臨床微生物學(xué)檢驗

臨床微生物學(xué)檢驗臨床微生物學(xué)檢驗臨床微生物學(xué)檢驗資料僅供參考文件編號：2022年4月臨床微生物學(xué)檢驗版本號：A修改號：1頁次：1.0審核：批準:發(fā)布日期：臨床微生物學(xué)的概念是什么？臨床微生物學(xué)是研究微生物的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、分類、生命活動規(guī)律的一門科學(xué)，包括細菌學(xué)、病毒學(xué)、真菌學(xué)等。是臨床醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)之一，指導(dǎo)感染性疾病的診斷、治療和預(yù)防。2．臨床微生物學(xué)實驗檢查大概分幾步驟？①從患者標本分離培養(yǎng)微生物。②對標本中分離到的微生物進行培養(yǎng)、鑒定。③進行藥物敏感性試驗，解釋和預(yù)報結(jié)果。④階段性分析藥物敏感性實驗，預(yù)測耐藥趨勢，監(jiān)控和指導(dǎo)臨床合理用藥。什么是感染性疾病及影響因素？凡是由病原微生物引起的疾病統(tǒng)稱為感染性疾病，而感染性疾病的發(fā)生主要與病原體的侵襲力及宿主的抵抗力密切相關(guān)。別外，臨床上抗生素的大量濫用，引起了正常菌群失調(diào)和大量耐藥菌株的出現(xiàn)，從而加重了機體的內(nèi)源性感染機率，這一定程度又加重了感染性疾病的發(fā)生。臨床醫(yī)師主要需要從臨床微生物學(xué)實驗室得到什么？①能為臨床提供醫(yī)學(xué)決策的相關(guān)信息。②指導(dǎo)臨床正確收集標本的原則。③安全及時的送檢標本。④微生物的正確鑒定和藥物敏感性試驗結(jié)果。⑤能快速地報告實驗結(jié)果，并做出相關(guān)的結(jié)果解釋。⑥能及時反饋醫(yī)院內(nèi)細菌感染分布、耐藥狀況和流行趨勢等。臨床醫(yī)師應(yīng)如何避免感染性疾病的爆發(fā)流行？①遵循病原學(xué)診斷，避免無指癥用藥。②正確及時的采集標本，按要求及時送檢微生物實驗室檢查。③重視實驗室的鑒定及藥敏結(jié)果，結(jié)合臨床患者病情合理使用抗生素。④注意經(jīng)驗性治療與靶向治療相結(jié)合，依據(jù)病原學(xué)診斷及時調(diào)整治療方案，改為針對性治療。⑤加強同臨床微生物實驗室交流溝通，積極配合實驗室做好院內(nèi)感染監(jiān)測、預(yù)防和控制工作。臨床標本采集的一般原則是什么？①在最適宜的時間收集標本，最好在使用抗生素之前或感染急性期采集。②采集標本要有代表性和針對性，不同情況應(yīng)區(qū)別對待，適宜地采取相應(yīng)的方法收集標本，如尿液標本疑為厭氧菌感染時，應(yīng)行恥骨上緣穿刺術(shù)取膀胱尿培養(yǎng)。③采集標本必須來自實際感染的部位，嚴格無菌操作盡可能避免外源性污染。④收集標本應(yīng)當使用合適的收集器材、容器和培養(yǎng)基，以保證最大限度的發(fā)現(xiàn)微生物。⑤標本采集、運送過程中要有專人負責(zé)，避免人為操作失誤。⑥采集標本不僅要防止被污染，同時也要注意安全，防止傳播和自身感染。7．采集過程中需要加抗凝劑的標本應(yīng)注意什么？對任何容易形成凝塊的標本都應(yīng)使用抗凝劑，因為如微生物被已凝固的物質(zhì)包圍，生長較困難。另外，像胸水、腹水等液體標本一旦凝固，很難接種培養(yǎng)，直接影響微生物的培養(yǎng)鑒定。目前，微生物學(xué)標本最常用的抗凝劑是多聚茴香腦磺酸鈉SPS（Sodiumpolyanetholsulfonate），但其濃度不得超過0.025%(W/V)，否則會抑制一些奈瑟菌和厭氧性鏈球菌的生長。肝素也是常用抗凝劑之一，主要用于病毒培養(yǎng)，因為它能抑制革蘭氏陽性菌和酵母菌的生長。檸檬酸鹽和乙二胺四乙酸通常不用于微生物學(xué)標本。標本運送過程中應(yīng)注意些什么？標本采集后，除了要及時送檢外，另外在運送過程中要注意盡量保持標本的原有性狀。對于不能及時送檢的要用專用運送培養(yǎng)基運送，而對一些含有脆弱細菌的標本，需加入特別的保存劑。例如，尿液中加入硼酸能有效地抑制細菌生長，較好的保持尿液中菌落的數(shù)量；糞便中加入磷酸鹽緩沖液有助于保持糞便中像志賀菌、沙門菌等的脆弱細菌。此外，甲醛溶液、紹丁溶液有助于保存寄生蟲的滋養(yǎng)體和包囊，使其維持便于識別的形態(tài)。如何采集血液標本及注意事項？疑為菌血癥或敗血癥時，一般情況下應(yīng)在病人發(fā)熱初期或發(fā)熱高峰時采集，原則上應(yīng)在抗菌治療前盡早取血做細菌培養(yǎng)。若已用抗菌藥物或療效不佳時，在可能條件下停藥24小時后再做血培養(yǎng)。連續(xù)做血培養(yǎng)3次，各次采血應(yīng)在不同部位的血管穿刺，禁從靜脈插管內(nèi)抽血。當骨髓炎時或長期使用抗菌藥物患者，抽取骨髓培養(yǎng)陽性率會遠高于血液培養(yǎng)。對成人每瓶血培養(yǎng)應(yīng)采血8～10ml，嬰兒為1～2ml，兒童3～5ml，骨髓為1～2ml。如不能及時送檢，應(yīng)將已注血的培養(yǎng)瓶在室溫存放，并不得超過12小時。注意事項：①不能用碘酒消毒瓶蓋，只需70％酒精消毒瓶蓋。②嚴格作好患者抽血部位的無菌操作。③同時作厭氧和需氧培養(yǎng)時應(yīng)先將標本接種到厭氧瓶中，然后再注入需氧瓶，嚴格防止將空氣注入?yún)捬跗恐?。④如不能及時送檢應(yīng)于室溫存放，切勿放冰箱存放。10．采集痰標本時應(yīng)注意些什么？當疑為呼吸道感染性疾病時，應(yīng)讓患者取晨痰送檢。取痰前用清水反復(fù)漱口后用力自氣管咳出第一口痰于滅菌容器內(nèi)，立即送檢。對于痰量少或無痰的患者可采用支氣管鏡或氣管穿刺法取得。為了避免污染菌的干擾，最好連查3次。注意事項：①采集標本以清晨為佳，為減少口腔正常菌群污染標本，采集前應(yīng)充分漱口。②取痰標本應(yīng)是深部的痰液而不是唾液，否則會影響檢查結(jié)果。③作結(jié)核分枝桿菌檢查，痰量要多或留取24小時痰液，嬰兒肺結(jié)核要用胃管取痰。④約有1／4～1／2肺部感染患者可能發(fā)生菌血癥，應(yīng)同時作血培養(yǎng)。⑤對一些特殊患者可采用支氣管鏡采集法及氣管穿刺法取痰。11．如何采集尿液標本及注意事項？臨床上有泌尿系統(tǒng)感染、腎結(jié)核、結(jié)石和無癥狀性菌尿等疾病指征時，通常應(yīng)采集晨起第一次尿液（中段尿）送檢。原則上應(yīng)選擇在抗菌治療前采集，若已用藥應(yīng)停藥一周后采集尿液送檢。采集標本前，女性先以肥皂水清洗外陰部，再以滅菌水或1：1000高錳酸鉀水溶液沖洗尿道口，然后排尿棄去前段尿，留取中段尿10ml左右于無菌容器內(nèi)，立即加蓋送檢。男性先用肥皂水清洗尿道口，后用清水沖洗，就可采集中段尿。包皮過長者，為防止污染，可將包皮翻開沖洗，再取中段尿。疑為尿道炎時，可將最初3～4ml尿收集在滅菌容器中。如反復(fù)檢查為同一細菌，也應(yīng)考慮為病原菌。必要時可采用膀胱穿刺術(shù)取尿。注意事項：①尿液標本的采集和培養(yǎng)中最大的問題是污染雜菌，故應(yīng)嚴格進行無菌操作。②尿液標本采集后應(yīng)盡快送檢（1－2小時內(nèi)），否則會影響細菌檢查的正確性。③多數(shù)藥物均通過尿液排泄，因此，無論用何種方法采集尿液均宜在用藥之前進行。④尿液中不得含有防腐劑或消毒劑。⑤疑為結(jié)核分枝桿菌時，可用清潔容器，留24小時尿取其沉渣10～15ml送檢。12．穿刺液包括哪些采集中應(yīng)注意些什么

穿刺液主要包括腦脊液、膽汁、胸水、腹水、心包液、關(guān)節(jié)液及鞘膜液等。在正常人體中，上述體液均是無菌的，有感染的情況下檢出的細菌，應(yīng)視為病原菌，應(yīng)給予及時正確的治療。懷疑為腦膜炎的病人，用腰穿方法采集腦脊液2ml左右，在常溫下15分鐘內(nèi)送檢。標本不可置冰箱內(nèi)保存，否則會使病原菌死亡。膽汁及其它穿刺液采集到無菌針管或無菌試管內(nèi)立即送檢。注意事項：①標本采集應(yīng)在用藥之前。②嚴格無菌操作，避免污染。③作腦脊液培養(yǎng)時，建議同時作血培養(yǎng)。④為防止穿刺液的凝固，最好在無菌試管中先加入滅菌肝素。13．創(chuàng)傷和化膿性標本采集方法是什么？軟組織的急性化膿性炎癥、化膿性疾病、膿腫和創(chuàng)傷感染等疾病可根據(jù)臨床要求取標本送檢。對開放性感染和已潰破的化膿灶，標本采集前先用滅菌生理鹽水沖洗表面污染菌，再用滅菌拭子采取膿液及病灶深部的分泌物。如為慢性感染，污染嚴重，很難分離到致病菌，可取感染部位下的組織，研磨成組織勻漿后送檢。閉鎖性膿腫可行手術(shù)引流或穿刺法取標本于滅菌容器或滅菌注射器內(nèi)送檢。注意事項：①盡可能在用藥前采集標本，采集前一定要作好清洗、消毒工作。②不能立即送檢的標本，應(yīng)放4℃保存；培養(yǎng)淋病奈瑟菌和腦膜炎奈瑟菌的標本除外。③深部膿腫常由包括厭氧菌在內(nèi)的混合細菌感染所致,若有條件應(yīng)作厭氧菌培養(yǎng)，采集標本應(yīng)遵守厭氧菌感染標本的采集原則。14．糞便標本培養(yǎng)應(yīng)如何采集

腹瀉為大便送檢的重要指征，嬰幼兒和小兒可見高熱驚厥。當疑為細菌性痢疾、腸炎、腸結(jié)核和頑固性腹瀉時，應(yīng)在急性期采集，亦最好在用藥之前，以提高檢出率。腸熱癥患者應(yīng)在兩周以后采集。采用自然排便法或直腸拭子法，挑取有膿血，粘液部位的糞便2－3ｇ置于無菌容器中送檢。注意事項：①為提高檢出率，要采集新鮮糞便作培養(yǎng)。②腹瀉病人應(yīng)盡量在急性期采集標本（3天以內(nèi)），以提高陽性率。③雖糞便含有多種雜菌，但應(yīng)盡量采用無菌容器。15．生殖道標本的采集原則和注意事項是什么？當疑為生殖道感染性疾病時，首先排除是否有不潔性交史，然后根據(jù)癥狀確定檢查方向。對于男性患者來講，先檢查尿道是否有膿性分泌物，再依次是前列腺液、精液。采集標本時應(yīng)清洗尿道口，再用無菌拭子擦取尿道口膿性分泌物或深入尿道內(nèi)2-4厘米取分泌物，檢查精液患者應(yīng)禁欲5天以上，采用體外排精法射精于滅菌容器送檢。對于女性患者，先用窺器擴張陰道，然后用滅菌棉拭子取陰道后穹隆處或?qū)m頸分泌物作培養(yǎng)或涂片鏡檢。注意事項：①生殖器是開放性器官，標本采集過程中應(yīng)遵循無菌操作以減少雜菌污染。②陰道內(nèi)有大量正常菌群存在，采取宮頸標本應(yīng)避免觸及陰道壁。③疑產(chǎn)婦有宮腔感染，待胎兒娩出后取宮腔分泌物，并同時取嬰兒耳拭子一同送檢。④沙眼衣原體在宿主細胞內(nèi)繁殖，采集時盡可能多的取上皮細胞。16．哪些標本不能作厭氧菌培養(yǎng)及如何運送標本？痰、支氣管鏡采樣(無特殊保護套)、咽拭子、排出的尿及陰道拭子不能做厭氧菌培養(yǎng)，糞便標本厭氧菌培養(yǎng)，只能做難辨梭菌的培養(yǎng)。在運送中最常用的是注射器運送法，此外還有無氧小瓶運送法、棉拭運送法、組織塊運送法、大量標本運送法。標本采集后應(yīng)盡快送到實驗室，最遲不超過半小時。標本不應(yīng)放在冰箱里，因為低溫對一些厭氧菌有害。17．細菌的超微形態(tài)及革蘭氏陽性和陰性菌的區(qū)別如何？細菌是一類原核細胞型微生物，體積微小，基本形態(tài)有球形、桿形和螺形三種。之所以稱原核是指其核則不是一個具體的結(jié)構(gòu)，沒有核膜。細菌的基本結(jié)構(gòu)包括細胞壁、細胞膜、細胞漿、核質(zhì)和胞漿顆粒等。除動物細胞無細胞壁外，各類生物的細胞具有不同的細胞壁。例如，植物的細胞壁由纖維素構(gòu)成，霉菌的細胞壁則為幾丁質(zhì)，細菌細胞壁的成分為肽聚糖、垣酸和脂多糖。革蘭氏陽性菌細胞壁厚，肽聚糖骨架通過四肽側(cè)鏈和五肽橋連接成為三維空間。不含有芳香氨基酸和含硫氨基酸。革蘭氏陰性細菌的細胞壁薄，除少量肽聚糖構(gòu)成細胞壁的內(nèi)層外，由大量脂多糖構(gòu)成其外層，并有脂蛋白形成鑲嵌結(jié)構(gòu)，其中含有芳香氨基酸和含硫基酸。18．細菌的特殊結(jié)構(gòu)都有哪些其功能是什么

細菌的特殊結(jié)構(gòu)主要有鞭毛、菌毛、莢膜和芽胞。鞭毛是細菌的運動器官，由簡單的角蛋白–肌蛋白組成。菌毛分為普通菌毛及性菌毛兩種，普通菌毛能與宿主細胞表面的菌毛受體相結(jié)，發(fā)揮粘附作用，而性菌毛中空呈管狀，能在細菌之間通過接合傳遞遺傳物質(zhì)，故性菌毛與細菌的遺傳變異有關(guān)。莢膜是細胞壁外的一層多糖物質(zhì)具有抗原性，能抵抗機體吞噬細胞的吞噬作用。芽胞是某些細菌的繁殖體，在一定環(huán)境條件下，由于胞漿脫水濃縮而成一個圓形或卵圓形小體，具有多層膜結(jié)構(gòu)，對外界理化因素抵抗力強，可潛伏數(shù)年或幾十后重新繁殖生長。19．什么是L型細菌其形成原因

L型細菌是一類細胞壁缺陷的細菌，形態(tài)各異大小不一，染色時不易著色，且著色不均勻，革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均可形成，又稱為“原生質(zhì)體和原生質(zhì)球”，凡能破壞肽聚糖結(jié)構(gòu)都可誘導(dǎo)細菌形成L型，其表現(xiàn)為具有明顯的多形性，革蘭染色陰性，能通過細菌濾器，對滲透壓敏感。L型細菌的主要意義在于仍有致病性，能引起間質(zhì)性炎癥。而且是臨床上感染漏診的主要原因之一。20．脂多糖由哪幾部分組成其功能是什么

脂多糖是由類脂和多糖組成，是革蘭陰性菌的內(nèi)毒素，包括類脂A、核心多糖和特異多糖等三部分。類脂A是內(nèi)毒素的毒性分子，與細菌的致病性有關(guān)，無種屬特異性，故不同的革蘭陰性菌感染時，其毒性大致相同。核心多糖具有細菌屬和組的特異性，同一屬和組的細菌，其核心多糖均相同。特異性多糖是脂多糖的最外層，構(gòu)成重要的菌體表面抗原，從而決定了種或型的特異性。21．如何才能更好的發(fā)現(xiàn)和鑒定微生物？首先，選擇適合特定標本類型的初次培養(yǎng)基，為了發(fā)現(xiàn)所有潛在的重要致病菌，還應(yīng)選擇適當?shù)姆跤郎囟群蜌怏w。其次，對初次培養(yǎng)基上所發(fā)現(xiàn)的分離物應(yīng)確定它們進一步鑒定的內(nèi)容。最后，在已鑒定的細菌中確定哪種要進行抗微生物敏感性試驗。22．正常菌群的含義是什么？

人自出生后，外界的微生物就逐漸進入人體。在正常人體皮膚、粘膜及外界相通的各種通道（如口腔、鼻咽腔、腸道和泌尿道）等部位，存在著對人體無害的微生物群，包括細菌、真菌、螺旋體、支原體等。它們在與宿主的長期進化過程中，微生物群的內(nèi)部及其與宿主之間互相依存、互相制約，形成一個能進行物質(zhì)、能量及基因交流的動態(tài)平衡的生態(tài)系統(tǒng)習(xí)慣稱之為正常菌群（Normalflora）。正常菌群大部分是長期居留于人體的又稱為常居菌，也有少數(shù)微生物是暫時寄居的，稱為過路菌。23．正常菌群的生理作用是什么？

①生物拮抗作用：正常菌群通過粘附和繁殖能形成一層自然菌膜,是一種非特異性的保護膜,可促機體抵抗致病微生物的侵襲及定植,從而對宿主起到一定程度的保護作用。正常菌群除與病原菌爭奪營養(yǎng)物質(zhì)和空間位置外，還可以通過其代謝產(chǎn)物以及產(chǎn)生抗生素、細菌素等起作用?？梢哉f正常菌群是人體防止外襲菌侵入的生物屏障。②刺激免疫應(yīng)答：正常菌群釋放的內(nèi)毒素等物質(zhì)可刺激機體免疫系統(tǒng)保持活躍狀態(tài)，是非特異免疫功能的一個不可缺少的組成部分。③合成維生素：有些微生物能合成維生素，如核黃素、生物素、葉酸、吡哆醇及維生素K等，供人體吸收利用。④降解食物殘渣：腸道中正常菌群可互相配合，降解末被人體消化食物殘渣，便于機體進一步吸收。24．什么是條件致病菌和菌群失調(diào)

在一定條件下，正常菌群中的細菌也能使人患?。孩儆捎跈C體的防衛(wèi)功能減弱,引起自身感染。例如皮膚粘膜受傷（特別是大面積燒傷）、身體受涼、過度疲勞、長期消耗性疾病等，可導(dǎo)致正常菌群的自身感染；②由于正常菌群寄居部位的改變，發(fā)生了定位轉(zhuǎn)移，也可引起疾病。例如大腸桿菌進入腹腔或泌尿道，可引起腹膜炎、泌尿道感染。因此，這些細菌稱為條件致病菌。在正常情況下，人體和正常菌群之間以及正常菌群中各細菌之間，保持一定的生態(tài)平衡。如果生態(tài)平衡失調(diào)，以至機體某一部位的正常菌群中各細菌的比例關(guān)系發(fā)生數(shù)量和質(zhì)量上的變化，稱為菌群失調(diào)。25．引起菌群失調(diào)的原因有哪些菌群失調(diào)的常見誘因主要是抗生素、同位素、激素的不合理使用，另外患有慢性消耗性疾病時腸道、呼吸道、泌尿生殖道的功能失常也是重要原因。去除誘因后一般可使菌群復(fù)常，也有長期失調(diào)難于逆轉(zhuǎn)的情況。26．臨床上常見菌群失調(diào)癥有哪些？

臨床上常見的菌群失調(diào)癥有：①耐藥性葡萄球菌繁殖成優(yōu)勢菌而發(fā)生腹瀉，偶爾發(fā)生致死性葡萄球菌膿毒血癥；②變形桿菌和假單胞菌生長旺盛并侵入組織發(fā)生腎炎或膀胱炎；③白色念珠菌大量繁殖，引起腸道、肛門或陰道感染，也可發(fā)展成全身感染；④艱難梭菌在結(jié)腸內(nèi)大量繁殖，并產(chǎn)生一種腸毒素及細菌毒素，導(dǎo)致假膜性腸炎。27．常用培養(yǎng)基有哪幾種其成分主要是什么

常用培養(yǎng)基有普通培養(yǎng)基、營養(yǎng)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基和增菌培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的主要成分有氮源、碳源、無機鹽、水分及一些生長因子，它們主要為細菌的生長繁殖提供營養(yǎng)和生長環(huán)境。28．通常培養(yǎng)基中根據(jù)需要可加入哪些抑制劑和指示劑？依據(jù)細菌生長代謝特性，可選擇性的加入某些抑制劑和指示劑。常用抑制劑有膽鹽、煌綠、玫瑰紅酸、亞硫酸鈉、亞硒酸鈉、某些染料以及多種抗生素物質(zhì)。常用指示劑有酚紅、溴甲酚紫、溴麝香草酚藍、溴酚紅、中性紅、中國藍、甲基紅、酸性復(fù)紅等。29．標本接種技術(shù)有幾種？①平板接種法：初次接種成功后，連繼劃線或分四區(qū)劃線接種。②液體接種法：將試管傾斜30度角，接種環(huán)觸到試管的內(nèi)壁研磨數(shù)次，然后讓試管回復(fù)到原來的直立位置淹沒接種部位，這樣可以避免氣泡的產(chǎn)生。③瓊脂斜面接種法：首先將接種針插入斜面正中，垂直刺入底部，抽出接種針令其在斜面瓊脂上作S形劃線。④穿刺接種法：本法多用于雙糖、半固體或明膠等高層培養(yǎng)基的接種，由培養(yǎng)基中央刺到距管底約半厘米處，然后沿穿刺線退出接種針。⑤傾注培養(yǎng)法：該法常用液體標本的細菌定量計數(shù)。方法是用無菌吸管吸取原標本或經(jīng)適當稀釋的標本各1ml，分別置于直徑為9cm的無菌平皿內(nèi)，傾入已融化并冷至50℃左右的培養(yǎng)基約15ml，立即混勻待凝固后倒置于35±1℃培養(yǎng)18～24小時，做菌落計數(shù)。30.細菌產(chǎn)生耐藥性的機制有哪些?①細菌產(chǎn)生可破抗生素或使之失去抗菌作用的酶。如β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷類鈍化酶、拓撲異構(gòu)酶等。②對抗菌藥物的滲透性降性。主要表現(xiàn)：外膜通透性降低及藥物泵出系統(tǒng)。③抗生素作用靶位的改變。如細菌的青霉素結(jié)合蛋白改變，導(dǎo)致對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥。④代謝途徑的改變。如在腸球菌培養(yǎng)基中加入亞葉酸，腸球菌利用亞葉酸后可對磺胺-甲氧嘧啶由敏感轉(zhuǎn)為耐藥。31．β-內(nèi)酰胺酶的分類及作用機制是什么？

β-內(nèi)酰胺酶是一群酶，根據(jù)分子學(xué)結(jié)構(gòu)可將其分為四群。①A群β-內(nèi)酰胺酶為絲氨酸蛋白酶，主要作用于青霉素類藥物，編碼基因位于染色體或質(zhì)粒上，可從一個細菌轉(zhuǎn)移至另一個細菌。②B群β-內(nèi)酰胺酶為金屬酶，其活性部位為結(jié)合鋅離子的硫醇基。③C群β-內(nèi)酰胺酶主要是頭孢菌素酶，存在于革蘭氏陰性菌染色體上，可被誘導(dǎo)或重組。④D群β-內(nèi)酰胺酶為苯唑西林酶。大量試驗證實，β-內(nèi)酰胺類抗生素和細胞壁前體的存在都可以誘導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶的合成，其作用機制為β-內(nèi)酰胺酶與催化細菌細胞壁肽聚糖合成的青霉素結(jié)合蛋白空間結(jié)構(gòu)相似，可競爭性水解藥物β-內(nèi)酰胺環(huán)使酰胺鍵斷裂而失去抗菌活性，其水解效率是細菌耐藥性的主要決定因子。32．臨床上重要的β-內(nèi)酰胺酶主要有哪幾種？

①超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，主要由克雷伯菌屬和大腸埃希菌產(chǎn)生，對第三代頭孢和氨曲南耐藥，而對碳青霉烯類和頭霉烯類敏感。②對β-內(nèi)酰胺抑制劑敏感性下降的β-內(nèi)酰胺酶，主要原因之一是菌株β-內(nèi)酰胺酶的過度表達，另一機制就是產(chǎn)生誘導(dǎo)耐酶抑制劑的β-內(nèi)酰胺酶，常表現(xiàn)對酶抑制劑復(fù)合藥的敏感性下降，而對第一代頭孢菌素敏感。③質(zhì)粒介導(dǎo)的AMPC酶，常見于克雷伯菌、弗勞地枸椽酸桿菌、陰溝桿菌、奇異變形和蜂房哈夫尼菌等，表現(xiàn)對一代至三代頭孢菌素、頭霉素類、氨基糖苷類耐藥，但對碳青霉烯類、四代頭孢菌素和喹諾酮類敏感。④水解碳青霉烯類的β-內(nèi)酰胺酶，常見銅綠、鮑曼等非發(fā)酵菌屬，表現(xiàn)以碳青霉烯類和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素為代表的多重耐藥。33．耐酶抑制的廣譜β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生機制是什么如何篩選鑒別

大量含酶抑制復(fù)合藥的使用，可誘導(dǎo)原本對酶抑制劑敏感的酶大量產(chǎn)生，使細菌對酶抑制劑的敏感性下降；另一機制產(chǎn)生了源于TEM-1、TEM-2、SHV-1和OXY-2的耐酶抑制劑的β-內(nèi)酰胺酶(IRT)，大腸埃希菌最易產(chǎn)生IRT。區(qū)分是TEM-1、TEM-2或SHV-1的大量表達還是IRT，可用頭孢菌素敏感試驗鑒別，紙片法表型為阿莫西林和替卡西林耐藥，對阿莫西林/克拉維酸和替卡西林/克拉維酸中介或耐藥，而對頭孢菌素敏感。34．常用β-內(nèi)酰胺酶抑制劑有哪些又有何區(qū)別

β-內(nèi)酰胺酶抑制劑與β-內(nèi)酰胺酶有較高的親和性，以競爭性和不可逆的抑制方式發(fā)揮作用，與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用能增強后者的抗菌活性。常用β-內(nèi)酰胺酶抑制劑有克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦?？死S酸可由鏈霉菌培養(yǎng)液中分離得到，除了對β-內(nèi)酰胺酶有抑制劑作用外，同時也可作用青霉素結(jié)合蛋白靶位，與β-內(nèi)酰胺類抗生素共同影響細菌生長。舒巴坦是半合成的酶抑制劑，其抑酶作用和克拉維酸相似，但穿透革蘭陰性菌外膜能力差，可抑制由質(zhì)?；蛉旧w介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶(Ⅰ型染色體介導(dǎo)酶除外)。他唑巴坦也是半合成酶抑制劑，其抑酶作用范圍廣，抑制作用優(yōu)于克拉維酸和舒巴坦。35．β-內(nèi)酰胺類抗生素的作用機制是什么？

青霉素類乃至整個β-內(nèi)酰胺類抗生素的作用機制是阻斷肽聚糖合成的最后階段即肽聚糖鏈的組裝和三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。該階段反應(yīng)通常由幾種酶催化完成，如轉(zhuǎn)糖基酶(催化N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間形成β-1,4糖苷鍵)、轉(zhuǎn)肽酶(催化四肽側(cè)鏈與五肽橋形成D-丙氨酰D-丙氨酸肽鏈)、羧肽酶、內(nèi)肽酶等。不同的β-內(nèi)酰胺類抗生素在不同程度上抑制上述酶的作用，從而抑制細菌細胞壁的完整性，使菌體形成絲狀體或球形體，最終溶解死亡。36.氨基糖苷類抗生素的作用機制是什么？氨基糖苷類由鏈霉菌屬和小單胞菌屬發(fā)酵濾液中提取，能與細菌核糖體30S亞基發(fā)生不可逆的結(jié)合，抑制MRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致細菌死亡，同時該類抗生素還能依靠其離子的吸附作用，吸附在菌體的表面，造成細胞膜的損傷，導(dǎo)致膜的滲漏使胞內(nèi)的K+、嘌呤等重要生命物質(zhì)外漏，為殺菌類抗生素。與細胞壁合成抑制藥物聯(lián)合使用時可產(chǎn)生協(xié)同作用，破壞細胞壁完整性，使藥物易于進入菌體而達到核糖體作用靶位。37.喹諾酮抗生素的作用機制？喹諾酮類抗生素作用于DNA旋轉(zhuǎn)酶，DNA旋轉(zhuǎn)酶在原核細胞DNA復(fù)制過程中引入負超螺旋結(jié)構(gòu)，使復(fù)制叉移動時不因張力太大而不能前進。由于藥物拮抗了該酶干擾了細菌DNA復(fù)制、修復(fù)和重組，藥物還能通過革蘭陰性菌的外膜微孔和借助磷脂滲透作用進入細菌細胞，對繁殖期的細菌均有殺菌作用。38．糖肽類抗生素的作用機制？肽類抗生素是由氨基酸通過肽鍵連接而成化合物，結(jié)構(gòu)上具有較大異源性，抗菌譜窄，但抗菌作用強，具有腎毒性不良反應(yīng)。作用機制是與肽聚糖合成中間產(chǎn)物D-丙氨酰-D丙氨酸末端形成復(fù)合物，可阻斷肽聚糖合成過程中轉(zhuǎn)糖基酶、轉(zhuǎn)肽酶及羧肽酶的作用，從而阻止了細胞壁的合成。39．大環(huán)內(nèi)酯類抗生素作用機制是什么？該類抗生素的分子結(jié)構(gòu)中具有14-16原子的大脂肪內(nèi)酯環(huán)，可逆的結(jié)合在細菌核糖體50S大亞基的23S單位上抑制肽?；D(zhuǎn)移酶，影響核蛋白位移，抑制細菌蛋白合成和肽鏈的延伸。現(xiàn)常用有克拉霉素、阿齊霉素等抗菌活性強、抗菌譜廣的藥物。40．抗菌藥物敏感性試驗(AST)意義方法有哪些?AST的意義：①可預(yù)測抗菌治療效果，即AST試驗結(jié)果為敏感時，治療可能有效；試驗結(jié)果為耐藥時，治療一定失敗；而中介意味著高于常規(guī)治療劑量或藥物濃度集中的生理部位可能有效。②指導(dǎo)臨床醫(yī)生合理選擇抗生素，可依據(jù)實驗結(jié)果調(diào)整經(jīng)驗性治療于靶向治療。AST的方法：①測量藥物最小抑菌濃度的瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法。②測量含藥紙片周圍直徑大小的K-B紙片瓊脂擴散法。③結(jié)合擴散法和稀釋法原理特點的E試驗。④最低殺菌濃度的測定。⑤聯(lián)合藥物敏感性試驗，可為臨床選用最有效的抗菌藥物組合提供實驗依據(jù)。41．耐藥性的產(chǎn)生機理是什么？抗微生物藥物對微生物群體有很強的選擇壓力，使天然能耐受它們的微生物或經(jīng)誘導(dǎo)變異產(chǎn)生抗藥抗性的微生物存活下來。微生物的變異是其進化基礎(chǔ)，變異有多種機制，小的變異包括堿基對的點突變，可以改變抗微生物藥物的作用靶點和干擾它們的活性。大的變異是一大段DNA作為一個整體重新排列，這種變化常由在染色體中可以獨立移動的特殊基因單位，即轉(zhuǎn)座子或插入序列產(chǎn)生。細菌基因的變異還可通過質(zhì)粒，噬菌體或可轉(zhuǎn)移的基因單位獲取外源性DNA而產(chǎn)生。耐藥性可通水平或垂直傳插在不同種或同種間擴散。這種現(xiàn)象發(fā)生的例子如葡萄球菌盒式染色體SCCmec在獲得性耐藥中發(fā)揮了很重要的作用。其中SCCmec可稱為抗生素耐藥島：它包含對甲氧西林產(chǎn)生耐藥的mecA基因，有的SCCmec還包含對非β-內(nèi)酰胺抗生素和重金屬產(chǎn)生耐藥的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子。還有四環(huán)素抗性轉(zhuǎn)座子在淋球菌、人支原體之間的傳播。這些機制使細菌具有能產(chǎn)生抗任何微生物藥物抗性的能力。42.常用的生化鑒定培養(yǎng)基有哪些？

（一）糖發(fā)酵培養(yǎng)基（1）成分蛋白胨水或肉膏液（pH7.4）100ml所需糖、醇或糖苷類物質(zhì)0.5～1.0g16g／L溴甲粉紫乙醇溶液0.1ml（2）制法①將上述各物質(zhì)加熱溶解后，分裝試管。②高壓（55.161kPa）滅菌15分鐘，備用。③如需觀察產(chǎn)氣反應(yīng)，應(yīng)于分裝前在試管中加一倒置的小玻管。④亦可制成半固體發(fā)酵管，即于上述成分中加入4～6g／L的瓊脂，加熱溶化后分試管。（3）用途觀察細菌對糖、醇或苷發(fā)酵能力，用于鑒定細菌。（二）氧化－發(fā)酵（O－F）培養(yǎng)基（1）成分蛋白胨2g氯化鈉5gK2HPO40.3g葡萄糖10g2g／L溴麝香草酚藍溶液12ml水1000ml（2）制法①將蛋白胨、鹽類加水溶解后，校正pH至7.2。②加入葡萄糖、瓊脂，加熱溶解后，加入指示劑，分裝試管。③高壓（68.95kPa）滅菌15分鐘，使成高層瓊脂，備用。（3）用途測定細菌分解葡萄糖的代謝類型用。（三）克氏鐵瓊脂（1）成分蛋白胨或多胨20g牛肉膏3g酵母浸膏3g乳糖10g葡萄糖1g氯化鈉5g拘櫞酸鐵銨0.5g硫代硫酸鈉0.5g瓊脂14g酚紅0.025g水1000ml（2）制法①將上述各成分（酚紅除外）混合，加熱溶解，校正pH至7.4，加入酚紅。②分裝試管，每管約3ml。③高壓（68.95kPa）滅菌15分鐘，趁熱取出，立即置成深底層斜面（斜面及底層約各占一半），凝固后備用。（3）用途鑒別腸桿菌科細菌（四）三糖鐵瓊脂（1）成分多胨或胨10g牛肉膏3g氯化鈉5g乳糖10g蔗糖10g葡萄糖1g硫代硫酸鈉0.3g硫酸亞鐵0.2g瓊脂15g水1000ml4g／L酚紅溶液6ml（2）制法①除酚紅外，將上述各成分混合。加熱溶解，校正pH至7.4，加入酚紅。②分裝試管，每管3～4ml，高壓（68.95kPa）滅菌15分鐘。③趁熱取出，置成底層較深的斜面，凝固后備用。（3）用途鑒別腸桿菌科細菌。（五）胰蛋白胨水（1）成分胰胨或其他含色氨酸豐富的胨1g氯化鈉0.5g水100ml（2）制法①將胰胨、氯化鈉加入水后，加熱溶解，校正pH至7.2～7.4，分裝試管。②高壓（68.95kPa）滅菌15分鐘即成。（3）用途細菌靛基質(zhì)試驗用。（六）葡萄糖蛋白胨水（1）成分蛋白胨0.5g葡萄糖0.5g磷酸氫二鉀0.5g水100ml（2）制法①將上述成分混合于水中，加熱溶解后校正pH至6.8～7.2，分裝試管。②高壓（68.95kPa）滅菌15分鐘即成。（3）用途細菌甲基紅，V－P試驗用。（七）構(gòu)櫞酸鹽培養(yǎng)基（1）成分枸櫞酸鈉（含2H2O）0.2g硫酸鎂（含7H2O）0.02g磷酸二氫銨0.1g磷酸氫二鉀0.1g氯化鈉0.5g瓊脂2g水100ml2g／L溴麝香草酚藍乙醇溶液4ml（2）制法①將上述各成分（溴麝香草酚藍除外）混合加熱溶解，校正pH至6.8，再加入指示劑混勻，分裝試管。②高壓（103.43kPa）滅菌15分鐘后，趁熱取出置成斜面，備用。（3）用途細菌構(gòu)櫞酸鹽及無機銨利用試驗用。（八）氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基（1）成分氨基酸1.0g蛋白胨0.5g酵母浸膏0.3g葡萄糖0.1g吡多醛鹽酸鹽0.5mg水100ml16g／L溴甲酚紫乙醇溶液0.1ml（2）制法①將上述各成分（溴甲酚紫除外）混合加熱溶解后，校正pH至6.8，加入指示劑，混勻。②分裝小試管，每管約0.5～1.0ml，于每管內(nèi)加入液體石蠟一層（約5mm）。③高壓（103.43kPa）滅菌15分鐘后，備用。（3）用途鑒別腸桿菌科及弧菌科細菌用。（九）尿素培養(yǎng)基（1）成分蛋白胨1g氯化鈉5g磷酸二氫鉀2g葡萄糖0.1g尿素2g水1000ml4g／L酚紅溶液3ml（2）制法①將上述各成分（酚紅除外）混合，加熱溶解，校正pH至6．8，再加入酚紅混勻，分裝試管。②高壓（68．95kPa）滅菌15分鐘，備用。（3）用途鑒定細菌能否產(chǎn)生尿素酶。（十）Thornley精氨酸培養(yǎng)基（1）成分L－精氨酸1.0g蛋白胨0.1g氯化鈉0.5gK2HPO40.03g瓊脂0.3g水100ml酚紅0.001g（2）制法①將上述成分（酚紅除外）混合加熱溶解后，校正pH至7.0～7.2，加入酚紅混勻，分裝小試管。②高壓（103.43kPa）滅菌15分鐘后，備用。③同時配制不含精氨酸的培養(yǎng)基作為對照。（3）用途用于檢測細菌能否產(chǎn)生精氨酸雙水解酶，主要用于腸桿菌科，假單胞菌屬及非發(fā)酵菌的鑒定。（十一）甘油品紅培養(yǎng)基（1）成分牛肉膏10g蛋白胨20g水1000ml甘油1ml100g／L堿性品紅乙醇溶液0.2ml100g／L無水亞硫酸鈉水溶液（新鮮配制）1.66ml（2）制法①將牛肉膏、蛋白胨、水加熱溶解后，校正pH至8.0，加入甘油混勻。②高壓（103.43kPa）滅菌15分鐘后，備用。③臨用時，加入堿性品紅及亞硫酸鈉液，分裝試管。（3）用途鑒定沙門菌屬細菌用。（十二）馬尿酸鈉培養(yǎng)基（1）成分馬尿酸鈉1g肉浸液（pH7.4）100ml（2）制法①將馬尿酸鈉溶于肉浸液內(nèi)，分裝于小試管內(nèi)。②高壓（103.43kPa）滅菌15分鐘后備用。（3）用途鑒定B群鏈球菌用。43.常用的生化鑒定試驗有哪些?一、碳水化合物的代謝試驗（一）糖類發(fā)酵試驗（1）原理各種細菌含有不同的分解糖（醇、苷）類的酶，分解糖類的能力各有不同，且不同細菌分解同一種糖的代謝產(chǎn)物也不一定相同。細菌分解糖類后形成的代謝產(chǎn)物隨細菌種類而異，有的產(chǎn)酸，有的產(chǎn)酸產(chǎn)氣?？筛鶕?jù)糖分解的特性鑒別細菌。（2）種類種類很多。常用的單糖類有：阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖等。雙糖類有乳糖、麥芽糖、蕈糖等。多糖類有菊糖、淀粉、糊精。醇類包括甘露醇、甘油、側(cè)金盞花醇、衛(wèi)矛醇、山梨醇、肌醇等。（3）方法細菌經(jīng)分離純化后，根據(jù)待檢菌的分解特性選擇合適的含糖培養(yǎng)基，將純種細菌接種該培養(yǎng)基中，置溫箱內(nèi)培養(yǎng)數(shù)18-24小時，取出觀察結(jié)果。（4）結(jié)果能分解糖產(chǎn)酸的細菌，培養(yǎng)基中指示劑是否呈現(xiàn)酸性反應(yīng)。。不能分解該糖則無顏色變化。產(chǎn)氣可使半固體培養(yǎng)基內(nèi)或液體培養(yǎng)基中的倒置小管內(nèi)出現(xiàn)氣泡，固體培養(yǎng)基則出現(xiàn)裂痕。（5）應(yīng)用糖分解試驗是細菌生化試驗中最常用的生化反應(yīng)。可依據(jù)細菌分解糖的能力各異而區(qū)分和識別不同的細菌。如沙門菌能發(fā)酵葡萄糖，但不發(fā)酵乳糖，大腸桿菌能發(fā)酵葡萄糖和乳糖。腦膜炎球菌能分解葡萄糖和麥芽糖，而淋球菌只能分解葡萄糖，不分解麥芽糖。（二）氧化－發(fā)酵試驗（OF試驗）（1）原理細菌在分解糖的過程中，根據(jù)有無分子氧參加，分為氧化型和發(fā)酵型。能在無氧環(huán)境中不能分解葡萄糖，稱為氧化型。可進行無氧降解的，稱發(fā)酵型。發(fā)酵型細菌在有氧和無氧的環(huán)境中都能分解葡萄糖。兼性厭氧菌為發(fā)酵型細菌。不分解葡萄糖的細菌稱產(chǎn)堿型。（2）方法取2支HL(Hugh-Leifson)培養(yǎng)管,用接種針挑取少許純培養(yǎng)細菌，穿刺接種至兩支培養(yǎng)基的管底，將其中1支在接種后加無菌液體石蠟或者凡士林在培養(yǎng)基表面，高度約1cm。然后將兩支培養(yǎng)管置35℃孵育48小時后觀察結(jié)果。（3）結(jié)果培養(yǎng)基由綠色變黃表示細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸，顏色不變表示不分解葡萄糖。兩管培養(yǎng)基均變黃色為發(fā)酵型，若加液體石蠟的一管顏色不變而另一管變黃色為氧化型，兩管均不變色為產(chǎn)堿型。（4）應(yīng)用OF試驗可區(qū)分細菌的代謝類型，有助于鑒別區(qū)分細菌。如腸桿菌科細菌都是發(fā)酵型細菌，絕大多數(shù)的非發(fā)酵菌為氧化型或產(chǎn)堿型細菌。葡萄球菌為發(fā)酵型而微球菌為氧化型。（三）七葉苷水解試驗（1）原理七葉苷經(jīng)細菌水解生成七葉素，七葉素能與培養(yǎng)基中構(gòu)櫞酸鐵的二價鐵離子結(jié)合生成黑色的化合物，使培養(yǎng)基變黑。（2）方法將細菌接種于七葉苷培養(yǎng)基上，在35℃孵育過夜。（3）結(jié)果細菌生長并使培養(yǎng)基變黑為陽性。（4）應(yīng)用主要用于區(qū)分腸球菌、D群鏈球菌和其他鏈球菌，前兩者陽性。也可用于革蘭氏陰性桿菌和厭氧菌的鑒別試驗。（四）淀粉水解試驗（1）原理細菌產(chǎn)生淀粉酶可將培養(yǎng)基周圍瓊脂中的淀粉水解。加碘液后，菌落周圍形成無色透明區(qū)。而瓊脂中沒分解的淀粉與碘作用產(chǎn)生藍色。試劑可用盧戈碘液或革蘭染液中的碘液。（2）方法將細菌劃線接種或點種在淀粉血清瓊脂平板或水解酪蛋白瓊脂（M－H瓊脂）平板，經(jīng)35℃培養(yǎng)過夜，在菌落上滴加碘液。（3）結(jié)果菌落周圍出現(xiàn)透明區(qū)，而其他部位培養(yǎng)基呈藍色為陽性。（4）應(yīng)用某些細菌如白喉桿菌具有淀粉酶，本試驗呈陽性，可用此試驗鑒別細菌。（五）β半乳糖苷酶試驗（1）原理某些細菌具有β半乳糖苷酶，該酶可分解鄰－硝基苯－β－D－半乳糖苷(ONPG)，生成黃色的鄰硝基酚。（2）方法用接種環(huán)在三糖鐵培養(yǎng)基上刮取一環(huán)新鮮菌齡的菌苔，加于無菌鹽水0.25ml中制成濃菌懸液，加入甲苯1滴，充分振搖，將試管置于37℃水浴中5分鐘，加入ONPG溶液0.25ml，在37℃水浴中保溫，于20分鐘、4小時、18小時和24小時觀察結(jié)果。（3）結(jié)果出現(xiàn)黃色為陽性反應(yīng)，不變色為陰性反應(yīng)。通常在20～30分鐘內(nèi)顯色。（4）應(yīng)用此試驗是測定不發(fā)酵或遲發(fā)酵乳糖的細菌是否產(chǎn)生半乳糖苷酶。由于細菌分解乳糖要有兩種酶，一是半乳糖昔滲透酶，另一是半乳糖苷酶。當缺乏滲透酶時，乳糖不能進入細胞，乳糖分解就不能進行。這兩種酶都是在乳糖存在的條件下誘導(dǎo)細菌產(chǎn)生。迅速及遲緩分解乳糖的細菌ONPG為陽性，如埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬。不發(fā)酵乳糖的細菌為陰性，如沙門菌屬、變形桿菌屬?？捎帽驹囼炞鳛檫t緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定方法。（六）甲基紅試驗（1）原理細菌在糖代謝過程中,能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，并進一步將丙酮酸代謝為乳酸、乙酸、甲酸等,使培養(yǎng)基的pH值下降到4.5以下，加入甲基紅指示劑即顯紅色。某些細菌雖能分解葡萄糖，但產(chǎn)酸量少，培養(yǎng)基酸堿度在pH值5.4以上，加入甲基紅指示劑呈黃色。甲基紅變色范圍為pH值4.0～6.0。（2）方法將細菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置35℃培養(yǎng)2～4天。2天后取出部分菌液滴加2滴試劑，若為陰性結(jié)果，繼續(xù)培養(yǎng)至4天再試。（3）結(jié)果紅色為陽性，橘紅色為弱陽性,黃色為陰性。（4）應(yīng)用可鑒別腸桿菌科內(nèi)各菌屬。沙門菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、埃希菌屬為陽性，腸桿菌屬、哈夫尼亞菌屬為陰性。較常用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的區(qū)別，前者陽性，后者陰性。（七）VP試驗（4）原理某些細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，并進一步脫羧成為乙酰甲基甲醇。后者在堿性環(huán)境中被空氣中的氧氧化為二乙酰，二乙?？膳c培養(yǎng)基中精氨酸的胍基起作用，生成紅色化合物。若培養(yǎng)基內(nèi)含胍基太少，可加入少量肌酸、肌酐等含胍基的化合物，可加速此反應(yīng)。（2）培養(yǎng)基葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。（3）試劑a.奧梅拉試劑：氫氧化鉀40g溶于水10ml，加肌酸0．3g。b.貝立脫試劑：甲液：6％α萘酚乙醇溶液。乙液：40％氫氧化鉀。（4）方法a.奧梅拉法：將細菌接種在上述培養(yǎng)基內(nèi)，置35℃培養(yǎng)48小時。在培養(yǎng)液2ml中加入奧梅拉試劑0.2ml，置50℃水浴中2小時或37℃4小時，充分振搖，觀察結(jié)果。b.貝立脫法：接種及溫育同上。在培養(yǎng)液2ml中加入貝立脫試劑甲液1ml及乙液0.4ml，混合后置37℃中30分鐘觀察結(jié)果。如為陰性應(yīng)繼續(xù)置37℃4小時再觀察。（5）結(jié)果呈紅色為陽性。（6）應(yīng)用常與甲基紅試驗一起使用。可區(qū)別腸桿菌科細菌。本試驗陽性，甲基紅試驗陰性，反之亦然。大腸埃希菌VP陰性而產(chǎn)氣腸桿菌陽性。注：試劑甲液在室溫陰暗處可保存1個月，乙液可長期保存。（八）甘油復(fù)紅試驗（1）原理細菌分解甘油產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫羧而為乙醛，乙醛與無色的復(fù)紅生成醌式化合物，顯紫紅色。（2）方法將細菌接種于甘油復(fù)紅肉湯培養(yǎng)基，在35℃培養(yǎng)8天，每天觀察結(jié)果。將未接種的培養(yǎng)基在35℃培養(yǎng)，作為對照。（3）結(jié)果紫色為陽性（＋＋），紫紅色為陽性（＋），與對照管顏色相同為陰性。（4）應(yīng)用主要用于沙門菌屬菌種間的鑒別。二、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗（一）吲哚（靛基質(zhì)）試驗（1）原理有些具有色氨酸酶,能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，吲哚可與對二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈紅色。（2）試劑柯凡克（Kovac）試劑：對二甲基氨基苯甲醛5g，戊醇75ml，濃鹽酸50ml。將對二甲基氨基苯甲醛加入乙醇內(nèi)，振搖使溶，徐徐加入濃鹽酸，邊加邊搖即成。歐氏（Ehrlich）試劑：對二甲基氨基苯甲醛4g，95％乙醇380ml，濃鹽酸80％ml。配法與柯凡克試劑相同。（3）方法將細菌接種于蛋白陳水培養(yǎng)基中，置35℃培養(yǎng)1～2天，沿管壁徐徐加入柯凡克試劑或歐氏試劑0.5ml，試劑浮于培養(yǎng)基之上，使成兩層，即刻觀察結(jié)果。（4）結(jié)果兩液面交界處呈現(xiàn)紅色為陽性，無紅色為陰性。（5）應(yīng)用主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。注：有些細菌產(chǎn)生吲哚量少，需用乙醚或二甲苯提取后才能與試劑起反應(yīng)。如黃桿菌。（二）硫化氫試驗（1）原理某些細菌分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）生成硫化氫，硫化氫遇鉛或鐵離子形成黑色的硫化鉛或硫化鐵沉淀物。（2）方法將細菌接種于醋酸鉛培養(yǎng)基或克氏鐵、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基中，置35℃培養(yǎng)24～48小時，但惟赫夫尼亞菌需培養(yǎng)7天。每天觀察顏色變化。（3）結(jié)果醋酸鉛培養(yǎng)基變黑色為陽性，不變色為陰性。KI或TSI瓊脂在底層和斜面交界處出現(xiàn)黑色沉淀為陽性。（3）應(yīng)用主要用于腸桿菌鑒別。沙門菌屬、愛德華菌屬、亞利桑那菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬硫化氫試驗陽性，但沙門菌屬中也有部分菌為陰性。此外，腐敗謝爾瓦菌是非發(fā)酵菌中唯一能產(chǎn)生硫化氫的細菌。（三）尿素酶試驗（1）原理某些菌能產(chǎn)生尿素酶，此酶能分解尿素形成氨，使培養(yǎng)基變堿，酚紅指示劑隨之變紅色。（2）方法將細菌接種于尿素培養(yǎng)基，置35℃過夜培養(yǎng)觀察結(jié)果，陰性反應(yīng)者應(yīng)觀察4天。（3）應(yīng)用主要用于腸桿菌科的鑒定。其中變形桿菌、克雷伯菌、摩氏摩根菌、和結(jié)腸耶爾森菌、雷極普羅菲登斯菌為陽性。（四）明膠液化試驗（1）原理細菌分泌的胞外蛋白水解酶，能分解明膠為氨基酸，使之失去原有的凝固力而液化。（2）方法將細菌接種于明膠培養(yǎng)基，在20℃培養(yǎng)7天，每天觀察結(jié)果。若室溫較高，培養(yǎng)基自行融化時，可在冰箱內(nèi)放置30分鐘后取出觀察結(jié)果。明膠平板法：在營養(yǎng)瓊脂中加入1％明膠傾注平板，可分成4個區(qū)，每區(qū)劃線接種1種細菌，經(jīng)1～2天培養(yǎng)，在培養(yǎng)基表面加氯化汞溶液（氫化汞12g，水80ml，濃鹽酸16ml），在菌落周圍出現(xiàn)透明帶，表示細菌液化明膠。（3）結(jié)果明膠培養(yǎng)基半固體變成液體為陽性。明膠平板法菌落周圍出現(xiàn)透明帶為陽性。（4）應(yīng)用根據(jù)細菌能否液化明膠，可有助于細菌的種、屬的鑒定。如陰溝腸桿菌、奇異變形桿菌、沙雷菌、銅綠假單胞菌等為陽性。（五）苯丙氨酸脫氨酶試驗（1）原理細菌產(chǎn)生的苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基生成苯丙酮酸，與氯化鐵作用形成綠色化合物。（2）方法將待檢細菌大量接種于苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基斜面,在35℃培養(yǎng)過夜。滴加10％三氯化鐵4～5滴，由斜面培養(yǎng)物上方流下。立即觀察結(jié)果,延長反應(yīng)時間會引起退色。（3）結(jié)果斜面顯示綠色為陽性。（4）應(yīng)用本試驗特異性較高。變形桿菌屬、摩根菌屬及普羅菲登斯菌為強陽性，其他腸桿菌科細菌大多為陰性。可用于腸桿菌科細菌的鑒定。（六）氨基酸脫羧酶試驗（1）原理細菌如具有某種氨基酸脫羧酶，能使氨基酸脫羧、產(chǎn)生胺和CO2，使培養(yǎng)基變堿，指示劑變色。（2）培養(yǎng)基最常用的有3種：賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基、鳥氨酸脫羧酶培養(yǎng)基、精氨酸脫羧酶培養(yǎng)基及對照培養(yǎng)基。（3）方法將細菌接種在上述含氨基酸的培養(yǎng)基及不含氨基酸的對照培養(yǎng)基中，接種后用無菌石蠟油覆蓋，高度至少5mm。在35℃培養(yǎng)4日觀察結(jié)果。（4）結(jié)果開始階段培養(yǎng)基由于葡萄糖分解呈酸性而呈黃色，以后變?yōu)樽仙珵殛栃越Y(jié)果，若僅發(fā)酵莆萄糖顯黃色為陰性。對照管應(yīng)為黃色。（5）應(yīng)用本實驗可以作為腸桿菌科細菌鑒定的重要方法，對鏈球菌和弧菌科細菌鑒定也有重要作用。（七）精氨酸雙水解試驗（1）原理某些細菌可降解精氨酸為瓜氨酸和胺，瓜氨酸可降解為鳥氨酸、氨和二氧化碳。鳥氨酸又可受脫羧酶的作用，生成腐胺和二氧化碳。氨和腐胺可使培養(yǎng)基變堿，酚紅指示劑隨之變紅色。（2）方法將細菌穿刺接種在索恩利（Thornley）培養(yǎng)基，并封以滅菌石蠟油，在35℃培養(yǎng)1～4天，每天觀察培養(yǎng)基顏色變化。（3）結(jié)果培養(yǎng)基轉(zhuǎn)為紅色為陽性。三、碳源和氮源利用試驗（一）枸櫞酸鹽利用試驗（1）原理當細菌利用銨鹽作為惟一氮源，并利用枸櫞酸作為惟一碳源時，便可在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長，分解枸櫞酸鈉，生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基呈堿性。（2）方法將細菌接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基的斜面上，在35℃培養(yǎng)1～4天，每天觀察培養(yǎng)基顏色變化。（3）結(jié)果西蒙氏枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上有細菌生長，且培養(yǎng)基變藍色為陽性；培養(yǎng)7天無細菌生長，培養(yǎng)基顏色不變保持綠色為陰性?？率翔蹤此崤囵B(yǎng)基斜面變紅色為陽性，保持淡黃色不變色為陰性。（4）應(yīng)用常用于腸桿菌科細菌各菌屬之間鑒別。埃希菌屬、志賀菌屬、愛德華菌屬、耶爾森菌屬為陰性，枸櫞酸桿菌、沙門菌、克雷伯菌屬、沙雷菌為陽性。此外，也有助于假單胞菌、氣單胞菌的鑒定。（二）丙二酸鹽利用試驗（1）原理細菌能利用丙二酸鹽作為惟一碳源時，則能分解丙二酸鈉生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿性。（2）方法將細菌接種于丙二酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)基，置35℃培養(yǎng)過夜后觀察結(jié)果。（3）結(jié)果培養(yǎng)基由綠色變成藍色為陽性，無顏色改變是陰性。（4）應(yīng)用本試驗有助于鑒別腸桿菌科細菌?？死撞鷮俸蛠喞Ｄ蔷鸀殛栃?，腸桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬有不同生物型反應(yīng)，其他菌屬為陰性。（三）馬尿酸鈉水解試驗（三氯化鐵法）（1）原理某些細菌具有馬尿酸水解酶，可使馬尿酸鈉水解，產(chǎn)生苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸與三氯化鐵試劑結(jié)合，形成苯甲酸鐵沉淀。（2）方法將細菌接種于馬尿酸鈉培養(yǎng)基中，置35℃培養(yǎng)48小時后，離心沉淀，取上清液0.8ml，加入三氯化鐵試劑0.2ml，立即混勻，經(jīng)10～15分鐘觀察結(jié)果。（3）結(jié)果出現(xiàn)恒定的沉淀物為陽性，若有沉淀物出現(xiàn)，輕搖后就消失為陰性。（4）應(yīng)用B群鏈球菌能分解馬尿酸鹽，呈陽性反應(yīng)，其他鏈球菌為陰性。（四）馬尿酸鈉水解試驗（茚三酮法）（1）原理細菌水解馬尿酸鈉后形成的甘氨酸，在強氧化劑茚三酮的作用下，氧化脫氨基，生成氨、二氧化碳和醛，茚三酮則生成了還原型茚三酮。氨、二氧化碳與殘留的茚三酮起反應(yīng)，形成紫色化合物。（2）方法將菌液0.4ml和等量的1％馬尿酸鈉溶液混合后，于35℃培養(yǎng)2小時，加入0．2ml茚三酮試劑混勻，出現(xiàn)紫色為陽性。（4）應(yīng)用B群鏈球菌能分解馬尿酸鹽，呈陽性反應(yīng)，其他鏈球菌為陰性。四、細菌酶類試驗（一）觸酶（過氧化氫酶）試驗（1）原理細菌的呼吸酶使細菌在代謝過程中形成過氧化氫，若細菌同時產(chǎn)生觸酶，則可把過氧化氫分解為水和初生態(tài)氧，繼而形成氧分子出現(xiàn)氣泡。（2）方法挑取純培養(yǎng)菌落1接種環(huán)，置于潔凈的玻片上或小試管內(nèi)，滴加適量3％過氧化氫溶液。在1分鐘內(nèi)見有大量氣泡產(chǎn)生，判為陽性結(jié)果。（3）應(yīng)用葡萄球菌和微球菌屬呈陽性，鏈球菌和腸球菌呈陰性?？捎糜诟锾m陽性球菌的初步區(qū)分。（二）氧化酶試驗（1）原理氧化酶也稱細胞色素氧化酶，是細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶。在本試驗中，氧化酶并不直接與氧化酶試劑起反應(yīng)，而是先使細胞色素C氧化，隨后此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。（2）試劑a鹽酸四甲基對苯二胺1g、抗壞血酸1g，水100ml，盛于棕色瓶內(nèi)，避光在4℃保存。b萘酚1g、95％乙醇95ml、盛于棕色瓶內(nèi)，在4℃避光保存。（3）方法a取濾紙一小塊，涂抹菌苔少許，加試劑a，立即呈粉紅色，迅速轉(zhuǎn)為紫紅色者為陽性。b在濾紙上先滴加少許試劑a，再滴加等量的試劑b，然后涂抹待測菌，立即呈現(xiàn)藍色者為陽性，2分鐘無顏色變化為陰性。（4）應(yīng)用主要用于奈瑟菌屬和非發(fā)酵菌的鑒定，絕大多數(shù)菌為陽性，也用于腸桿菌科細菌的確定，該科細菌氧化酶試驗都為陰性。本試驗也有助于識別氣單胞菌和鄰單胞菌。注：試劑在空氣中易發(fā)生氧化，加入抗壞血酸可減緩氧化，未加抗壞血酸的試劑需每星期新鮮配制。實驗時避免接觸含鐵的物質(zhì)。因葡萄糖發(fā)酵可抑制氧化酶活性，實驗菌苔不宜采用含葡萄糖的培養(yǎng)基上的菌落。（三）硝酸鹽還原試驗（1）原理硝酸鹽培養(yǎng)基中的硝酸鹽（NO3）可被某些細菌還原為亞硝酸鹽（N04），后者與醋酸作用生成亞硝酸。亞硝酸與對氨基苯磺酸作用，形成偶氮苯磺酸，再與α萘胺結(jié)合成紅色的N-α萘胺偶氮苯磺酸。（2）試劑a甲液：對氨基苯磺酸0.8g；5mol／L乙酸100ml。b乙液：α萘胺0.5g；5mol／L乙酸100ml。c鋅粉：少許。（3）方法將待檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基(內(nèi)置一小倒管)，置35℃溫育1～4天，每天吸出培養(yǎng)液少許，試驗前臨用時等量混合試劑甲液和乙液，在培養(yǎng)液中加1～2滴混合試劑，陽性者立即出現(xiàn)紅色。并觀察小倒管，如有氣泡產(chǎn)生，表示有氮氣產(chǎn)生。若加入硝酸鹽還原試劑不出現(xiàn)紅色，可加入鋅粉少許，如出現(xiàn)紅色證明產(chǎn)生芳基肼，表示硝酸鹽仍存在；如不產(chǎn)生紅色，表示硝酸鹽已被還原為氮和氨。（4）應(yīng)用本試驗是細菌鑒定中的重要生化反應(yīng)。腸桿菌科細菌為陽性反應(yīng)（極少數(shù)例外，如痢疾志賀菌Ⅰ型為陽性）。如銅綠假單胞菌、嗜麥芽假單胞菌等假單胞菌可產(chǎn)生氮氣。而不動桿菌屬均為陰性。（四）磷酸酶試驗（1）原理磷酸酶可使單磷酸酯水解。反應(yīng)基質(zhì)若是磷酸酚酞，經(jīng)該酶水解后可釋放出酚酞，在堿性條件下呈紅色。（2）方法將被檢細菌接種磷酸酚酞平板上，置35℃培養(yǎng)18～24小時，在平板蓋內(nèi)加1滴濃氨水熏蒸片刻。觀察菌落，呈粉紅色為陽性。（4）應(yīng)用本試驗有助于致病葡萄球菌與其他葡萄球菌的鑒別，前者呈陽性，后者呈陰性。（五）凝固酶試驗（1）原理致病性葡萄球菌可產(chǎn)生凝固酶，使血漿中的纖維蛋白原變成纖維蛋白而附著于細菌表面，發(fā)生凝集。葡萄球菌產(chǎn)生的凝固酶有兩種，一種是結(jié)合凝固酶，結(jié)合在細胞壁上，可用玻片法測出。另一種是游離凝固酶，此酶生成后釋放于培養(yǎng)基中，可用試管法測出。（2）方法a試管法：于無菌試管內(nèi)加入兔血漿0.5ml，再加入葡萄球菌16～18小時肉湯培養(yǎng)物0.5ml，輕輕轉(zhuǎn)動試管，使混勻。置37℃水浴中3～4小時，結(jié)果觀察，凝固者為陽性。b玻片法：取未稀釋的兔漿1滴及鹽水1滴分別置于清潔載玻片上，挑取試驗菌分別與鹽水及血漿混合，立即觀察結(jié)果。如血漿中有明顯顆粒出現(xiàn)而鹽水中無自凝現(xiàn)象者為陽性。結(jié)合凝固酶試驗也可用纖維蛋白原致敏的紅細胞與試驗菌作玻片凝集試驗，則更為敏感。若以血漿－IgG雙標記膠乳試齊可同時測定A蛋白和纖維蛋白原的親和因子，更可提高金黃色葡萄球菌的檢出率，而且較簡便快速。（3）應(yīng)用用于鑒定葡萄球菌的種，金黃色葡萄球菌和中間葡萄球菌為陽性結(jié)果，其他葡萄球菌為陰性。（六）DNA酶試驗（1）原理DNA酶可水解DNA長鏈，形成數(shù)個單核苷酸組成的寡核苷酸鏈。長鏈DNA可被酸沉淀，而寡核苷酸可溶于酸。在菌落平板上加入鹽酸后，若在菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)，而其他部位呈渾濁，表示該菌具有DNA酶。（2）方法將待測菌在DNA瓊脂平板上做點狀接種，經(jīng)35℃培育過夜，在平板加適量1mol／L鹽酸。觀察在菌落周圍有透明環(huán)出現(xiàn)，判為陽性結(jié)果，無透明環(huán)為陰性。（3）應(yīng)用金黃色葡萄球菌及腸桿菌科中的沙雷菌、變形桿菌為陽性。44．孤菌科包括哪幾個菌屬？包括一群氧化酶陽性、具有極端鞭毛、動力陽性的細菌，其有4個菌屬：弧菌屬、氣單胞菌屬、發(fā)光桿菌屬和鄰單胞菌屬。45．與人類感染相關(guān)的弧菌有哪些？

01群霍亂弧菌（V．choleraeO1group）O139群霍亂弧菌（V．choleraegroup）非O1群霍亂弧菌（V．choleraenon－O1group）副溶血性弧菌（V．parahaemolyticus）霍利斯弧菌（V．hollisae）擬態(tài)弧菌（V．minicus）河弧菌（V．fluvialis）創(chuàng)傷弧菌（V．vulnificus）溶藻弧菌（V．a(chǎn)lginolyticus）少女弧菌（V．damsela）麥氏弧菌（V．metschnikovii）辛辛那提弧菌（V．cincinnatiensis）弗尼斯弧菌（V．furnissii）46．弧菌屬細菌的生物學(xué)特性是什么？本屬細菌為發(fā)酵型，革蘭染色陰性，形態(tài)呈直的、彎曲、月牙形或逗點形。大部分菌種為兼性厭氧。氧化酶試驗陽性。細菌生長對營養(yǎng)要求不高，可分解多種碳水化合物、有機酸鹽和氨基酸。鈉離子可刺激弧菌屬所有菌種生長。各菌種具有極端鞭毛，運動活潑如穿梭狀。廣泛分布于淡水及海水中，人體腸道中也偶有這類細菌存在。47．弧菌屬同氣單胞菌屬和鄰單胞菌屬如何區(qū)分？

試驗弧菌屬氣單胞菌屬鄰單胞菌屬O/129敏感試驗S/SR/RS/STCBS生長試驗+--耐鹽試驗0%NACL-/+++6%NACL+--48．霍亂弧菌的生化特性是什么？

兼性厭氧。營養(yǎng)要求不高，在普通瓊脂上生長良好。16℃～44℃均可生長，以37℃為最適宜。具耐堿性，在pH8.2～9.0的堿性胨水或堿性平板上生長迅速。根據(jù)該特性初次分離常選用pH8.5的堿性胨水進行選擇性增菌培養(yǎng)，可抑制其它雜菌生長。經(jīng)35℃4h～6h增菌后可在液體表面大量繁殖形成菌膜。常用的選擇性培養(yǎng)基有硫代硫酸鹽-枸櫞酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂平(Thiosufale-citratebilesalts-sucrose，TCBS)?；魜y弧菌發(fā)酵蔗糖產(chǎn)酸，菌落呈黃色；含亞碲酸鉀的選擇平板雙洗瓊脂平板、慶大霉素瓊脂平板，霍亂弧菌在平板上生長并將培養(yǎng)基中的碲離子還原成元素碲，形成灰褐色菌落中心。49．霍亂弧菌的初步診斷方法有哪些？（1）直接涂片懸滴檢查：取患者糞便制成懸滴標本（亦可用壓滴法），檢查細菌的動力?；魜y弧菌無論是古典生物型或E1－tor生物型均呈現(xiàn)極活潑的穿梭狀運動。O1群霍亂多價血清制動試驗陽性，可作早期推測性報告。染色檢查：取米泔樣糞便的絮狀物、粘液部分涂片2張，干燥后用乙醇固定，分別用革蘭染色及1∶10稀釋的石炭酸復(fù)紅染色，油鏡下觀察有無呈魚群樣排列的革蘭陰性弧菌。（2）玻片凝集試驗：自分離平板上挑取可疑菌落與霍亂多價診斷血清(即O1群霍亂多價血清)做玻片凝集試驗，所用血清的效價應(yīng)在80～160之間，如過濃則稀釋后再作凝集。將稀釋血清滴加在潔凈的載玻片上，挑取可疑菌落混于血清內(nèi)，即刻(一般不超過10秒)出現(xiàn)肉眼可見的明顯凝集者為陽性，同時作生理鹽水對照試驗(陰性)。為了提高陽性檢出率，應(yīng)多挑可疑菌落進行玻片凝集試驗。50．用于霍亂弧菌的初篩試驗有哪些？

（1）霍亂紅試驗：霍亂弧菌有色氨酸酶和硝酸鹽還原能力。當將霍亂弧菌培養(yǎng)于含硝酸鹽的蛋白胨水中時，分解培養(yǎng)基中的色氨酸產(chǎn)生吲哚。同時，還原硝酸鹽成為亞硝酸鹽，兩種產(chǎn)物結(jié)合成亞硝酸吲哚。滴加濃硫酸后即呈現(xiàn)薔薇色，判為霍亂紅試驗陽性?；魜y弧菌和其他弧菌均有此種反應(yīng)。（2）O/129敏感試驗：參照標準藥敏紙片擴散試驗的方法進行。將O/129(2,4-Diamino-6,-Diisopropylpteridine,2,4二氨基-6,7-二異丙基喋啶)藥敏紙片10μg及150μg的紙片貼在接種有待測菌的瓊脂平板上，35℃18～24h孵育后，紙片周圍任何大小的抑菌環(huán)均表現(xiàn)為敏感。O1群和非O1群霍亂弧菌均敏感。但已有對0／129耐藥的菌株出現(xiàn)。O139群對O／129耐藥用此試驗作鑒定時，需特別謹慎，需結(jié)合其他試驗結(jié)果如耐鹽生長試驗等綜合考慮。（3）粘絲試驗（StringTest）：將0.5％去氧膽酸鈉水溶液與霍亂弧菌混勻制成濃懸液。1min內(nèi)懸液由混變清，并變得粘稠,以接種環(huán)挑取時可形成粘絲?；【鷮偌毦比苎曰【糠志晖?，均有此反應(yīng)。51.用于霍亂弧菌的鑒別試驗有哪些？（1）多粘菌素B敏感試驗：在溶化并已冷卻至50℃的1.5%營養(yǎng)瓊脂中加入50μ/ml多粘菌素B，混勻后傾注平板備用。取被檢菌2～3h的肉湯培養(yǎng)物，接種于平板表面，35℃18～24h孵育后觀察有無細菌生長。古典生物型對多粘菌素B敏感不生長，而El-Tor生物型不敏感,可生長出菌苔。（2）雞紅細胞凝集試驗：在潔凈的玻片上滴加生理鹽水1滴，取18～24h的細菌培養(yǎng)物少許與生理鹽水混勻成濃厚菌懸液。加入用生理鹽水洗滌三次的2．5％新鮮雞紅細胞鹽水懸液一滴，充分混勻，1min內(nèi)出現(xiàn)凝集為陽性。古典生物型陰性，El-Tor生物型陽性。（3）第Ⅳ、Ⅴ組噬菌體裂解試驗：取被檢菌2～3h肉湯培養(yǎng)物0.2mL加入已溶化并冷卻至50℃的4mL半固體瓊脂中，混勻后傾注普通瓊脂上制成雙層平板，待凝固后滴加第Ⅳ或Ⅴ組噬菌體，35℃18～24h孵育后觀察有無噬斑（出現(xiàn)者為陽性）。第Ⅳ組噬菌體可裂解古典生物型，不能裂解El-Tor生物型；第Ⅴ組噬菌體可裂解El-Tor生物型，而不能裂解古典生物型。（4）耐鹽培養(yǎng)試驗：霍亂弧菌能在不含氯化鈉和含6％氯化鈉培養(yǎng)基中生長。氯化鈉濃度高于6％則不生長。52．霍亂弧菌強致病性的原因是什么？正常情況下，胃液中的胃酸可消滅食物中的霍亂弧菌不致于致病，但在胃酸降低時；或攝入大量的霍亂弧菌，可以通過胃進入腸道。進入腸道的霍亂弧菌通過鞭毛運動穿過腸粘膜表面的粘液層，接近腸粘膜上皮細胞，通過普通菌毛的作用定值。腸道內(nèi)的環(huán)境有利于霍亂弧菌的繁殖，產(chǎn)生由染色體編碼、對熱不穩(wěn)定的霍亂腸毒素（choleratoxin，CT），CT由A和B兩個蛋白質(zhì)亞單位組成。A亞單位分子量為21812Da，由240個氨基酸組成，在成熟過程中由蛋白水解酶切割成A1和A2兩部分，以二硫鍵相連。A1為毒素活性單位，通過B亞單位結(jié)合細胞膜上GM1受體的通道或“內(nèi)吞”進入細胞內(nèi)，激活腺苷酸環(huán)化酶（cAMP酶），使細胞內(nèi)cAMP大量增加。從而促進腸粘膜細胞的分泌功能，造成腸液大量分泌，導(dǎo)致嚴重的腹瀉和嘔吐。致使體內(nèi)水份和電解質(zhì)大量喪失，機體陷于脫水和電解質(zhì)、酸堿平衡紊亂狀態(tài)。如治療不及時可造成嚴重休克或死亡。52．霍亂弧菌如何分群和分型的？

O1血清分群生物學(xué)分型血清學(xué)分型非O1群小川型霍亂弧菌古典型彥島型稻葉型O1群小川型El-Tor彥島型稻葉型53.副溶血弧菌的生物學(xué)特性是什么？副溶血弧菌是一種具有嗜鹽性的細菌，常存在于近海海水及海產(chǎn)品里，是引起夏秋季食物中毒和急性腹瀉的主要病原菌。該菌為革蘭陰性桿菌，有鞭毛（極單毛），無莢膜，無芽胞。營養(yǎng)要求不高，但在培養(yǎng)基中必須加入適量的氯化鈉，生長所需氯化鈉的最適濃度為3.5％。在無鹽培養(yǎng)基上不能生長，氯化鈉含量超過8％不能生長。在堿性胨水中經(jīng)6～9h增菌可形成菌膜。在TCBS瓊脂平板上形成0.5～2.0mm大小，蔗糖不發(fā)酵而呈藍綠色的菌落。在普通血平板上不溶血或只產(chǎn)生α溶血。但以兔血及以甘露醇為碳源的我妻（wagatsuma）瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生β－溶血現(xiàn)象，稱為神奈川現(xiàn)象（Kanagawaphenomenon，KP）。54．什么是厭氧菌及如何分類？

厭氧菌（anaerobicbacteria）是指一大群在有氧條件下不能生長，必須在無氧條件下才能生長的細菌。廣泛分布于自然界和人體中，往往是體內(nèi)正常菌群的組成成員，多為條件致病菌?？蓪?dǎo)致臨床上許多不明原因的感染，且多為混合性感染。其種類主要可分為兩大類，一類是有芽胞的革蘭陽性梭菌，另一類是無芽胞的革蘭陽性及革蘭陰性的桿菌與球菌。55．厭氧菌的分布狀況如何？

厭氧菌廣泛分布于自然界和人體中。除梭狀芽胞桿菌能以芽胞的形式在自然界中長期存活外，其他絕大多數(shù)無芽胞厭氧菌均存在于人和動物體內(nèi)，特別是口腔、腸道、上呼吸道、泌尿生殖道等處，同需氧菌與兼性厭氧菌共同構(gòu)成機體的正常菌群。在人體正常菌群中厭氧菌占有絕對優(yōu)勢，例如腸道菌群中厭氧菌與非厭氧菌（包括需氧菌和兼性厭氧菌）的比例為1000∶1，即99．9％是厭氧菌，大腸桿菌等僅占0．1％。每克糞便含厭氧菌達1000億個，皮膚、口腔、上呼吸道、女性生殖道的正常菌群中，也有80％～90％是厭氧菌。正常情況下菌群之間保持著微生態(tài)平衡，厭氧菌代謝產(chǎn)生的乙酸、乳酸等能抑制病原菌生長。如長期使用廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑等，在發(fā)生菌群失調(diào)或機體免疫力下降或細菌進入非正常寄居部位時，這些厭氧菌即可作為條件致病菌而導(dǎo)致內(nèi)源性感染。56.厭氧菌感染的臨床及細菌學(xué)指征有哪些？

凡有下列情況者應(yīng)懷疑有厭氧菌感染：①感染組織局部產(chǎn)生大量氣體，造成組織腫脹和壞死，皮下有捻發(fā)音，是產(chǎn)氣莢膜梭菌所引起感染的特征。②發(fā)生在粘膜附近的感染，口腔、腸道、鼻咽腔、陰道等粘膜，均有大量厭氧菌寄生，這些部分及其附近有破損，極易發(fā)生厭氧菌感染。③深部外傷如槍傷后，人被動物咬傷后的繼發(fā)感染，均可能是厭氧菌感染。④分泌物有惡臭，或為暗血紅色，并在紫外光下發(fā)出紅色熒光，均可能是厭氧菌感染。發(fā)紅色熒光的分泌物，可能有產(chǎn)黑色素普魯沃菌和不解糖紫單胞菌；分泌物或膿汁中有硫磺顆粒，為放線菌感染。⑤分泌物涂片經(jīng)革蘭染色，鏡檢發(fā)現(xiàn)有細菌，而常規(guī)培養(yǎng)陰性者；或在液體及半固體培養(yǎng)基深部長的細菌，均可能為厭氧菌感染。⑥長期應(yīng)用氨基糖甙類抗生素治療無效的病例，可能是厭氧菌感染。⑦最近有流產(chǎn)史者，以及胃腸手術(shù)后發(fā)生的感染。57.厭氧菌的臨床微生物標本如何采集？

在一般情況下，應(yīng)從正常無菌部位或通過嚴格無菌技術(shù)采集標本，用無菌操作抽取無菌體液，包括有血液、胸腔積液、關(guān)節(jié)液、心包液、膽汁、腦脊液、腹腔液、和膀胱穿刺液等。采取標本時應(yīng)盡量避免接觸空氣，多使用針筒抽取，減少標本與空氣接觸的機會。抽取時穿刺針頭應(yīng)準確插入病變部位的深處，一般抽取數(shù)毫升即夠。抽出后可排出一滴標本于酒精棉球上。若病灶處的標本量較少，則可以先用針筒吸取1ml還原性溶液或還原性肉湯，然后再抽取標本。標本采集后，將針頭插入無菌橡皮塞或用專用培養(yǎng)基立即送檢，最遲不超過半小時。不同部位標本采集法如下：肺部:下呼吸道分泌物肺穿刺術(shù)或用帶有保護套的纖只鏡采取。膿腫：封閉性膿腫采用針管抽?。蝗缫哑茲?，用無菌棉拭子擦去表面膿液，去深部分泌物。女生殖道：后穹窿穿刺抽取。胸腔：胸腔穿刺術(shù)。竇道或深部創(chuàng)傷：用空針連著靜脈注射的塑料導(dǎo)管穿人感染部位抽吸。組織：無菌外科切開。尿道：上陰部膀胱穿刺。58.厭氧菌標本采集時應(yīng)注意些什么？如采集標本的部位有正常厭氧菌棲居，此等部位所培養(yǎng)出的厭氧菌，不一定是真正的致病菌，故下列標本無送檢價值，不宜做厭氧菌培養(yǎng)：①鼻咽拭子；②齒齦拭子；③痰和氣管抽取物；④胃和腸道內(nèi)容物、肛拭，如果需要只能做難辨梭菌及肉毒桿菌；⑤接近皮膚和粘膜的分泌物；⑥褥瘡潰瘍及粘膜層表面；⑦排出的尿或?qū)?；⑧陰道或子宮拭子；⑨前列腺分泌物。如果一時來不及接種，可將標本置室溫下保存。一般認為標本不要冷藏，因冷藏對某些厭氧菌有害，而且在低溫時氧的溶解度較高。59.厭氧菌標本如何運送與處理？（1）針筒運送法針筒可用來運送各種液體標本，如血液、膿液、胸腹水等。用無菌針筒抽取標本后，排出空氣，針尖插入無菌橡皮塞，隔絕空氣，即可運送到實驗室。（2）無氧小瓶運送法通常用來運送少量膿液，用無菌青霉素小瓶作采樣瓶。瓶內(nèi)裝培養(yǎng)基0.5ml，加入少量刃天青（resazarin）。后者是氧化還原指示劑，有氧時顯粉紅色，無氧時無色，其在培養(yǎng)基中的濃度為1mg/ml。（3）棉拭運送法一般不用，因棉拭子中有空氣不利于厭氧菌生長，但有時不得不用。棉拭運送管分A、B兩管。A管內(nèi)充滿CO2，管中插入1支連在橡皮塞下的無菌棉拭。用丁基橡皮塞（butylrubber）塞緊，因其它橡皮塞可能有毒性，且氧氣可滲入。B管裝有含還原劑的半固體培養(yǎng)基。棉拭自A管取出，浸泡分泌物后，插入B管后即可。（4）大量液體標本運送法裝滿標本瓶，即可驅(qū)除瓶中的空氣，加蓋密封即可運送。（5）組織塊運送法組織塊放在密封的厭氧罐中運送。罐內(nèi)放人一團用酸化硫酸銅（0.25％的吐溫80，加硫酸銅配制而成pH至1.5～2）浸泡過的鋼絲絨，鋼絲絨用酸化硫酸銅浸泡過，其表面附有金屬銅，能迅速吸氧。（6）厭氧袋運送法可將預(yù)還原的血平板帶到病人床邊接種，然后將平板放入?yún)捬蹙囵B(yǎng)袋攜回實驗室。或放入無菌又不透氣的普通塑料袋，袋中裝有一團酸化硫酸銅處理過的鋼絲絨以利吸氧。標本送到實驗室后，應(yīng)在20～30min內(nèi)處理完畢，最遲不超過2h，以免其中兼性厭氧菌過度生長而抑制厭氧菌的生長。60.厭氧菌分離培養(yǎng)常用培養(yǎng)基有那些？

①強化血瓊脂平板（BAP）：即布氏瓊脂或牛心、牛腦浸出液瓊脂為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，補加酵母浸膏（0.5％）、動物血（5％～10％）、維生素k1（0.1μg／ml）和氯化血紅素（5μg／ml）。本培養(yǎng)基是一種非選擇性培養(yǎng)基，幾乎能培養(yǎng)出所有的厭氧菌。②卡那－萬古霉素凍溶血瓊脂平板（KVLB）：可抑制大多數(shù)兼性厭氧菌，使產(chǎn)黑色素普雷沃菌早期形成黑色素。后者正是亞鐵血紅素的衍生物，其形成速度與培養(yǎng)基中血紅素含量有關(guān)。在普通血平板上，黑色菌落需4～5d才出現(xiàn)，而在溶血平板上只需2～3d。在此培養(yǎng)基上絕大多數(shù)類桿菌屬、普雷沃菌屬和紫單胞菌屬都生長良好，梭桿菌和厭氧球菌不能生長。本培養(yǎng)基是分離口腔、頭頸部、上呼吸道常見的產(chǎn)黑色素普雷沃菌常用的選擇性培養(yǎng)基。血中以人血和兔血效果最好，溶血前先將血細胞放入－20～－70℃冰箱凍結(jié)數(shù)分鐘，再放入30℃水浴箱立即溶血。卡那霉素含量為75～100μg／ml，萬古霉素為75μg／ml。③七葉苷膽汁平板（BBE）：本培養(yǎng)基含20％膽汁（或20g／L牛膽鹽），1g／L七葉苷和100μg／ml的慶大霉素。慶大霉素抑制需氧菌，膽汁抑制對之敏感的厭氧菌。只有耐膽汁的脆弱類桿菌組的細菌與可變梭桿菌和死亡梭桿菌不但不被抑制，反被刺激生長，菌落較大。除部分普通類桿菌和可變梭桿菌外，上述各菌還能水解七葉苷，故除菌落較大外，在菌落周圍還能形成棕黑色的暈。而部分普通類桿菌和可變梭桿菌在菌落周圍無棕黑色的暈。如培養(yǎng)時間延長，某些腸球菌也能生長，但菌落小而透明，染色性改變成革蘭陰性。④卵黃平板（EYA）和兔血平板：用于選擇產(chǎn)氣莢膜梭菌。標本直接涂片如發(fā)現(xiàn)革蘭陽性短粗鈍圓桿菌，同時白細胞很少或破碎，有莢膜、不見芽胞，可能即是該菌。接種兔血平板，見有雙溶血環(huán)，內(nèi)環(huán)是與菌落一樣大小的透明溶血環(huán)，外環(huán)是寬的甲型溶血，在室溫中放半小時，可見菌落變綠色或褐色，同時可接種卵黃平板，以進行卵磷脂酶試驗及聶格爾試驗來鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌。61.做厭氧菌分離培養(yǎng)時標本如何接種？

為了能及時準確地分離培養(yǎng)出需氧菌，兼性厭氧菌，微需氧菌和厭氧菌；每份標本至少應(yīng)接種3個血瓊脂平板，分別放置于有氧、無氧和含5％～10％CO2環(huán)境中培養(yǎng)。如僅要求厭氧菌生長，除接種上述培養(yǎng)基外，還應(yīng)接種一種或幾種選擇性培養(yǎng)基，抑制其它細菌生長，以利于厭氧菌生長。同時應(yīng)接種一支液體培養(yǎng)基增菌用，如平板無菌生長時，可用液體培養(yǎng)重新轉(zhuǎn)種。如平板上菌生長良好，此液體培養(yǎng)即可棄去。接種時可用無菌注射器抽取標本1～2滴接種血平板，1ml接種到液體培養(yǎng)基的底部。接種后立即放入無菌容器厭氧法進行培養(yǎng)。為了便于在混合培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)厭氧菌，一般將標本分3區(qū)劃線接種于平板上，在1、2區(qū)交界處，貼一張含5μg／片的甲硝唑紙片。如紙片周圍出現(xiàn)抑菌圈，表明有厭氧菌存在，因為兼性厭氧菌對甲硝唑不敏感。62.如何初步鑒定厭氧菌？標本經(jīng)48h初代培養(yǎng)后，用放大鏡觀察平板上的菌落性狀。每個平板挑選5個不同性狀菌落，每個菌落分別接種2～3個平板，每個平板劃分4～6個區(qū)，分別作幾個菌落的次代培養(yǎng)。然后分別放入有氧、無氧和含5％～10％二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)48h。如在有氧、無氧環(huán)境中均能生長為兼性厭氧菌；如在有氧、無氧環(huán)境中均不生長或生長不好，而在二氧化碳環(huán)境生長最好為需二氧化碳菌；如在有氧下生長而在無氧下不生長則為需氧菌；在有氧環(huán)境中不生長而僅在厭氧環(huán)境中生長即為專性厭氧菌。當在厭氧平板上有菌生長時，為了確定是否為厭氧菌，必須做耐氧試驗。同時可據(jù)厭氧菌的菌體形態(tài)、染色反應(yīng)、菌落性狀以及對某些抗生素的敏感性等作出初步鑒定。例如產(chǎn)氣莢膜梭菌某些菌株可產(chǎn)生范圍較大的溶血圈或雙溶血圈;產(chǎn)黑色素普魯沃菌，其菌落在紫外線（360nm）或Wood氏燈照射下，顯示磚紅色熒光。破傷風(fēng)梭菌芽孢位于菌體頂端而使細菌呈鼓槌狀?？敲顾乜蓪⑺髼U菌屬(敏感)與類桿菌屬(耐藥)區(qū)分開來。63.厭氧菌的革蘭染色應(yīng)注意些什么？因為某些厭氧菌具有特殊的菌體形態(tài)，可通過革蘭染色鏡下觀察作出初步鑒定。但應(yīng)注意由于培養(yǎng)基種類和培養(yǎng)時間的不同，而染色結(jié)果也有較大差異，如痤瘡丙酸桿菌，用pH7.0培養(yǎng)基時菌體為革蘭陰性并呈多形性；若用pH6.0以下的培養(yǎng)基則為革蘭陽性桿菌。厭氧菌的革蘭染色，選擇24h內(nèi)幼齡菌較為理想。由于厭氧