人教版高中生物選修一專題五《DNA和蛋白質技術》知識點歸納

人教版高中生物選修一專題五《DNA和蛋白質技術》知識點歸納人教版高中生物選修一專題五《DNA和蛋白質技術》知識點歸納人教版高中生物選修一專題五《DNA和蛋白質技術》知識點歸納xxx公司人教版高中生物選修一專題五《DNA和蛋白質技術》知識點歸納文件編號：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準審核制定方案設計，管理制度專題五ＤＮＡ和蛋白質技術課題一ＤＮＡ的粗提取與鑒定一、提取DNA的溶解性原理包括哪些方面？

1.DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精。①DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度有何特點？要使DNA溶解，需要使用什么濃度？要使DNA析出，又需要使用什么濃度？在0.14mol/L時溶解度最?。惠^高濃度可使DNA溶解；0.14mol/L可使DNA析出。②在溶解細胞中的DNA時，人們通常選用2mol/LNaCl溶液；將DNA分子析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中緩慢注入蒸餾水，以稀釋NaCl溶液。酒精是一種常用有機溶劑，但DNA卻不能溶于酒精（特別是95％冷卻酒精），但細胞中蛋白質可溶于酒精。2.從理論上分析，預冷的乙醇溶液具有以下優(yōu)點。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子運動，易于形成沉淀析出；三是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。3.采用DNA不溶于酒精的原理，可以達到什么目的？

將DNA和蛋白質進一步分離。 4.提取DNA還可以利用DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性原理。利用該原理時，應選用怎樣的酶和怎樣的溫度值？

蛋白酶，因為酶具有專一性，蛋白酶只水解蛋白質而不會對DNA產生影響。溫度值為60～80℃，因為該溫度值蛋白質變性沉淀，而DNA不會變性。補充：DNA的變性是指DNA分子在高溫下解螺旋，其溫度在80℃以上，如在PCR技術中DNA變性溫度在95℃。5.洗滌劑在提取DNA中有何作用？

洗滌劑將細胞膜上的蛋白質，從而瓦解細胞膜。6.當鑒定提取出的物質是否是DNA時，需要使用什么指示劑進行鑒定？在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺呈現(xiàn)藍色。 原理總結：通過利用不同濃度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以從細胞中提取和提純DNA；再利用酒精進一步將DNA與蛋白質分離開來，達到提純的目的；最后利用二苯胺試劑鑒定提取的物質是否是DNA。二、實驗材料的選取不同生物的組織中DNA含量不同。在選取材料時，應本著DNA含量高、材料易得、便于提取的原則。本實驗用雞血細胞做實驗材料有兩個原因。一是因為雞血細胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細胞極易吸水脹破，而用動物肝臟細胞作實驗材料常常需要勻漿和離心，對設備要求較高，操作繁瑣，歷時較長。雞血細胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取過程中為了減少DNA的損失，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細胞液。三、破碎細胞，獲取含DNA的濾液1、若選用雞血和洋蔥作實驗材料，則怎樣獲取含DNA的濾液？

在雞血細胞液中加入一定量蒸餾水并用玻棒攪拌，過濾后收集濾液；切碎洋蔥，加入一定量洗滌劑和食鹽，攪拌研磨，過濾后收集濾液。2.為什么加入蒸餾水能使雞血細胞破裂？

答：蒸餾水對于雞血細胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進入血細胞內，使血細胞脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。3．在以上實驗中，加入蒸餾水、洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？過濾時應當選用（濾紙、尼龍布）。血細胞在蒸餾水中大量吸水而張裂；洗滌劑瓦解細胞膜；食鹽溶解DNA物質；選用尼龍布進行過濾。4.在處理植物組織時需要進行研磨，其目的是什么研磨不充分產生什么結果破碎細胞壁，使核物質容易溶解在NaCl溶液中；研磨不充分會使DNA的提取量減少，影響實驗結果，導致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等。具體做法。10mL雞血＋20mL蒸餾水→同方向攪拌→3層尼龍布過濾→濾液三、去除濾液中的雜質1.為什么反復地溶解與析出DNA，能夠去除雜質？

用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質。因此，通過反復溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質。最初獲得的DNA濾液含有蛋白質、脂質等雜質，需要進一步提純DNA。方案一的原理是DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質，不分解DNA；方案三的原理是蛋白質和DNA的變性溫度不同。方案二與方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解雜質蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質分開；方案三利用的是DNA和蛋白質對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質變性，與DNA分離。四、析出與鑒定1.在濾液中仍然含有一些雜質，怎樣除去這些雜質呢？得到的DNA呈何顏色？濾液與等體積的冷卻酒精混合均勻，靜置2～3分鐘，析出的白色絲狀物就是DNA。DNA呈白色。2.怎樣鑒定析出的白色絲狀物就是DNA呢？

具體做法。試管2支，編號甲乙→各加等量5mLNaCl溶液→甲中放入少量白色絲狀物，使之溶解→各加4mL二苯胺，混合均勻→沸水浴5min→觀察顏色變化五、實驗操作制備雞血細胞液…………加檸檬酸鈉，靜置或離心↓破碎細胞，釋放DNA…加蒸餾水，同一方向快速通方向攪拌↓→過濾，除去細胞壁、細胞膜等。溶解核內DNA…………加入NaCl至2mol/L，同一方向緩慢攪拌↓DNA析出………………加蒸餾水至0.14mol/L，過濾，在溶解到2mol/L溶液中↓→除去細胞質中的大部分物質。DNA初步純化…………與等體積95％冷卻酒精混合，析出白色絲狀物↓→除去核蛋白、RNA、多糖等。DNA鑒定………………二苯胺，沸水浴，呈現(xiàn)藍色注意事項：在雞血中加入檸檬酸鈉防止凝固；雞血靜置或離心以提高細胞懸液濃度；使用塑料燒杯；使用尼龍布過濾；玻棒沿同一方向攪拌；玻棒攪拌要緩慢（細胞破裂快速攪拌）；玻棒不要碰到燒杯壁；二苯胺試劑要現(xiàn)用現(xiàn)配等。課題二多聚酶鏈式反應擴增DNA片段基礎知識PCR技術擴增DNA的過程，與細胞內DNA復制過程類似：1．細胞內DNA復制條件分析：條件組分作用模板DNA的兩條單鏈提供復制的模板原料四種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料酶解旋酶DNA聚合酶打開DNA雙螺旋催化合成DNA子鏈能量ATP為解螺旋和合成子鏈供能引物RNA為DNA聚合酶提供合成的3’端起點2．細胞內DNA復制過程的解析：解旋：解旋酶、ATP，DNA兩條鏈打開，形成兩條DNA單鏈。引物結合：在DNA單鏈3’端與DNA反向配對結合。DNA聚合酶結合：DNA聚合酶與模板鏈結合，標志著單鏈合成開始。子鏈合成：DNA聚合酶從引物3’端開始，將配對的脫氧核苷酸連接起來。后續(xù)加工：DNA聚合酶I將引物切去，并合成空缺處的DNA單鏈，再由DNA連接酶將不連續(xù)的DNA子鏈連接起來（半不連續(xù)合成。先導鏈，滯后鏈）3．DNA分子復制的人工控制實驗操作步驟照PCR反應體系配方配制反應液；②將PCR反應體系50μL用微量移液器轉移到微量離心管（0.5mL）中；③將微量離心管放到PCR儀中；④設置PCR儀的工作參數(shù)。⑤DNA在PCR儀中大量擴增。4．實驗注意事項（1）避免外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。（2）緩沖液和酶分裝成小份，－20℃低溫保存。（3）每添加一種反應成分，更換一個移液器的槍頭。（4）混勻后離心處理，使反應液集中在離心管底部?？偨Y、點評多聚酶鏈式反應擴增DNA片段多聚酶鏈式反應擴增DNA片段PCR原理DNA的復制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復性受溫度影響PCR過程變性復性延伸操作步驟配制PCR反應體系移入離心管放入PCR設置工作參數(shù)DNA擴增測定含量稀釋調零測定并讀數(shù)計算課題三血紅蛋白的提取和分離一、實驗原理蛋白質的物化理性質：形狀、大小、電荷性質和多少、溶解度、吸附性質、親和力等千差萬別，由此提取和分離各種蛋白質。1．凝膠色譜法（分配色譜法）：（1）原理：分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內部，路程長，流動慢。（2）凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。（3）分離過程：混合物上柱→洗脫→大分子流動快、小分子流動慢→收集大分子→收集小分子洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質分子的差速流動。（4）作用：分離蛋白質，測定生物大分子分子量，蛋白質的脫鹽等。2．緩沖溶液（1）原理：由弱酸和相應的強堿弱酸鹽組成（如H2CO3－NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等），調節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。（2）緩沖液作用：抵制外界酸、堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。3．凝膠電泳法：（1）原理：不同蛋白質的帶電性質、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導致不同蛋白質在電場中的運動方向和運動速度不同。（2）分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。（3）分離過程：在一定pH下，使蛋白質基團帶上正電或負電；加入帶負電荷多的SDS，形成“蛋白質－SDS復合物”，使蛋白質遷移速率僅取決于分子大小。二、實驗步驟1．樣品處理紅細胞的洗滌洗滌紅細胞的目的是去除雜蛋白，采集的血樣要及時采用低速短時間離心分離紅細胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min，低速短時間離心，如此重復洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細胞已洗滌干凈。②血紅蛋白的釋放在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。注：加入蒸餾水后紅細胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。2．粗分離①分離血紅蛋白溶液將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第一層為無色透明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第4層是其他雜質的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。②透析取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中，透析12h。透析可以去除樣品中分子量較小的雜質，或用于更換樣品的緩沖液。3．純化調節(jié)緩沖液面：打開色譜柱下端的流出口，使柱內凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝↓膠面平齊，關閉出口。加入蛋白質樣品：用吸管將透析后的樣品沿管壁環(huán)繞移動加到色譜柱的頂端。加樣后，∣打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內，等樣品完全滲入凝膠層后，↓關閉出口。調節(jié)緩沖液面：加入20mmol/L的磷酸緩沖液到適當高度↓洗脫：連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口，進行洗脫?！占盅b蛋白質：待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，用試管收集。4.純度鑒定------SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（選做）三、注意事項電泳技術電泳技術就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而達到對樣品進行分離、鑒定或提純的目的。2.紅細胞的洗滌如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。3．如何檢測凝膠色譜柱的裝填是否成功由于凝膠是一種半透明的介質，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。4．為什么凝膠的裝填要緊密、均勻？

如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會在色譜柱內形成無效的空隙，使本該進入凝膠內部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動次序，影響分離的效果。5．沸水浴處理加入洗脫液的濕凝膠的目的不但節(jié)約時間，還能除去凝膠中可能帶有的微生物和排除凝膠內的空氣。6．G-75“G”代表凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍，75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5g。7．裝填完后，立即用洗脫液洗脫的目的：使凝膠裝填緊密8．加入檸檬酸鈉有何目的為什么要低速、短時離心為什么要緩慢攪拌防止血液凝固；