制藥溫州醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院王慧利2010年6月

生物制藥溫州醫(yī)學(xué)院89內(nèi)容第一章緒論第二章生物藥物概論

第三章生物制藥工藝學(xué)第四章基因工程制藥第五章

抗體工程制藥第六章動(dòng)物細(xì)胞制藥

第七章植物細(xì)胞制藥第八章酶工程制藥

第九章海洋生物制藥

第十章利用現(xiàn)代生物技術(shù)改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)內(nèi)容第一章緒論90第四章基因工程制藥第一節(jié)基因工程概念，歷史和基本原理第二節(jié)基因工程用到的酶，載體第三節(jié)基因工程技術(shù)環(huán)節(jié)和常用技術(shù)1目的基因獲得2目的基因與載體連接3外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞4重組子的鑒定和篩選5常用技術(shù)第四節(jié)基因工程在制藥中的應(yīng)用1重組藥物2轉(zhuǎn)基因動(dòng)（植）物

第四章基因工程制藥第一節(jié)基因工程概念，歷史和基本原理91（一）基因工程（geneengineering）的概念

又稱為遺傳工程、重組DNA技術(shù)，是按著人們的科研或生產(chǎn)需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遺傳物質(zhì)（DNA片段），在體外切割，拼接形成重組DNA,然后將重組DNA與載體重新組合，再將其引入到?jīng)]有該DNA的受體細(xì)胞中，進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，生產(chǎn)出符合人類(lèi)需要的產(chǎn)品或創(chuàng)造出生物的新性狀，并使之穩(wěn)定地遺傳給下一代。按目的基因的克隆和表達(dá)系統(tǒng)，分為原核生物基因工程，酵母基因工程，植物基因工程和動(dòng)物基因工程?；蚬こ叹哂袕V泛的應(yīng)用價(jià)值，為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)開(kāi)辟了新的應(yīng)用途徑，也為遺傳病的診斷和治療提供了有效方法?；蚬こ踢€可應(yīng)用于基因的結(jié)構(gòu)，功能與作用機(jī)制的研究，有助于生命起源和生物進(jìn)化等重大問(wèn)題的探討。

第一節(jié)基因工程概念發(fā)展歷史和基本原理（一）基因工程（geneengineering）的概念第一92基因工程有兩個(gè)重要的特征第一是可把來(lái)自任何生物的基因轉(zhuǎn)移到與其毫無(wú)關(guān)系的任何其他受體細(xì)胞中，因此可以實(shí)現(xiàn)按照人們的愿望，改造生物的遺傳特性，創(chuàng)造出生物的新性狀；第二是某一段DNA可在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，為準(zhǔn)備大量純化的DNA片段提供了可能，拓寬了分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域。

基因工程誕生的意義：基因工程的誕生打破了物種的界限，實(shí)現(xiàn)了物種間的基因交流;在實(shí)驗(yàn)室里對(duì)生物直接進(jìn)行改造，為生命科學(xué)的研究開(kāi)辟了新的領(lǐng)域、注入了新的方法;為提高人類(lèi)的生活質(zhì)量和健康水平開(kāi)辟了新的途徑，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用前景.基因工程有兩個(gè)重要的特征

基因工程誕生的意義：931基因工程誕生的理論基礎(chǔ)（理論上的三大發(fā)現(xiàn)）（1）40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，從而明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問(wèn)題；（2）50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制，解決了基因的自我復(fù)制和傳遞的問(wèn)題；（3）50年代末期和60年初，相繼提出了中心法則和操縱子學(xué)說(shuō)，并成功的破譯了遺傳密碼，從而闡明了遺傳信息的流向和表達(dá)問(wèn)題。

（二）基因工程發(fā)展歷史1基因工程誕生的理論基礎(chǔ)（理論上的三大發(fā)現(xiàn)）（二）基因工94

1）限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)1970年當(dāng)時(shí)在Wisconsin大學(xué)的H.G.Khorana實(shí)驗(yàn)室的一個(gè)小組，發(fā)現(xiàn)T4DNA連接酶具有更高的連接活性，有時(shí)甚至能催化完全分離的兩段DNA分子進(jìn)行末端的連接。1972年在舊金山H.W.Boyer實(shí)驗(yàn)室首先發(fā)現(xiàn)的EcoRI核酸內(nèi)切限制酶具有特別重要的意義。HindⅢ的發(fā)現(xiàn)打破了基因工程的禁錮，1967年在世界上有5個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶。2）載體的發(fā)現(xiàn)因?yàn)槎鄶?shù)重組DNA片段不具備自我復(fù)制的能力，需要一個(gè)運(yùn)送重組DNA分子到細(xì)胞中去的車(chē)子——載體（vector），載體是特定的能自我復(fù)制的DNA分子。3）逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)1970年，Baltimore和Temin等同時(shí)各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶,打破了中心法則，使真核基因的制備成為可能。2技術(shù)上的三大發(fā)明DNA分子切割與連接技術(shù)的建立構(gòu)成現(xiàn)代基因工程的技術(shù)核心!!!

1）限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)2技術(shù)上的三大發(fā)明95

（1）在70年代，將外源DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象獲得成功，1972年斯坦福大學(xué)的S.Cohen等人報(bào)道，經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌細(xì)胞同樣也能夠攝取質(zhì)粒的DNA,從此，大腸桿菌便成了分子克隆的良好的轉(zhuǎn)化受體。不到四年，世界上第一家基因工程公司“Genetech”注冊(cè)登記，意味著基因工程的實(shí)際應(yīng)用已跨入商業(yè)運(yùn)作的門(mén)檻。(2)1972年美國(guó)斯坦福大學(xué)的Berg獲得了SV40和λDNA重組的DNA分子，率先完成了世界上第一次成功的DNA體外重組實(shí)驗(yàn)，并因此與W.Gilbert,F.Sanger分享了1980年度的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)(3)1973年美國(guó)斯坦福大學(xué)的Cohen等人，將大腸桿菌R6-5質(zhì)粒DNA（含卡那霉素抗性基因）和大腸桿菌pSC101質(zhì)粒DNA（含四環(huán)素素抗性基因）重組后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，產(chǎn)生同時(shí)表現(xiàn)出兩種抗性的細(xì)菌。(4)Cohen與Boyer等合作，將非洲爪蟾編碼核糖體的基因同pSC101質(zhì)粒構(gòu)成重組DNA分子，并導(dǎo)入大腸桿菌，證實(shí)動(dòng)物基因進(jìn)入了細(xì)菌細(xì)胞，并在細(xì)菌細(xì)胞中增殖和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生相應(yīng)的mRNA。(5)BergP、Cohen和Boyer等人的工作在世界上最早實(shí)現(xiàn)了DNA體外重組，建立了第一個(gè)基因克隆系統(tǒng)（質(zhì)?！竽c桿菌），導(dǎo)致了一個(gè)全新的生物技術(shù)學(xué)科和產(chǎn)業(yè)——基因工程的誕生。

3基因工程技術(shù)的建立

（1）在70年代，將外源DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象獲964DNA測(cè)序技術(shù)的建立進(jìn)一步促進(jìn)了基因工程的發(fā)展在分子生物學(xué)研究中，DNA的序列分析是進(jìn)一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ)。目前用于測(cè)序的技術(shù)主要有Sanger（1977）發(fā)明的雙脫氧核糖核酸鏈末端終止法，目前Sanger測(cè)序法得到了廣泛的應(yīng)用。Sanger法是根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開(kāi)始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，并且在每個(gè)堿基后面進(jìn)行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長(zhǎng)度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得可見(jiàn)的DNA堿基序列。

Sanger法測(cè)序的原理就是，每個(gè)反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之?dāng)U增，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)使之終止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基團(tuán)，使延長(zhǎng)的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止，終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對(duì)濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長(zhǎng)幾個(gè)至千以上個(gè)，相差一個(gè)堿基一系列片斷。它們具有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的的核苷酸上，可通過(guò)高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。4DNA測(cè)序技術(shù)的建立進(jìn)一步促進(jìn)了基因工程的發(fā)展在分子生物97（三）基因工程基本原理和流程按設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，從供體中提取或人工合成目的基因，利用限制性內(nèi)切核酸酶和連接酶的性質(zhì)，對(duì)基因片段和載體質(zhì)粒進(jìn)行切割和連接，建成重組DNA，再轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，目的基因在細(xì)胞中表達(dá)獲得新的遺傳性狀（三）基因工程基本原理和流程按設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，從供體中提取或人工98生物制藥第四章課件99第二節(jié)

基因工程中常用的工具酶和載體一、限制性內(nèi)切酶

○基因工程中常用作用于核酸的酶，包括水解酶、修飾酶、聚合酶等水解酶分為內(nèi)切酶和外切酶

○內(nèi)切酶在核酸鏈內(nèi)部切割，生成寡核苷酸；外切酶從核酸鏈的末端開(kāi)始，漸進(jìn)式地水解核酸鏈，逐漸釋放單核苷酸。（一）基因工程中常用的工具酶第二節(jié)

基因工程中常用的工具酶和載體一、限制性內(nèi)切酶

100限制性內(nèi)切核酸酶

(restrictionenzymes)能識(shí)別雙鏈DNA分子中一段特異的核苷酸序列，在這一段序列內(nèi)將雙鏈DNA分子切斷。功能：與甲基化酶一起降解外來(lái)DNA分子，以限制(restriction)或阻止病毒侵染，是細(xì)菌細(xì)胞為防御異源遺傳物質(zhì)進(jìn)入的一種有效方式。限制性內(nèi)切核酸酶

(restrictionenzymes)101限制性內(nèi)切酶分類(lèi)第Ⅰ類(lèi)限制性酶：每隔一段DNA序列隨機(jī)切割雙鏈DNA分子，沒(méi)有序列特異性第Ⅱ類(lèi)限制性酶：能識(shí)別一段特異的DNA序列，準(zhǔn)確地酶切雙鏈DNA的特異序列A：形成粘性末端產(chǎn)物：識(shí)別的序列是對(duì)稱的，即在一條鏈中從5’到3’方向的序列，與其互補(bǔ)鏈從5’到3’方向的序列完全相同。這種從兩個(gè)方向閱讀而序列相同的序列稱為回紋對(duì)稱序列(palindrome)（EcoRⅠ）B：形成平端產(chǎn)物：另一類(lèi)酶，如SmaⅠ，它們酶切DNA雙鏈后，產(chǎn)生的DNA片段具有平齊末端(bluntends)限制性內(nèi)切酶分類(lèi)第Ⅰ類(lèi)限制性酶：每隔一段DNA序列隨機(jī)切割雙102限制性酶EcoRI識(shí)別位點(diǎn)（粘性末端）限制性酶EcoRI識(shí)別位點(diǎn)（粘性末端）103EcoRI酶切不同來(lái)源的DNA及退火重組EcoRI酶切不同來(lái)源的DNA及退火重組104平齊末端（SmaⅠ）平齊末端（SmaⅠ）105限制性內(nèi)切酶的命名屬名＋種名＋菌株類(lèi)型＋發(fā)現(xiàn)的順序限制性內(nèi)切酶的命名屬名＋種名＋菌株類(lèi)型＋發(fā)現(xiàn)的順序106DNA聚合酶的特性DNA聚合酶的特性107

該酶的用途是將帶匹配黏端的雙鏈DNA或平端雙鏈DNA片段的5’-P與另一也帶相應(yīng)缺口的DNA片段的3′-OH連接起來(lái)

三、DNA連接酶

3’5‘5’3‘OHPPOH3’5‘5’3‘OPPODNA連接酶

該酶的用途是將帶匹配黏端的雙鏈DNA或平端雙鏈DNA片段的108不匹配黏端的連接先補(bǔ)平或修平后再連接3‘5‘5‘3‘補(bǔ)平修平Klenow(S1或Klenow)不匹配黏端的連接先補(bǔ)平或修平后再連接3‘5‘5‘3‘補(bǔ)平109（二）

基因工程載體

●載體是指將外源DNA片段運(yùn)送進(jìn)宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的運(yùn)載工具

●克隆載體——克隆了外源DNA后，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖，使克隆的DNA片段數(shù)量大大增加

●表達(dá)載體——將外源基因或DNA片段在宿主細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)

○插入型載體——將外源基因或DNA插入其中

○置換型載體——切除載體部分DNA，代之以外源基因或DNA。（二）

基因工程載體

●載體是指將外源DNA片段運(yùn)送110載體必須具備的條件1、能自我復(fù)制：能在宿主細(xì)胞中大量復(fù)制，得到大量的重組DNA分子2、多克隆位點(diǎn)：載體上的內(nèi)切酶位點(diǎn)對(duì)于一種酶來(lái)說(shuō)只能有一個(gè)（置換型載體上被置換片段的兩側(cè)各有一個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)）3、克隆載體要有復(fù)制起點(diǎn)，表達(dá)載體要有啟動(dòng)子4、載體上要有報(bào)告基因或選擇標(biāo)記基因，以便進(jìn)行重組體篩選和鑒定5、在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高且多拷貝。保證重組體穩(wěn)定，高效傳代而不丟失載體必須具備的條件1、能自我復(fù)制：能在宿主細(xì)胞中大量復(fù)制111

一、質(zhì)粒載體

○質(zhì)粒是一種存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中，獨(dú)立于細(xì)菌染色體而自然存在的，在細(xì)菌體內(nèi)能進(jìn)行自我復(fù)制、易分離和導(dǎo)入的DNA環(huán)狀雙鏈分子

○質(zhì)粒大小相差很大（從小于1Kb到大于500Kb），都有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。

○親緣關(guān)系密切的兩種質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地共存，稱為質(zhì)粒的不親和性。

○只能在特定宿主細(xì)胞中復(fù)制的稱為窄宿主范圍質(zhì)粒；可以在多種宿主細(xì)胞中復(fù)制的稱為廣宿主范圍質(zhì)粒。

一、質(zhì)粒載體

○質(zhì)粒是一種存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)112

●嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)?！總€(gè)細(xì)胞中有1-2個(gè)拷貝，具有自身傳遞能力，分子量大。

●松弛型質(zhì)?！總€(gè)細(xì)胞中有10-100個(gè)拷貝，不具有自身傳遞能力，分子量小。基因工程常用此類(lèi)質(zhì)粒?！鸪Ｓ玫馁|(zhì)粒有：pBR322、Psc101、ColE1、Psc134等?！鹳|(zhì)粒載體一般能克隆10Kb左右的DNA片段?？寺≥d體表達(dá)載體●嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒——每個(gè)細(xì)胞中有1-2個(gè)拷貝，具有自身傳113基因工程制藥的關(guān)鍵技術(shù)獲得目的基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒產(chǎn)物分離純化構(gòu)建基因工程菌或細(xì)胞培養(yǎng)工程菌半成品和成品鑒定及包裝除菌過(guò)濾基因工程制藥流程：上游技術(shù)下游技術(shù)上游DNA重組設(shè)計(jì)下游的操作工藝和設(shè)備原則簡(jiǎn)化一、基因工程菌的上游構(gòu)建包括外源基因重組、克隆、表達(dá)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建基因工程制藥的關(guān)鍵技術(shù)獲得目的基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒產(chǎn)物114（一）PCR的原理和應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR）1．原理特點(diǎn)：在體外模擬細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的DNA復(fù)制過(guò)程（Mullis，1984）第三節(jié)基因工程技術(shù)環(huán)節(jié)和常用技術(shù)（一）PCR的原理和應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymeras115（一）PCR的原理和應(yīng)用（一）PCR的原理和應(yīng)用116（1）變性（denaturation）：模板DNA經(jīng)熱變性，雙鏈被解開(kāi)，成為兩條單鏈。（2）退火（annealing）：溫度下降，變性DNA復(fù)姓，使寡核苷酸引物即與模板DNA中所要擴(kuò)增序列兩端的堿基配對(duì)。1．原理（3）延伸（extension）：

在適宜條件下（包括DNA聚合酶和核苷酸單體），引物3端向前延伸，合成與模板堿基序列完全互補(bǔ)的DNA鏈。（4）重復(fù)變性、退火和延伸三步操作：DNA片段呈2的指數(shù)增長(zhǎng)，在1－2小時(shí)內(nèi)重復(fù)25－30次循環(huán)，擴(kuò)增的DNA片段拷貝數(shù)可增加至106～107倍。（1）變性（denaturation）：模板DNA經(jīng)熱變性，1172.PCR技術(shù)的關(guān)鍵酶DNA聚合酶（1）Klenow聚合酶（大腸桿菌DNA聚合酶片段）（2）TaqDNA聚合酶（水生棲熱菌（Thermusaquaticus）中分離，1988年薩奇（R.K.SaiKi））（3）pfuDNA聚合酶（火球菌（PyrococcusFuriosus）中分離）（4）VentDNA聚合酶（Thermococcuslitoralis）2.PCR技術(shù)的關(guān)鍵酶DNA聚合酶（1）Kle118

（二）

目的基因的獲取

●利用PCR克隆目的基因

1、常規(guī)的PCR·2、反向PCR（inversePCR,I-PCR）克隆基因組DNA片段，I-PCR是根據(jù)已知序列擴(kuò)增其旁側(cè)序列的方法。所用的引物與正常的PCR引物方向相反

3、反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)合成cDNA

·RT-PCR是以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，再?gòu)?fù)制成雙鏈DNA（二）

目的基因的獲取

●利用PCR克119

●

基因的人工合成

○如果已知某基因的核苷酸序列，或者通過(guò)基因產(chǎn)物的氨基酸序列推導(dǎo)出基因的核苷酸序列，就可將單核苷酸或寡核苷酸一個(gè)一個(gè)縮合起來(lái)，成為一個(gè)基因的核苷酸序列。連接的兩個(gè)分子各有一端被封閉。

○先合成分別屬于雙鏈序列的8-12堿基的片段，兩個(gè)片段的對(duì)應(yīng)部分配對(duì)后留有粘性末端，第三個(gè)片段再連接上去，不斷延伸直至全部合成●基因的人工合成

○如果已知某基因的核苷酸序列，或120

（二）載體與基因的連接

常用的連接方式有：粘性末端連接法、平頭末端連接法、人工接頭連接法、同聚物加尾連接法。

（一）粘性末端連接法

○相同限制酶切位點(diǎn)連接法

同一的限制酶切割不同DNA會(huì)產(chǎn)生相同的粘性末端，在連接酶的作用下，不同DNA相同的粘性末端形成磷酸二酯鍵而連接起來(lái)平頭末端連接法、人工接頭連接法、同聚物加尾連接法。

（二）載體與基因的連接平頭末端連接法121RT-PCR反向-PCRRT-PCR反向-PCR122

●化學(xué)轉(zhuǎn)化法

利用氯化鈣誘導(dǎo)細(xì)胞（原核）進(jìn)入感受態(tài)，外源DNA直接與感受態(tài)細(xì)胞混合，處于感受態(tài)的細(xì)胞可以吸收外來(lái)的DNA?！耠娹D(zhuǎn)移法

受體細(xì)胞與外源DNA按一定比例混合后，放入電脈沖槽中，經(jīng)用脈沖電壓刺激，外源DNA即可進(jìn)入細(xì)胞（三）外源DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞（基因轉(zhuǎn)移）

不需載體的基因轉(zhuǎn)移 ●化學(xué)轉(zhuǎn)化法（三）外源DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞（基因轉(zhuǎn)移）

123生物制藥第四章課件124生物制藥第四章課件125

●脂質(zhì)體介導(dǎo)法·脂質(zhì)體是磷脂在水中形成的一種由脂類(lèi)雙分子層圍成的囊狀結(jié)構(gòu)

·形成囊狀結(jié)構(gòu)可將DNA包在其中

·帶有外源DNA的脂質(zhì)體通過(guò)細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入受體細(xì)胞，達(dá)到基因轉(zhuǎn)移的目的●血影細(xì)胞介導(dǎo)法

·血影細(xì)胞：哺乳動(dòng)物細(xì)胞溶血，使血紅蛋白大量逸出，最后成為僅有被細(xì)胞膜包被的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)

·血紅蛋白大量逸出時(shí)，外源DNA也容易進(jìn)入。讓血影細(xì)胞與受體細(xì)胞在適當(dāng)條件下發(fā)生細(xì)胞融合，從而使外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞●

磷酸鈣沉淀法

·細(xì)胞具有攝取磷酸鈣沉淀的雙鏈DNA的能力

·將待轉(zhuǎn)移的DNA加入氯化鈣和磷酸鹽，生成DNA-磷酸鈣沉淀，加入培養(yǎng)液中

·由于細(xì)胞的吞噬作用，DNA-磷酸鈣沉淀物進(jìn)入細(xì)胞，DNA釋出后先進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)、再進(jìn)入細(xì)胞核，整合到受體細(xì)胞的染色體上 ●脂質(zhì)體介導(dǎo)法126Polyethylenimine-basednon-viralgenedeliverysystems化學(xué)試劑介導(dǎo)基因進(jìn)入細(xì)胞非病毒載體聚次乙亞胺Polyethylenimine-basednon-vir127脂質(zhì)體包埋法非病毒載體脂質(zhì)體包埋法非病毒載體128

主要是以重組的動(dòng)物病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒直接感染受體細(xì)胞，把外源DNA引入轉(zhuǎn)導(dǎo)作用：通過(guò)噬菌體和病毒的感染作用將一個(gè)細(xì)胞的遺傳信息傳遞到另一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。逆轉(zhuǎn)錄病毒的特點(diǎn)：

·病毒基因組為單鏈RNA，感染期間為雙鏈DNA

·DNA能整合進(jìn)細(xì)胞并復(fù)制

·DNA在動(dòng)物通過(guò)生殖細(xì)胞傳遞到下一代；·帶有對(duì)復(fù)制有重要意義的基因：gag（結(jié)構(gòu)蛋白）、pol（DNA聚合酶）、env（被膜糖蛋白）借助于載體的基因轉(zhuǎn)移

●

主要是以重組的動(dòng)物病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒直接感染受體細(xì)129腺相關(guān)病毒3其中最被看好的是腺相關(guān)病毒

病毒基因組很小，如2型腺相關(guān)病毒是由4681個(gè)核苷酸組成的單鏈DNA，AAV可感染分裂期及靜止期細(xì)胞，當(dāng)輔助病毒不存在時(shí)，AAV能整合到宿主細(xì)胞基因組的特定區(qū)域，無(wú)致病性，免疫原性弱，因此，它無(wú)毒高效，是目前理想的基因治療載體。腺相關(guān)病毒3其中最被看好的是腺相關(guān)病毒130

（四）重組體的鑒定與篩選一、根據(jù)重組子遺傳重組表性改變檢測(cè)法

1、抗性篩選法

利用載體上的抗性基因?qū)﹃?yáng)性克隆作初步的篩選。如pUC19質(zhì)粒中有Ampr基因，為宿主細(xì)胞提供氨芐青霉素抗性。

將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)——

·大部分受體細(xì)胞沒(méi)有外源DNA導(dǎo)入，其本身又沒(méi)有Ampr基因，所以在培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。

·在含有外源DNA的受體細(xì)胞中，只有含有質(zhì)粒自連或者質(zhì)粒與目的DNA形成重組子的受體細(xì)胞由于含Ampr基因，能在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

（四）重組體的鑒定與篩選1312、根據(jù)報(bào)告基因篩選克隆子對(duì)于那些不宜采用克隆載體選擇標(biāo)記篩選克隆子的宿主細(xì)胞，往往在目的基因連入載體之前，先在目的基因的上下游連接一個(gè)報(bào)告基因，這樣導(dǎo)入宿主細(xì)胞后可根據(jù)報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物篩選克隆子。2、根據(jù)報(bào)告基因篩選克隆子132

3、插入失活選擇法

·當(dāng)外源DNA插入到載體的某一基因中間時(shí)，該基因就不能表達(dá)，這種現(xiàn)象稱為插入失活。

·例如，pBR322有四環(huán)素抗性基因（Tetr）和氨芐青霉素抗性基因（Ampr），在Tetr基因內(nèi)有BamHⅠ和SalⅠ兩種限制酶位點(diǎn)，如果在這兩個(gè)位點(diǎn)中有外源DNA插入，都會(huì)導(dǎo)致Tetr基因失活。

·將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞分別培養(yǎng)在含氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基中，便可檢出轉(zhuǎn)化子細(xì)胞。例如，a-互補(bǔ)使菌產(chǎn)生顏色來(lái)篩選

3、插入失活選擇法

·當(dāng)外源DNA插入133生物制藥第四章課件134生物制藥第四章課件135

（五）轉(zhuǎn)化子-核酸分子鑒定法1）瓊脂糖凝膠電泳法：根據(jù)重組DNA分子的大小，其遷移率的差別進(jìn)行鑒定

（五）轉(zhuǎn)化子-核酸分子鑒定法1362）限制性內(nèi)切酶分析法：根據(jù)片段的大小和酶譜特征與預(yù)計(jì)的重組DNA酶譜特征比較。2）限制性內(nèi)切酶分析法：根據(jù)片段的大小和酶譜特征與預(yù)計(jì)的重組1373）印跡雜交法○Southernblot(Southern印跡試驗(yàn))原理——利用硝酸纖維薄膜（或?yàn)V紙、尼龍膜）具有吸附DNA的功能，先作DNA凝膠電泳，并將凝膠電泳的DNA區(qū)帶吸附到膜上，然后在膜上進(jìn)行同位素標(biāo)記探針與被測(cè)樣品只間的雜交，在通過(guò)放射自顯影對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)?！餘ort