基因工程-比較TALEN技術(shù)與ZFN技術(shù)【實用文檔】doc

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比較TAＬEN技術(shù)與ＺFＮ技術(shù)基因工程比較TALEN技術(shù)與ZFN技術(shù)【實用文檔】doc文檔可直接使用可編輯，歡迎下載重組鋅指核酸酶(zinc－fingeｒnucleaｓes,ZFN）技術(shù)與轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白核酸酶（trａnsｃrｉｐtionactivaｔor-ｌikｅｅｆｆｅctoｒnucleaseｓ，TALEN）技術(shù)是可以對基因組進行定點修飾的基因編輯技術(shù)，可精確地定位到基因組的某一位點上并剪斷靶標DＮA片段從而插入新的基因片段,從而對原基因組進行“編輯”。ＺＦN技術(shù)依賴于特異性識別并結(jié)合DNA的鋅指蛋白和FokI核酸內(nèi)切酶可剪切結(jié)構(gòu)域組成的融合蛋白，可切割特異ＤＮA序列并引起ＤNA雙鏈斷裂（ｄoublｅ—strandbreakｓ，DＳB），DSB激活細胞的DNＡ修復(fù)機制,從而定點修飾基因組。TAＬEN是由轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（TALE）代替ZF與ＦｏｋI核酸內(nèi)切割域組成的基因編輯工具。一、結(jié)構(gòu)與原理ZＦN技術(shù)中，鋅指結(jié)構(gòu)域通常由3－６Cys2—His2型鋅指單元串聯(lián)而成,他們借助一個Ｚn２+形成ββα構(gòu)象,其中α螺旋中的—1,+3，+6位的三個氨基酸直接與靶DNA的三聯(lián)堿基相互作用.這三個殘基中的任一殘基的改變都會影響ZF對目標堿基的識別。根據(jù)目的基因設(shè)計8－10個鋅指結(jié)構(gòu)域并與FokI結(jié)合可構(gòu)成靶向特定位點的ＺFＮs,在FｏkI切割域的二聚化作用下完成對目的基因的編輯.ＴAＬＥ蛋白包括三部分：Ｎ端序列、C端序列、由高度保守的重復(fù)單元組成的中心重復(fù)區(qū)。每個重復(fù)單元中除12、1３位氨基酸可變外其余幾乎相同,1２、1３位的兩個氨基酸被稱為重復(fù)可變的雙氨基酸殘基(repeatvａribledｉ-resｉdueｓ,RＶDs）。ＲＶD與A、T、C、G之間有著嚴格的對應(yīng)關(guān)系，即NＩ—Ａ；NG-T；HD－C；ＮN—Ｇ。構(gòu)建TALE時，根據(jù)靶DNA序列變換ＲVDs并串聯(lián)重復(fù)單元并與FoｋI切割結(jié)構(gòu)域結(jié)合，TＡLE與靶位點結(jié)合，二聚化的ＦｏkＩ對其進行切割，完成基因編輯操作.二、ZFN、TＡLEN異同點比較與ZFN相比,TAＬＥN的優(yōu)勢是十分明顯的。第一,TAＬEN簡化了ＺFN復(fù)雜的篩選過程，在簡單的分子克隆條件下就可構(gòu)建出高效的TＡLEN；第二,TＡLEN結(jié)合DＮA序列更為嚴格，打靶效率高于ZFN；第三,TＡLEN降低了脫靶的可能性，從而降低了對受體細胞的毒性。詳細比較如下：２。1共同點二者均為人工改造的核酸內(nèi)切酶，由特異性識別靶DNA的識別域和非特異性剪切dsDNA的切割域，他們配合著行使功能,缺一不可。ＺＦＮ、ＴＡLＥＮ中的FｏkI是源于黃單胞桿菌的一種限制性核酸內(nèi)切酶，它只有形成二聚體時才對dsＤNA具有剪切活性。FokI切割DNA后的修復(fù)機制相同：在兩個靶位點之間剪切DNA，在DSＢ處誘發(fā)DＮA的同源重組修復(fù)機制和非同源末端連接修復(fù)機制，從而達到定點修飾。2．2不同點開發(fā)時間：最早的ＺＦＮ出現(xiàn)在１８年前,而TAＬＥN技術(shù)才于2007年問世.靶DNA序列的識別：ZF結(jié)構(gòu)域識別的是三聯(lián)堿基，而TALＥN結(jié)構(gòu)域識別的是某特定的核苷酸。例如：某蛋白包括兩個鋅指結(jié)構(gòu)域,可識別六個堿基;而當(dāng)它包括兩個TALＥN結(jié)構(gòu)域時即兩個RVD，僅能識別兩個堿基.此外，ＴＡＬEＮ的RVD與堿基之間的對應(yīng)關(guān)系與物種、細胞、ＤＮA序列無關(guān),并且設(shè)計簡單,成本低,與ＺFN相比活性更高。上下文依賴效應(yīng):ＺFN在識別ＤＮA序列時,重復(fù)氨基酸之間會產(chǎn)生相互作用,也就是上下文依賴效應(yīng),從而使得識別的特異性發(fā)生了改變,影響基因修飾效率.還未見TALEN上下文依賴效應(yīng)的相關(guān)報道。對細胞的毒性效應(yīng)：鋅指酶切割DNA時易產(chǎn)生脫靶現(xiàn)象,對細胞產(chǎn)生了毒副作用。TＡLEN脫靶情況較少,毒性小。例如：通過點對點地比較二者對人細胞內(nèi)源基因CCR5的刪除效果，發(fā)現(xiàn)在效率大體相同的情況下,目前實驗數(shù)據(jù)顯示TALE所產(chǎn)生的細胞毒性比ZFN小得多。靶向基因序列長度:與ZＦN相比，TALEN可以識別更長的靶基因序列。三、存在的問題與展望目前,ZＦN技術(shù)還存在以下困惑:鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合的特異性、親和性有待提高；如何讓解決ZFN的高效導(dǎo)入、可調(diào)控切、瞬時表達問題;ＺFN對細胞的潛在綜合作用需進行綜合評價，并對引起的潛在免疫反應(yīng),尤其是針對于源于細菌的ＦｏｋI結(jié)構(gòu)域的客觀評價。同樣地，TALEＮ技術(shù)還存在以下問題:設(shè)計識別２0個堿基含有1000多個氨基酸的TALEN蛋白，會引起機體的免疫應(yīng)答,降低了其在細胞中的打靶效率；TALEＮ同樣會產(chǎn)生脫靶的現(xiàn)象，可能由于細胞中染色體的狀態(tài)引起,如ＴＡLEＮ技術(shù)對于異染色質(zhì)化的基因無效；ＴＡＬEN技術(shù)的應(yīng)用主要集中在基因敲除方面，但是否適合大片段基因的插入尚不明確。ＺFN、TAＬEＮ技術(shù)為人們定向改造基因提供了基礎(chǔ)，但相關(guān)應(yīng)用還處于初級階段，但他們在轉(zhuǎn)基因動、植物的研究方面尤其是TAＬＥN技術(shù)在基因治療上仍然顯示出了巨大的應(yīng)用價值。2012年Scieｎｃｅ在評述中把TAＬＥN稱為基因組的“巡航導(dǎo)彈”,還大膽預(yù)測ＴALEN技術(shù)將成為所有分子生物學(xué)實驗室都要掌握的基本實驗技能?；蚬こ碳夹g(shù)的現(xiàn)狀和前景發(fā)展

摘要

從2０世紀70年代初發(fā)展起來的基因工程技術(shù)，經(jīng)過30多年來的進步與發(fā)展,已成為生物技術(shù)的核心內(nèi)容。許多科學(xué)家預(yù)言，生物學(xué)將成為21世紀最重要的學(xué)科,基因工程及相關(guān)領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)將成為２1世紀的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一?；蚬こ萄芯亢蛻?yīng)用范圍涉及農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥、能源、環(huán)保等許多領(lǐng)域。?基因工程應(yīng)用于植物方面?農(nóng)業(yè)領(lǐng)域是目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域之一。農(nóng)作物生物技術(shù)的目的是提高作物產(chǎn)量,改善品質(zhì)，增強作物抗逆性、抗病蟲害的能力。基因工程在這些領(lǐng)域已取得了令人矚目的成就.由于植物病毒分子生物學(xué)的發(fā)展，植物抗病基因工程也也已全面展開。自從發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒（TMV)的外殼蛋白基因?qū)霟煵葜?，在轉(zhuǎn)基因植株上明顯延遲發(fā)病時間或減輕病害的癥狀，通過導(dǎo)入植物病毒外殼蛋白來提高植物抗病毒的能力，已用多種植物病毒進行了試驗。

在利用基因工程手段增強植物對細菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大進展.植物對逆境的抗性一直是植物生物學(xué)家關(guān)心的問題。由于植物生理學(xué)家、遺傳學(xué)家和分子生物學(xué)家協(xié)同作戰(zhàn)，耐澇、耐鹽堿、耐旱和耐冷的轉(zhuǎn)基因作物新品種(系）也已獲得成功。植物的抗寒性對其生長發(fā)育尤為重要。科學(xué)家發(fā)現(xiàn)極地的魚體內(nèi)有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的增長,從而免受低溫的凍害并正常地生活在寒冷的極地中.將這種抗凍蛋白基因從魚基因組中分離出來，導(dǎo)入植物體可獲得轉(zhuǎn)基因植物,目前這種基因已被轉(zhuǎn)入番茄和黃瓜中。

隨著生活水平的提高，人們越來越關(guān)注口味、口感、營養(yǎng)成分、欣賞價值等品質(zhì)性狀。實踐證明，利用基因工程可以有效地改善植物的品質(zhì),而且越來越多的基因工程植物進入了商品化生產(chǎn)領(lǐng)域，近幾年利用基因工程改良作物品質(zhì)也取得了不少進展,如美國國際植物研究所的科學(xué)家們從大豆中獲取蛋白質(zhì)合成基因，成功地導(dǎo)入到馬鈴薯中，培育出高蛋白馬鈴薯品種，其蛋白質(zhì)含量接近大豆,**提高了營養(yǎng)價值，得到了農(nóng)場主及消費者的普遍歡迎。在花色、花香、花姿等性狀的改良上也作了大量的研究。

基因工程應(yīng)用于醫(yī)藥方面?目前,以基因工程藥物為主導(dǎo)的基因工程應(yīng)用產(chǎn)業(yè)已成為全球發(fā)展最快的產(chǎn)業(yè)之一，發(fā)展前景非常廣闊.基因工程藥物主要包括細胞因子、抗體、疫苗、激素和寡核甘酸藥物等。它們對預(yù)防人類的腫瘤、心血管疾病、遺傳病、糖尿病、包括艾滋病在內(nèi)的各種傳染病、類風(fēng)濕疾病等有重要作用.在很多領(lǐng)域特別是疑難病癥上，基因工程工程藥物起到了傳統(tǒng)化學(xué)藥物難以達到的作用。我們最為熟悉的干擾素(ＩFN)就是一類利用基因工程技術(shù)研制成的多功能細胞因子,在臨床上已用于治療白血病、乙肝、丙肝、多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多種疾病。

目前，應(yīng)用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中試，并進入臨床驗證階段；專門用于治療腫瘤的“腫瘤基因?qū)?也將在不久完成研制，它可有目的地尋找并殺死腫瘤,將使癌癥的治愈成為可能。由中國、美國、德國三國科學(xué)家及中外六家研究機構(gòu)參與研制的專門用于治療乙肝、慢遷肝、慢活肝、丙肝、肝硬化的體細胞基因生物注射劑,最終解決了從剪切、分離到吞食肝細胞內(nèi)肝炎病毒，修復(fù)、促進肝細胞再生的全過程.經(jīng)4年臨床試驗已在全國面向肝炎患者。此項基因?qū)W研究成果在國際治肝領(lǐng)域中，是繼干擾素等藥物之后的一項具有革命性轉(zhuǎn)變的重大醫(yī)學(xué)成果。基因工程應(yīng)用于環(huán)保方面工業(yè)發(fā)展以及其它人為因素造成的環(huán)境污染已遠遠超出了自然界微生物的凈化能力，已成為人們十分關(guān)注的問題。基因工程技術(shù)可提高微生物凈化環(huán)境的能力。美國利用DNＡ重組技術(shù)把降解芳烴、萜烴、多環(huán)芳烴、脂肪烴的4種菌體基因鏈接，轉(zhuǎn)移到某一菌體中構(gòu)建出可同時降解4種有機物的“超級細菌”，用之清除石油污染，在數(shù)小時內(nèi)可將水上浮油中的2/3烴類降解完,而天然菌株需1年之久.也有人把Ｂt蛋白基因、球形芽孢桿菌、且表達成功。它能釘死蚊蟲與害蟲，而對人畜無害，不污染環(huán)境.現(xiàn)已開發(fā)出的基因工程菌有凈化農(nóng)藥的ＤDＴ的細菌、降解水中的染料、環(huán)境中有機氯苯類和氯酚類、多氯聯(lián)苯的工程菌、降解土壤中的TＮT炸藥的工程菌及用于吸附無機有毒化合物（鉛、汞、鎘等）的基因工程菌及植物等.

90年代后期問世的DNA改組技術(shù)可以創(chuàng)新基因,并賦予表達產(chǎn)物以新的功能，創(chuàng)造出全新的微生物，如可將降解某一污染物的不同細菌的基因通過ＰＣR技術(shù)全部克隆出來，再利用基因重組技術(shù)在體外加工重組，最后導(dǎo)入合適的載體，就有可能產(chǎn)生一種或幾種具有非凡降解能力的超級菌株，從而＊＊地提高降解效率.四、前景展望由于基因工程運用DNA分子重組技術(shù)，能夠按照人們預(yù)先的設(shè)計創(chuàng)造出許多新的遺傳結(jié)合體,具有新奇遺傳性狀的新型產(chǎn)物，增強了人們改造動植物的主觀能動性、預(yù)見性。而且在人類疾病的診斷、治療等方面具有革命性的推動作用，對人口素質(zhì)、環(huán)境保護等作出具大貢獻。所以，各國政府及一些大公司都十分重視基因工程技術(shù)的研究與開發(fā)應(yīng)用，搶奪這一高科技制高點。其應(yīng)用前景十分廣闊。我國基因工程技術(shù)尚落后于發(fā)達國家，更應(yīng)當(dāng)加速發(fā)展，切不可坐失良機。

但是，任何科學(xué)技術(shù)都是一把“雙刃劍”,在給人類帶來利益的同時，也會給人類帶來一定的災(zāi)難.比如基因藥物,它不僅能根治遺傳性疾病、惡性腫瘤、心腦血管疾病等,甚至人的智力、體魄、性格、外表等亦可隨意加以改造；還有,克隆技術(shù)如果不加限制，任其自由發(fā)展，最終有可能導(dǎo)致人類的毀滅。還有，盡管目前的轉(zhuǎn)基因動植物還未發(fā)現(xiàn)對人類有什么危害,但不等于說轉(zhuǎn)基因動植物就是十分安全的，畢竟這些東西還是新生事物，需要實踐慢慢地檢驗.轉(zhuǎn)基因生物和常規(guī)繁殖生長的品種一樣,是在原有品種的基礎(chǔ)上對其部分性狀進行修飾或增加新性狀，或消除原來的不利性狀，但常規(guī)育種是通過自然選擇，而且是近緣雜交,適者生存下來,不適者被淘汰掉。而轉(zhuǎn)基因生物遠遠超出了近緣的范圍，人們對可能出現(xiàn)的新組合、新性狀會不會影響人類健康和環(huán)境，還缺乏知識和經(jīng)驗，按目前的科學(xué)水平還不能完全精確地預(yù)測.所以,我們要在抓住機遇，大力發(fā)展基因工程技術(shù)的同時，需要嚴格管理，充分重視轉(zhuǎn)基因生物的安全性。近兩年來我國化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域的突出進展時間:20１5—04-17來源:學(xué)術(shù)堂所屬分類：

應(yīng)用化學(xué)論文近年來，化學(xué)生物學(xué)已經(jīng)成為具有舉足輕重作用的一門新興交叉學(xué)科，是推動未來生命科學(xué)和生物醫(yī)藥發(fā)展的關(guān)鍵研究領(lǐng)域。通過充分發(fā)揮化學(xué)和生物學(xué)、醫(yī)學(xué)交叉的優(yōu)勢，化學(xué)生物學(xué)的研究具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用前景，能夠深入揭示生物學(xué)新規(guī)律，促進新藥、新靶標和新的藥物作用機制的發(fā)現(xiàn),造福于人類的健康事業(yè)，推動社會經(jīng)濟發(fā)展。目前，化學(xué)生物學(xué)研究已經(jīng)引起各國政府和全球重要科研機構(gòu)的高度重視，成為發(fā)達國家競相資助和優(yōu)先發(fā)展的領(lǐng)域之一?；瘜W(xué)生物學(xué)研究受到各國政府、科研機構(gòu)和大制藥公司的高度重視。美國國立健康研究院（NＩＨ)提出的生物醫(yī)學(xué)路線圖計劃(NIＨRoadmap），將化學(xué)生物學(xué)設(shè)定為5個研究方向之一。它們還設(shè)立了巨額預(yù)算作為化學(xué)生物學(xué)的培訓(xùn)經(jīng)費以及建立了若干著名的小分子化合物篩選平臺。例如，博大研究院（BrｏａdInstitute)就是一個由哈佛大學(xué)和麻省理工學(xué)院共建的合作單位，致力于開發(fā)在生命科學(xué)和醫(yī)藥學(xué)中能探究基因組學(xué)的新工具?；瘜W(xué)遺傳學(xué)（chemicalgenetｉcs）以及化學(xué)基因組學(xué)（cheｍiｃalgｅnoｍicｓ）在該過程中發(fā)揮著重要的作用。耶魯大學(xué)基因組和蛋白質(zhì)組研究中心（YａlｅUnｉverｓiｔyCenterforＧeｎｏmiｃsaｎdProｔｅomｉcs）專門成立了化學(xué)生物學(xué)研究小組,從事化學(xué)生物學(xué)新技術(shù)的開發(fā)，并應(yīng)用于功能基因組等方面的研究中.美、日和大部分歐洲發(fā)達國家的一流大學(xué)均建立了化學(xué)生物學(xué)人才培養(yǎng)計劃.各出版機構(gòu)都相繼出版了高水平的化學(xué)生物學(xué)專業(yè)學(xué)術(shù)雜志，此外許多生物和化學(xué)國際會議也設(shè)立了化學(xué)生物學(xué)分會。這些努力都極大地推動了國際上化學(xué)生物學(xué)研究水平的快速進步。在化學(xué)生物學(xué)的發(fā)展過程中,相繼出現(xiàn)了如組合化學(xué)、高通量篩選技術(shù)、分子進化、基因組（芯片）技術(shù)、單分子和單細胞技術(shù)等一系列新技術(shù)和新方法,為化學(xué)與生物學(xué)、醫(yī)學(xué)交叉領(lǐng)域的研究注入了新的內(nèi)涵和驅(qū)動力.近年來，化學(xué)生物學(xué)家以小分子探針為主要工具，對細胞生命現(xiàn)象，尤其是細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要分子事件和機理進行了深入的研究。通過充分發(fā)揮小分子化學(xué)探針研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的優(yōu)勢，探索和闡述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子事件與規(guī)律以及在病理狀態(tài)下的變化規(guī)律,為疾病的診斷和治療研究探索新的思路.與此同時,化學(xué)生物學(xué)在與包括生物化學(xué)、分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、細胞生物學(xué)等領(lǐng)域的交叉合作越發(fā)深入，研究優(yōu)勢越發(fā)明顯,這也推動了化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、材料科學(xué)和生物學(xué)科相關(guān)前沿的探索研究，現(xiàn)舉例介紹目前的一些具體的交叉研究趨勢:第一，生物有機化學(xué)與細胞生物學(xué)的交叉融合，利用有機化學(xué)手段，通過設(shè)計合成一系列多樣化的分子探針，研究細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的重要分子機理;第二,藥物化學(xué)與醫(yī)學(xué)的交叉融合,為了實現(xiàn)“從功能基因到藥物”的藥物研發(fā)模式,采用信號傳導(dǎo)過程研究與靶標發(fā)現(xiàn)相結(jié)合，注重藥物靶標功能確證與化合物篩選相融合的研究策略;第三，化學(xué)生物技術(shù)與生命科學(xué)問題的交叉融合，以化學(xué)生物學(xué)技術(shù)為手段，著重發(fā)展針對蛋白質(zhì)、核酸和糖等生物大分子的特異標記與操縱方法,以揭示它們所參與的生命活動的調(diào)控機制；第四,分析化學(xué)與生物學(xué)的交叉融合,以化學(xué)分析為手段,發(fā)展在分子水平、細胞水平或活體動物水平上獲取生物學(xué)信息的新方法和新技術(shù).化學(xué)在讓生命可視、可控、可創(chuàng)造的進程中日益彰顯其核心作用。以下對近兩年來我國化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域取得的突出進展加以具體的歸納和介紹。1基于小分子化合物及探針的研究1.1以小分子化合物為探針，深入研究細胞生理、病理活動的調(diào)控機制

自吞噬（ａutophagｙ）是細胞內(nèi)的一個重要降解機制.中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所馬大為和美國哈佛大學(xué)袁鈞英合作，發(fā)現(xiàn)ｓpautin－１可以特異性地抑制泛素化酶USP１0和USP13，進一步促進了VＰS34／P１３復(fù)合物的降解，導(dǎo)致特異性地抑制自吞噬。他們發(fā)現(xiàn)USP10和UＳP13作用于VPＳ3４/P13復(fù)合物的亞單位Ｂｅｃｌin-1，Ｂecｌin-1是一腫瘤抑制劑，調(diào)控P５３的水平。他們的發(fā)現(xiàn)提供了一個蛋白去泛素化調(diào)控P５３和Beclｉｎ—１的水平、抑制腫瘤的新機制［1].近年來,細胞壞死逐漸被認為是哺乳動物的發(fā)育和生理過程的重要組成部分，并參與了人類的多種病理過程。雷曉光和王曉東等通過篩選得到1個抑制細胞壞死的小分子化合物壞死磺酰胺(necrosｕｌfｏnamide)。此前王曉東實驗室的研究證實了RＩP３的激酶活性在腫瘤壞死因子TNF－α誘導(dǎo)的細胞壞死過程中是不可或缺的，并發(fā)現(xiàn)MLKＬ扮演著ＲIP3激酶其中1個底物的角色。這次發(fā)現(xiàn)的小分子正是通過特異識別MLＫL而阻止壞死信號的傳導(dǎo)［2]，對于設(shè)計并開發(fā)針對細胞壞死相關(guān)疾病的藥物起到了極大的提示和推動作用。裴端卿等繼發(fā)現(xiàn)維生素C能夠顯著提高小鼠與人的體細胞重編程效率（效率可以達到約10％)引起廣泛關(guān)注之后,進一步研究發(fā)現(xiàn)體細胞的組蛋白去甲基化酶Jｈdm1a／1b是維生素C介導(dǎo)的細胞重編程的關(guān)鍵作用因子。他們發(fā)現(xiàn)，維生素C能夠誘導(dǎo)小鼠成纖維細胞H3Ｋ36me2／3去甲基化,并促進體細胞重編程。該工作也證明了制約體細胞“變身"的分子障礙是組蛋白H3K3６me2/3，而維生素C能夠突破這一障礙從而促進重編程的發(fā)生［3］,該工作被選為了《CeｌｌＳtｅｍCｅｌl》當(dāng)期的封面文章.鄧宏魁等通過系列篩選工作，首次發(fā)現(xiàn)４個小分子化合物可以完全替代Ｙamaｎaka四因子，將小鼠體細胞誘導(dǎo)成為多潛能性干細胞，這項工作將直接導(dǎo)致化學(xué)再生醫(yī)藥新領(lǐng)域的產(chǎn)生［4］。宋保亮等針對膽固醇負反饋調(diào)控途徑，篩選活性小分子化合物,研究其對代謝性疾病的功能作用，并揭示膽固醇代謝負反饋調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制.首先他們針對ＳREBP途徑構(gòu)建報告基因系統(tǒng)，對數(shù)千種化合物進行篩選，獲得1種名為白樺酯醇的小分子化合物，它能夠特異性地阻斷ＳＲEＢP的成熟,抑制其活性。在細胞水平,白樺酯醇能顯著抑制膽固醇、脂肪酸和甘油三酯等脂質(zhì)合成基因的表達，減少脂質(zhì)合成，降低細胞內(nèi)脂質(zhì)含量.因此,白樺酯醇具有良好的抗動脈粥樣硬化作用和Ⅱ型糖尿病的治療作用[5]。1。2若干細胞關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究

李林發(fā)現(xiàn)了ＮC04３和中國科學(xué)院昆明植物研究所郝小江發(fā)現(xiàn)了天然產(chǎn)物S3類似物ＨLY７8兩個全新的調(diào)節(jié)Wｎt信號途徑的小分子。其中，ＮC043影響細胞內(nèi)β—cａｔeｎin和ＴCF4的相互作用而抑制Wnt信號途徑并抑制結(jié)腸癌細胞的生長［6］;S３抑制經(jīng)典Ｗnｔ信號途徑，并且它發(fā)揮作用的主要機制是在細胞核里，這為治療由于經(jīng)典Wnt信號途徑異常激活而引起的癌癥提供了先導(dǎo)化合物。同時,他們還發(fā)現(xiàn)S3對于不同的經(jīng)典Wnt信號途徑異常激活的腫瘤細胞系的抑制效率也是不一樣的，這為后期探明不同腫瘤細胞系之間的差別和揭示Ｗnt信號途徑下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機理提供了契機。1.３重要靶標、抑制劑和標記物的發(fā)現(xiàn)

陳國強等在前期發(fā)現(xiàn)從腺花香茶菜中提取的腺花素(Adenaｎthin)能夠誘導(dǎo)白血病細胞分化的基礎(chǔ)上,成功地捕獲了它在細胞內(nèi)的靶蛋白—-—過氧化還原酶(perｏxirｅｄoｘｉn）Ｉ／ＩＩ,并依此闡釋了白血病細胞分化的新機理[7]。通過對腺花素進行分子改造，并在明確其活性基團后,合成生物素標記的腺花素分子，他們借助蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)平臺的支持，以生物素標記的腺花素為“誘餌"，利用蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù),在白血病細胞中“垂釣”腺花素可能結(jié)合的蛋白質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn),腺花素能夠與過氧化還原酶PrxI和PrxＩI共價結(jié)合,該工作對白血病的病理研究及治療都將起到極大的推動作用。吳喬、林天偉、黃培強等發(fā)現(xiàn)了名為ＴＭPA的化合物，能夠通過與吳喬等前期發(fā)現(xiàn)的與糖代謝調(diào)控密切相關(guān)的新靶點—Nuｒ77的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)合，使原先結(jié)合Nｕr77的ＬKB1得到分子釋放。后者能夠從細胞核轉(zhuǎn)運到胞漿,并激活直接參與糖代謝調(diào)控的重要蛋白激酶ＡMPＫ，達到降低血糖目的。此外，他們還通過晶體結(jié)構(gòu)解析了Nuｒ77－ＴMＰA的復(fù)合物晶體，從原子水平上進一步解釋了TMPＡ結(jié)合Nur77的構(gòu)象和精確位點，為今后設(shè)計和研發(fā)新型的糖尿病藥物提供了必不可少的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［8].該工作所發(fā)現(xiàn)的化合物ＴＭPA或可成為一種新型糖尿病治療藥物的“雛形"，為未來新型糖尿病治療藥物的研發(fā)提供一個全新方向和路徑。楊財廣等[9]進行了基于mRNA中N6位甲基化修飾的腺嘌呤（N6-mｅtｈyladｅnosｉne，m6Ａ)去甲基化酶FTO結(jié)構(gòu)開展小分子調(diào)控的研究，首次獲得了對核酸去甲基化酶FTO具有酶活和細胞活性的小分子抑制劑.張翱、鎮(zhèn)學(xué)初等[10]針對帕金森氏病治療過程中出現(xiàn)的異動癥進行作用機制研究，闡明了５—羥色胺1A受體和FosB基因與異動癥的關(guān)系,進而發(fā)現(xiàn)了同時靶向多巴胺D2和5—羥色胺１Ａ受體的新型抗帕金森活性化合物.1.4天然產(chǎn)物分子的生物及化學(xué)合成譚仁祥等通過研究發(fā)現(xiàn)了螳螂腸道真菌(Daldiniａeｓchscholzｉi）產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)全新的Dalesｃonoｌ類免疫抑制物及其獨特的“異構(gòu)體冗余現(xiàn)象”。在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)Ｄaｌescoｎol類免疫抑制物是由不同的萘酚通過酚氧游離基耦合產(chǎn)生的，同時發(fā)現(xiàn)其“異構(gòu)體冗余現(xiàn)象"很可能源于真菌漆酶引致的關(guān)鍵中間體優(yōu)勢構(gòu)象［１1］.該成果不僅為此類免疫抑制物來源問題的解決奠定了重要基礎(chǔ)，而且為酚類合成生物學(xué)研究提供了新的思路和概念。萘啶霉素(NDM)、奎諾卡星(ＱＮC）及Ecｔeiｎaｓcｉdin743（EＴ—7４３)均屬于四氫異喹啉生物堿家族化合物,它們都具有顯著的抗腫瘤活性,其中EＴ－743已發(fā)展為第1例海洋天然產(chǎn)物來源的抗腫瘤新藥。這3種化合物都具有一個獨特的二碳單元結(jié)構(gòu)，其生物合成來源問題一直沒有得到解決。唐功利等［12］在克隆了ＮDM和ＱＮC生物合成基因簇的基礎(chǔ)上,通過前體喂養(yǎng)標記、體內(nèi)相關(guān)基因敲除－回補以及體外酶催化反應(yīng)等多種實驗手段相結(jié)合的方式，闡明了二碳單元的獨特生源合成機制：ＮapＢ/Ｄ及ＱｎcＮ／L在催化功能上均屬于丙酮酸脫氫酶及轉(zhuǎn)酮醇酶的復(fù)合體，它們負責(zé)催化二碳單元由酮糖轉(zhuǎn)移至?；休d蛋白(ACP)上，而后經(jīng)過非核糖體蛋白合成(ＮＲPS)途經(jīng)進入到最終的化合物中.這種將基礎(chǔ)代謝中的酮糖直接轉(zhuǎn)化為次級代謝所需要的二碳單元在非核糖體肽合成途徑中是首次報道.該研究結(jié)果也有助于揭示海洋藥物ET-743獨特的二碳單元生物合成來源,為非核糖體聚肽類天然產(chǎn)物的組合生物合成帶來新的前體單元。此外,他們還利用全基因組掃描技術(shù)定位了抗生素谷田霉素生物合成的基因簇，通過基因敲除結(jié)合生物信息學(xué)分析確定了基因簇邊界。谷田霉素可以抑制致病真菌，且對腫瘤細胞表現(xiàn)出極強的毒性(比抗腫瘤藥物絲裂霉素的活性高約1０00倍）;該家族化合物屬于ＤNA烷基化試劑，典型的結(jié)構(gòu)特征是吡咯吲哚環(huán)上的環(huán)丙烷結(jié)構(gòu)。在對突變株的發(fā)酵檢測中成功分離、鑒定了中間體YTM—T的結(jié)構(gòu),并結(jié)合體外生化實驗揭示了一類同源于糞卟啉原ＩＩＩ－氧化酶(CoproporｐｈｙrinogｅｎＩIＩoxidase)的甲基化酶以自由基機理催化YTM—T發(fā)生Ｃ－甲基化[1３］，這是此類蛋白催化自由基甲基化反應(yīng)的首例報道,為下一步闡明YTM結(jié)構(gòu)中最重要的環(huán)丙烷部分生物合成途徑奠定了基礎(chǔ).Pyrｒｏinｄoｍｙｃins(PTR)是能夠有效對抗各類耐藥病原體的一種天然產(chǎn)物，它含有１個環(huán)己烯環(huán)螺連接的ｔetramaｔe這一獨特的結(jié)構(gòu)。劉文等［14］通過對ＰYR生物合成的研究揭示了2個新的蛋白質(zhì)，均能夠單獨在體外通過迪克曼環(huán)化反應(yīng)將N—乙酰乙?；?l-丙氨酰硫酯轉(zhuǎn)化成tetraｍaｔe。這一工作揭示了一種通過酶的方式首先生成C-X（X＝O或N)鍵，然后再生成C-C鍵來構(gòu)建５元雜環(huán)的生物合成途徑。1。5金屬催化劑在活細胞及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的應(yīng)用利用化學(xué)小分子在活體環(huán)境下實現(xiàn)生物大分子的高度特異調(diào)控是化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域的前沿?zé)狳c問題之一。作為生物體內(nèi)含量最多的一類生物大分子，蛋白質(zhì)幾乎參與了所有的生命活動，因此“在體”研究與調(diào)控其活性及生物功能意義重大。與發(fā)展較為成熟的蛋白質(zhì)活性抑制劑及相應(yīng)的“功能缺失性”研究相比,小分子激活劑對于研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能更為有效。這主要是因為后者可以在活細胞及活體動物、組織內(nèi)實現(xiàn)“功能獲得性”研究，從而為目標蛋白質(zhì)在天然環(huán)境下的功能及其在生命活動中扮演的角色提供更準確和細致的信息。然而，通過小分子實現(xiàn)蛋白質(zhì)的原位激活是一項極具挑戰(zhàn)性的任務(wù)，目前大多數(shù)成功的例子都來源于大規(guī)模小分子庫篩選而獲得的針對某一特殊蛋白質(zhì)靶標的“別構(gòu)劑”,而沒有一種廣泛適用于不同類型蛋白質(zhì)的普適性小分子激活策略.陳鵬課題組通過將基于鈀催化劑的“脫保護反應(yīng)”與非天然氨基酸定點插入技術(shù)相結(jié)合，首次利用小分子鈀催化劑激活了活細胞內(nèi)的特定蛋白質(zhì)[15］.該方法通過將一種帶有化學(xué)保護基團的賴氨酸（炔丙基碳酸酯－賴氨酸，Prｏｃ-賴氨酸）以非天然氨基酸的形式定點取代目標蛋白質(zhì)上關(guān)鍵活性位點的天然賴氨酸,使蛋白質(zhì)的活性處于“關(guān)閉“狀態(tài).利用能夠高效催化“脫保護反應(yīng)”的鈀化合物，他們在活細胞內(nèi)實現(xiàn)了蛋白質(zhì)側(cè)鏈的原位脫保護反應(yīng)（Prｏｃ-賴氨酸向天然賴氨酸的轉(zhuǎn)化）,使該蛋白質(zhì)重新回到“開啟”狀態(tài),實現(xiàn)“原位”激活。這一策略的優(yōu)勢在于將非天然氨基酸直接插入了目標蛋白質(zhì)酶的催化活性位點,使其處于完全“關(guān)閉”的狀態(tài)；而在激活過程中只要產(chǎn)生少量的處于“開啟"狀態(tài)的蛋白質(zhì)就足以對其功能及相關(guān)生物學(xué)功能進行研究.利用這一技術(shù)，他們深入研究了一種細菌三型分泌系統(tǒng)的毒素效應(yīng)蛋白OspＦ（磷酸絲氨酸裂解酶）對宿主細胞內(nèi)的胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Erk)參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響,并證明了該方法可作為普適性平臺，為活細胞及活體內(nèi)的生物大分子激活提供了新的策略和工具。2基于蛋白質(zhì)和多肽的研究李艷梅課題組長期致力于化學(xué)合成糖肽疫苗和免疫學(xué)研究，取得了一系列成果.現(xiàn)階段化學(xué)合成疫苗的研究主要存在兩大問題:一是需要尋找有效的特異性抗原，以區(qū)分正常組織和病變組織，二是需要尋找疫苗體系以打破免疫耐受,促進機體免疫反應(yīng)。針對第1個問題，他們以ＭＵC1糖肽為骨架,合成了具有不同糖基化修飾的腫瘤相關(guān)糖肽抗原.以牛血清白蛋白為載體，篩選表位，并研究構(gòu)效關(guān)系，發(fā)現(xiàn)T9位蘇氨酸的糖基化修飾對糖肽的免疫原性具有至關(guān)重要的影響.針對第2個問題,他們對疫苗進行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化，通過T細胞表位、免疫刺激劑和自組裝片段等策略提高免疫反應(yīng)效果，設(shè)計合成了兩組分疫苗、三組分疫苗以及自組裝疫苗等一系列高效的疫苗,能夠產(chǎn)生高強度的IｇG抗體,同時可以通過疫苗分子調(diào)節(jié)體液免疫和細胞免疫.這些疫苗產(chǎn)生的抗體能夠結(jié)合并通過補體依賴細胞毒性作用殺死瘤細胞.該研究為進一步的疫苗研究打下了堅實的基礎(chǔ)［１6，17］。目前，治療癌癥的主要方法仍然是化療法。利用能夠特異性靶向癌細胞的藥物可以減少藥物的負效應(yīng)，提高癌癥患者的治愈率.不同類型的納米載體,如脂質(zhì)體類、多聚納米顆粒、嵌段共聚物膠團和樹枝狀高分子，常用于抗癌藥物的靶向性釋放。為了更大地提高抗癌藥物的特異性釋放效率，多種方法被相繼開發(fā),例如,將葉酸配體引入納米載體引導(dǎo)藥物靶向癌細胞的特定部位，將對生理特性的環(huán)境敏感分子(酸度敏感分子、溫控分子以及特定酶響應(yīng)分子）引入納米載體用于體內(nèi)特定環(huán)境的釋放。劉克良等[18］制備了外圍為疏水性含有葉酸修飾的聚乙二醇（PEG)而核心為超順磁性Fｅ3O４的納米藥物載體,并展示了該組裝體細胞內(nèi)酸性環(huán)境定點釋放ADＲ藥物的功能。非共價作用力是維持蛋白三維結(jié)構(gòu)的重要因素，小型多肽因結(jié)構(gòu)小和非共價相互作用位點少而難以形成穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu).他們[１9～２１]利用多肽間相互作用催化分子間硫酯的胺解，制備了新型的共價偶聯(lián)的６HＢ多肽分子,并在多種條件下展示均具有高的熱穩(wěn)定性.該策略為穩(wěn)定多肽的三維結(jié)構(gòu)提供了新的思路?；瘜W(xué)方法能夠?qū)崿F(xiàn)原子水平精確控制蛋白質(zhì)的序列和結(jié)構(gòu),是獲取特定修飾的生物體系難以表達的蛋白質(zhì)的一種重要手段。當(dāng)前使用最為廣泛的技術(shù)是以硫酯為合成子的自然化學(xué)連接反應(yīng)。然而，多肽硫酯因其高度的熱不穩(wěn)定性和反應(yīng)活性而不容易采用目前最為廣泛使用的Fmoｃ固相合成技術(shù)合成。劉磊等[２2]利用烯胺的水解反應(yīng),基于所提出的溶液中分子內(nèi)從Ｎ到Ｓ不可逆?；w移制備硫酯的策略,以多肽酰胺為底物，實現(xiàn)了Fｍoc固相合成硫酯。基于酰肼能夠在弱酸性條件下被亞硝酸轉(zhuǎn)化為?；B氮的特征，劉磊等發(fā)展了以多肽酰肼為結(jié)構(gòu)單元的合成蛋白質(zhì)的多肽酰肼連接技術(shù)［23],結(jié)合保護基Tbeoc實現(xiàn)了全收斂酰肼連接制備蛋白質(zhì)［２4］,并結(jié)合非天然氨基酸嵌入技術(shù)發(fā)展出蛋白質(zhì)半合成的新策略[2５]。抑制病變蛋白Aβ聚集及解聚已成為治療阿爾茨海默癥(AＤ）的重要手段，受到人們的廣泛關(guān)注。大多數(shù)報道的Aβ抑制劑是有機小分子或肽.然而,這些抑制劑或不能穿透血腦屏障(BBB），或缺乏與Ａβ的識別能力，應(yīng)用受到限制。能夠靶向結(jié)合Aβ,進而抑制Aβ聚集的藥物成為本領(lǐng)域目前研究的重點。利用自主設(shè)計細胞熒光篩選體系,結(jié)合化學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、生物物理和現(xiàn)代波譜學(xué)等手段，曲曉剛等發(fā)現(xiàn)一些特殊結(jié)構(gòu)類型聚金屬氧酸鹽能夠調(diào)控AD病變蛋白Aβ的聚集,抑制效果與聚金屬氧酸鹽的結(jié)構(gòu)、所帶電荷數(shù)及體積密切相關(guān)。研究成果作為封面文章發(fā)表在德國《Anｇew。Cｈem．Ｉｎｔ．Ed?！罚郏?]并被《C＆EＮNews》作為亮點給予報道.此外,他們最新研究發(fā)現(xiàn),具有鋅指結(jié)構(gòu)的2個三螺旋金屬超分子化合物能夠有效地抑制Aβ聚集，并已獲得專利授權(quán)。進一步研究表明，這2個金屬超分子化合物能夠特定地結(jié)合在α／β－不一致伸縮區(qū)域，抑制Aβ的細胞毒性。體內(nèi)研究表明,這些化合物可改善轉(zhuǎn)基因小鼠模型的空間記憶障礙,并降低腦內(nèi)不溶性Aβ的水平。同時，該化合物還能解聚已經(jīng)形成的Aβ聚集體。這表明金屬超分子化合物不僅可以預(yù)防早期ＡD的發(fā)生，還具有緩解AＤ的作用，并已獲專利授權(quán)。這將為設(shè)計和篩選金屬超分子化合物作為Aβ抑制劑提供新的途徑.工作作為封面文章發(fā)表在《Cｈem．Ｓci．》［27］,并被英國皇家化學(xué)會《ChｅｍｉsｔryWorld》以“新超分子阿爾茨海默癥藥物(NewsupｒａmoleculaｒAlzｈeｉmeｒ’ｓdrugs）”[26］為題給予亮點報道。劉揚中等［２9］開展了金屬配合物抑制結(jié)核菌內(nèi)的蛋白剪接功能的研究,發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌內(nèi)一些酶通過Inｔｅｉn的蛋白剪接被活化，抑制蛋白剪接將抑制結(jié)核菌的生長.高等生物不具有Intein，因而Intein是抗結(jié)核菌藥物的理想靶點。通過體外蛋白剪接實驗和細胞實驗證實，順鉑在結(jié)核菌的作用靶點是Ｉnｔeiｎ蛋白。王江云課題組[30］通過擴展基因密碼子，實現(xiàn)了具有光點擊活性的非天然氨基酸環(huán)丙烯賴氨酸在哺乳動物中的基因編碼。光照條件下,特異位點整合了環(huán)丙烯賴氨酸的蛋白質(zhì)與小分子四唑化合物發(fā)生環(huán)加成反應(yīng),生成熒光活性基團，從而實現(xiàn)了時空可控的對哺乳動物細胞內(nèi)蛋白特異位點的標記.此外，該課題組和陸藝課題組利用非天然氨基酸的定點插入，首次實現(xiàn)了用18kD的肌紅蛋白模擬呼吸鏈中重要膜蛋白復(fù)合物細胞色素c氧化酶。該工作首次提供了細胞色素ｃ氧化酶中保守翻譯后修飾Ｔyｒ—Ｈｉｓ功能的直接證據(jù),是蛋白質(zhì)設(shè)計領(lǐng)域的重要進展，并有望在生物能學(xué)中獲得重要應(yīng)用［３1］。電子傳遞(ET）涉及生物體內(nèi)許多重要的生化過程,王江云課題組及龔為民課題組通過基因密碼子擴展，實現(xiàn)在活細胞中編碼螯合金屬的非天然氨基酸3-吡唑基酪氨酸，為研究生物大分子中的光致電子轉(zhuǎn)移現(xiàn)象以及利用生物元件實現(xiàn)高效可控的光致電荷分離提供了有力的工具。這為蛋白動態(tài)構(gòu)象變化研究提供了新的研究手段,為利用合成生物學(xué)手段生產(chǎn)可再生能源提供了新的研究思路，為金屬蛋白設(shè)計提供了新的工具。該項研究成果以內(nèi)封面文章的形式發(fā)表于德國《Ａngｅw．Chｅm．Iｎt。Ed?！穂32］。作為哺乳動物體內(nèi)酸性最強的器官，胃所含的強酸性胃液（ｐH為1~3)是人和動物抵御絕大多數(shù)微生物病菌的一道天然屏障.然而，腸道病原菌能夠在強酸性的胃液下存活，并進而造成腸道感染.陳鵬等[33］通過在蛋白中定點嵌入含有光交聯(lián)基團的非天然氨基酸系統(tǒng)地捕獲了一種酸性分子伴侶蛋白在酸脅迫下的“客戶蛋白”，并依此闡釋了大腸桿菌抵御胃酸的機理，理解大腸桿菌的抗酸性機理將極大地加深我們對這類病原菌的認識，為今后發(fā)展新型抗生素奠定基礎(chǔ)。結(jié)果發(fā)表后《C&ENNeｗs》作了專題報道.其后，他們進一步運用非天然氨基酸編碼技術(shù)成功地在腸致病性大腸桿菌、志賀氏菌及沙門氏菌中實現(xiàn)了光交聯(lián)及疊氮非天然氨基酸的定點嵌入，為病原菌侵入宿主細胞的機理研究打下基礎(chǔ)[34]。此外，他們結(jié)合在蛋白中定點嵌入末端為烯烴的非天然氨基酸及Thｉoｌ－ene反應(yīng)，實現(xiàn)了藥用蛋白質(zhì)定點的標記及PＥG化修飾，為藥用蛋白的化學(xué)改性提供了新途徑[3５］。3糖化學(xué)生物學(xué)的進展寡糖化合物的合成是制約糖科學(xué)發(fā)展的瓶頸之一.葉新山等利用“糖基供體預(yù)活化”策略，將添加劑控制的立體選擇性糖基化方法應(yīng)用于葡萄糖和半乳糖硫苷供體的糖基化反應(yīng)中，實現(xiàn)了路易斯酸控制的高α－立體選擇性糖基化反應(yīng)［36］;并將該策略成功應(yīng)用于傷寒Vｉ抗原寡糖重復(fù)片段的合成［37].俞飚等對一價金催化的以糖基鄰炔基苯甲酸酯為供體的糖基化方法的機理［3８］進行了深入研究，并進一步用于藥用分子Digitoxｉn［39]和皂苷類化合物［４０］的合成；他們還首次實現(xiàn)了結(jié)構(gòu)復(fù)雜的含脫氧糖單元的抗生素LandｏmyｃinA的合成[４１]。發(fā)展糖化學(xué)生物學(xué)研究的新方法至關(guān)重要。陳興課題組[4２]報道了一種具有細胞靶向性的非天然糖代謝標記新方法。他們將非天然糖包裹在靶向性脂質(zhì)體內(nèi),并通過受體介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞，將非天然糖傳輸?shù)教囟ǖ募毎麅?nèi),進入細胞的非天然糖通過糖代謝途徑修飾于細胞表面聚糖上，最后可通過生物正交反應(yīng)進行成像和檢測.張延等［4３］建立了一種從復(fù)雜生物樣品中分離富集糖基化蛋白的新方法,開發(fā)了一種具有選擇性富集疊氮標記O—糖基化多肽及蛋白的炔基修飾納米磁珠，通過炔基與疊氮基團之間的點擊反應(yīng)富集帶有疊氮標記的糖蛋白，通過DTT及TCＥP等的還原作用將磁珠結(jié)構(gòu)上的二硫鍵切斷，從而將富集的糖蛋白從磁珠上解離,再通過SDＳ—ＰＡＧE、LC—MS等技術(shù)對這些糖基化蛋白進行鑒定。王鵬課題組與美國西北大學(xué)Mｒｋｓich教授合作［44]，發(fā)展了一種糖基轉(zhuǎn)移酶快速鑒定的新方法。該方法結(jié)合了高通量基因克隆技術(shù)、無細胞蛋白表達技術(shù)、自組裝單層糖芯片技術(shù)以及在線質(zhì)譜分析技術(shù)，將７種糖基供體與近1０0種細胞外表達的糖基轉(zhuǎn)移酶分別放到含有23種不同糖基受體的芯片上進行反應(yīng)，反應(yīng)后沖洗糖芯片并使用全自動的在線質(zhì)譜檢測系統(tǒng)分析結(jié)果,超過3萬個的反應(yīng)可在幾天內(nèi)完成。糖類化合物在藥學(xué)上的用途一直吸引著研究者的興趣。葉新山等[45］對腫瘤相關(guān)天然糖抗原STn進行結(jié)構(gòu)修飾，發(fā)現(xiàn)某些經(jīng)適當(dāng)修飾后的抗原具有更高的免疫原性，所產(chǎn)生的抗體能識別天然抗原，并且與表達SＴn抗原的腫瘤細胞相作用,從而為抗腫瘤糖疫苗的研究提供了新的路徑。他們［46］還設(shè)計合成了幾種N－烷基二脫氧氮雜糖化合物，這些氮雜糖化合物能夠抑制ConA誘導(dǎo)的小鼠脾Ｔ淋巴細胞的增殖；進一步研究表明，這種抑制效應(yīng)源于它們對細胞因子IＦN－γ和IL－4分泌的抑制；然后進行了動物水平的皮膚移植實驗,結(jié)果顯示這些氮雜糖類化合物能夠延長小鼠皮膚移植后皮片的存活時間。這些結(jié)果為新型免疫抑制劑的研制提供了希望。4核酸化學(xué)生物學(xué)的進展隨著化學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展和融合，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)大量重大疾病,如惡性腫瘤、遺傳疾病等，都與核酸相關(guān).核酸不僅是遺傳基因信息的載體,同時基因信息調(diào)控的正確與否與生命體的正常生理功能和健康與疾病有密切的聯(lián)系.而且,機體受各因素影響發(fā)生基因變異到形態(tài)學(xué)或生理功能發(fā)生病變，是一個多階段的改變累積過程.端粒DNA和端粒酶與人的壽命和癌癥等疾病密切相關(guān),已成為癌癥治療的特殊靶標。曲曉剛等［47］發(fā)現(xiàn)，碳納米管可以通過穩(wěn)定人端粒i-motif結(jié)構(gòu)來抑制端粒酶的活性，此實驗結(jié)果第一次證實單壁碳納米管（ＳWＮT）干擾端粒功能。這為SWNT的生物醫(yī)學(xué)效應(yīng)和i－motifDNA的生物學(xué)重要性提供了新的認識。周翔等［48］發(fā)現(xiàn)G—四鏈體能夠誘導(dǎo)ＤＮA鏈間的交換,這種高度選擇性的鏈交換反應(yīng)揭示了基因重組和DＮA修復(fù)的一種全新機制。譚錚等[49]鑒定得到了一個端粒DNA結(jié)合蛋白，該蛋白能夠與端粒、端粒酶相互作用，提高端粒酶延伸端粒ＤＮA的催化活性和進行性.在DNA甲基化方面，周翔等［50]設(shè)計了系列鹵代銨鹽衍生物,可以高選擇性識別ＤＮA鏈中的５—甲基胞嘧啶，這種精確的識別還可以區(qū)分5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基、5-醛基胞嘧啶，有望融合下一代測序方法為表觀遺傳學(xué)的研究提供了有力的工具和新的突破。任勁松等［51］首次將適體ＤＮA同時用作介孔硅封蓋試劑和癌細胞靶向試劑，結(jié)合化學(xué)療法、光熱療法和成像于一體系，用于癌癥診斷和治療，該工作作為封面文章發(fā)表在《Adｖ．Mater．》上.他們[５2］還通過納米金可視化的方法對微量端粒酶活性進行快速檢測。這些針對mｉRNＡ、端粒酶、循環(huán)腫瘤細胞的研究對于目前癌癥的快速診斷和早期預(yù)警提供了技術(shù)支撐。RNA干擾近年來一直被認為可用于新一代生物制藥技術(shù)，各國政府及制藥巨頭投入巨大，但小核酸生物制藥一直受到核酸穩(wěn)定性、脫靶效應(yīng)及給藥性差等因素制約。梁子才、席真等［5３］通過深入研究小核酸在人血清中的穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)血清中ＲＮaseＡ具有雙鏈RNA限制性內(nèi)切酶性質(zhì)，是造成小核酸血清不穩(wěn)定性的主要因素,并發(fā)現(xiàn)對雙鏈sｉＲNＡ中熱切位點的單堿基修飾可以極大提高小核酸血清穩(wěn)定性。他們進一步發(fā)現(xiàn)，利用普適性堿基對雙鏈siＲNA進行單點突變,可以極大提高RNA干擾中雙鏈siＲNA的鏈選擇性，降低siRＮA的脫靶效應(yīng)[54］。通過研究siRNA的體內(nèi)不對稱性選擇機制而設(shè)計合成的超高效ｓｉＲNＡ可以達到pｍｏl/L級的RNA干擾活性［５5].5分析方法和手段的進展徐濤和徐平勇等在超高分辨率成像領(lǐng)域取得重要研究成果.近期發(fā)展的超高分辨率成像技術(shù)（Ｆ）ＰALM/STORM能夠在納米尺度展示生物分子的精確定位，是蛋白質(zhì)研究和熒光成像領(lǐng)域的研究熱點和發(fā)展趨勢。然而，現(xiàn)有的熒光蛋白限制了當(dāng)前（F）PALM/STＯＲM等超高分辨成像技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。為了進一步完善和優(yōu)化現(xiàn)有的超高分辨成像方法，發(fā)展具有普適性和顏色多樣的新型光激活熒光蛋白（PＡFPs)至關(guān)重要。但是與傳統(tǒng)的光不敏感熒光蛋白（比如GＦＰ,RＦP)領(lǐng)域相比較，可逆光轉(zhuǎn)化熒光蛋白RSFP的發(fā)展較為滯后，品種較少。他們通過一種光轉(zhuǎn)化熒光蛋白mＥoｓ2的隨機突變，獲得了一系列具有光開關(guān)功能的綠色熒光蛋白,改善了現(xiàn)階段光開關(guān)熒光蛋白（RＳFP）發(fā)展滯后、品種單一的問題。其中的ｍＧｅｏｓ－M因其具有十分優(yōu)異的單分子特性,有望成為替代Dronpa的新一代超高分辨率顯微成像分子探針［56].此外，為了解決膜蛋白的標記問題，同時發(fā)展綜合性質(zhì)更佳的熒光蛋白探針,他們［５７］通過晶體結(jié)構(gòu)解析和定點突變,獲得了2個真正單體熒光蛋白：mEｏｓ3。1和ｍEｏs3.2.進一步的研究顯示，ｍEos3具有成熟時間短、亮度高的特性.用于單分子定位時具有很高的標記密度和光子產(chǎn)出，在超高分辨成像中比當(dāng)前所有ＰＡＦPs都表現(xiàn)出色。楊弋等［５8］發(fā)明了一種簡單實用的光調(diào)控基因表達系統(tǒng)，將可以廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究領(lǐng)域,并可能用于光動力治療,這是我國科學(xué)家在合成生物學(xué)與光遺傳學(xué)前沿領(lǐng)域獲得重要突破。通過合成生物學(xué)的方法，他們成功開發(fā)出一種簡單、穩(wěn)定、容易使用的光調(diào)控基因表達系統(tǒng)。該系統(tǒng)稱為LｉgｈtＯn系統(tǒng)，由１個光調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子和含有目的基因的轉(zhuǎn)錄單元構(gòu)成。在藍光存在的情況下，轉(zhuǎn)錄因子能夠迅速被激活,從而啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄與表達。利用該系統(tǒng)在小鼠活體內(nèi)進行實驗，他們成功實現(xiàn)了紅色熒光蛋白在小鼠肝臟的指定區(qū)域的光控表達。此外,他們課題組［59］還開發(fā)了一系列檢測NAＤH的遺傳編碼熒光探針。方曉紅、郭雪峰等［6０]利用具有G4構(gòu)象的DNA適配體分子構(gòu)建了功能化的單分子器件，實現(xiàn)了對凝血酶的高選擇性的可逆檢測，最低檢測濃度可達2。6ａmol／L（～８８ag/ｍL)。與微流控技術(shù)相結(jié)合,進一步實現(xiàn)了對單個生物結(jié)合過程的在線檢測，從而發(fā)展了一種高特異性、高靈敏度的在線生物檢測的可行性技術(shù)。該方法也提供了單個蛋白質(zhì)分子檢測的新思路。顏曉梅等[６1]通過對噬菌體進行基因改造，構(gòu)建了雙砷染料－四半胱氨酸重組噬菌體體系,成功地應(yīng)用于細菌的靈敏、特異檢測。由于噬菌體只能在活菌中繁殖，而且重組四半胱氨酸標簽中的半胱氨酸必須處于還原態(tài)才能與雙砷染料牢固結(jié)合，因此可以利用細菌胞漿的還原環(huán)境，通過對重組噬菌體四半胱氨酸的檢測實現(xiàn)死菌和活菌的區(qū)分。噬菌體入侵活的宿主菌并在其體內(nèi)快速繁殖,噬菌體衣殼蛋白所表達的四半胱氨酸片段與后續(xù)加入的跨膜雙砷染料結(jié)合,發(fā)出強烈的熒光，單個活細菌的信號可用流式細胞儀或熒光顯微鏡靈敏檢測.陳鵬課題組發(fā)展了一種強酸性環(huán)境下的活細胞pＨ熒光探針［62]。由于傳統(tǒng)的基于熒光蛋白或熒光小分子的pH探針在酸性條件下不夠穩(wěn)定或細胞內(nèi)定位困難，無法適用于對強酸性環(huán)境下的活細胞進行探測。他們通過將酸性分子伴侶蛋白質(zhì)和熒光小分子相結(jié)合,成功用于檢測活體內(nèi)強酸性環(huán)境的pＨ熒光探針,并分別在革蘭氏陰性細菌及哺乳細胞表面做了展示.楊朝勇等［63］發(fā)展了一種基于l—ＤNA分子信標（l—ＭB)的安全、穩(wěn)定、準確的細胞內(nèi)的納米溫度計。根據(jù)該探針所設(shè)計的溫度敏感的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理,它能夠用于對活細胞內(nèi)的溫度進行測量,將成為一個無創(chuàng)、準確地獲取細胞內(nèi)的溫度的有力工具.6化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域的部分國際研究熱點和前沿以及我國科學(xué)家的貢獻6。１以細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為主線的化學(xué)生物學(xué)研究蓬勃發(fā)展在G蛋白偶聯(lián)受體、TGＦ-β受體、Ｗｎt、ＮFκB等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子機理及其與細胞增殖、分化、凋亡及遷移等生命活動的關(guān)系的化學(xué)生物學(xué)研究方面都取得了突破性的進展，涌現(xiàn)了若干高水平的研究成果。我國科學(xué)家也在急性髓系白血?。ǎ罬Ｌ）細胞凋亡的機制和治療手段、抑制ＴGＦβ受體活性的小分子及機理研究、酸敏感離子通道的動力學(xué)行為和通道門控功能、干細胞多能性的維持機制及相應(yīng)的誘導(dǎo)因子的發(fā)現(xiàn)等方面取得突破。６.2生物活性分子的合成方法取得進展在直接利用天然小分子探針的同時，科學(xué)家們還發(fā)展了高效的天然產(chǎn)物組合庫合成方法,復(fù)雜天然糖綴合物及寡糖的化學(xué)合成方法，環(huán)肽及帶有不同修飾基團的多肽的合成方法,利用合成生物學(xué)合成活性分子等。在合成生物活性小分子或生物大分子方面所取得的這些成果極大地推動了我國化學(xué)生物學(xué)的發(fā)展.6.3現(xiàn)代分析技術(shù)和方法在化學(xué)生物學(xué)研究中的重要性日益彰顯各種原位、實時、高靈敏、高選擇、高通量的新方法和新技術(shù)在國際上不斷涌現(xiàn)，我國科學(xué)家對此也做出了巨大貢獻。例如,在生物分子檢測探針和生物傳感器方面，發(fā)展了多種適合于實時檢測活細胞中金屬離子、自由基、活性氧等重要生物活性分子的光學(xué)探針，發(fā)展了細胞表面糖基和聚糖等的原位檢測傳感器。開發(fā)了基于化學(xué)抗體-核酸適配體的蛋白質(zhì)、核酸檢測新方法,藥物小分子或小分子配體與蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)和分子識別的質(zhì)譜分析和光學(xué)檢測等新方法。在單分子水平的分析檢測方面,發(fā)展了能在活細胞狀態(tài)監(jiān)測蛋白質(zhì)亞基組成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中蛋白質(zhì)動態(tài)行為的單分子熒光成像法、分析蛋白質(zhì)聚集狀態(tài)的單分子熒光光譜法,以及能在細胞上實時檢測配體-受體的作用力和復(fù)合物穩(wěn)定性的單分子力譜法.6.4在時間與空間上對細胞內(nèi)的分子過程與新陳代謝進行成像與控制的技術(shù)這些技術(shù)可為復(fù)雜生物學(xué)問題的解析提供重要的工具，是國際上的研究前沿與熱點.我國科學(xué)家針對細胞代謝研究的技術(shù)瓶頸問題，發(fā)明了系列特異性檢測核心代謝物NADＨ的基因編碼熒光探針，實現(xiàn)了活細胞各亞細胞結(jié)構(gòu)中對細胞代謝的動態(tài)檢測與成像,不僅可為細胞、發(fā)育等基礎(chǔ)研究提供創(chuàng)新方法,也為癌癥和代謝類疾病的機制研究與創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)提供了有力工具。在此基礎(chǔ)上，利用合成生物學(xué)與化學(xué)生物學(xué)方法，開發(fā)出由光調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子和含有目的基因的轉(zhuǎn)錄單元構(gòu)成的基因表達系統(tǒng)，為發(fā)育、神經(jīng)生物學(xué)的復(fù)雜生物學(xué)問題解析提供有力研究工具。6.5計算化學(xué)和計算生物學(xué)取得明顯進展計算化學(xué)與計算生物學(xué)在生命科學(xué)和藥學(xué)研究中的應(yīng)用在國際上受到了極大的關(guān)注。我國科學(xué)家較快地將計算化學(xué)和計算生物學(xué)應(yīng)用于化學(xué)生物學(xué)研究，開展了不少開創(chuàng)性的研究和有特色的工作，取得了一些具有重要創(chuàng)新性的成果.其中,在以小分子為探針進行藥物靶標預(yù)測和生物分子功能研究、生物分子模擬應(yīng)用、生物網(wǎng)絡(luò)和化學(xué)小分子對于生物系統(tǒng)的作用以及蛋白質(zhì)設(shè)計等方面都取得了一些創(chuàng)新性成果.7化學(xué)生物學(xué)的發(fā)展趨勢化學(xué)生物學(xué)經(jīng)過十多年的發(fā)展正在成為一門具有自身特點和內(nèi)涵的學(xué)科，將成為研究生命科學(xué)問題的重要手段及創(chuàng)新藥物研究的重要工具。以下就未來化學(xué)生物學(xué)發(fā)展的趨勢加以展望。７．1化學(xué)生物學(xué)的方法與技術(shù)7。1.１探針分子的發(fā)現(xiàn)分子探針是一類能與其他分子或者細胞結(jié)構(gòu)相結(jié)合，幫助獲得重要生物大分子在細胞中的定位、定量信息或進行功能研究的分子工具。７。１。２生物正交化學(xué)發(fā)展能夠在活細胞環(huán)境下進行但不干擾細胞內(nèi)在生化過程的化學(xué)分子工具及其化學(xué)反應(yīng)。７．1。3生物標記與成像通過具有高靶標親和力或者生物正交化學(xué)反應(yīng)能力的分子探針標記特定物質(zhì)，對生物過程進行細胞和分子水平的定性和定量研究。７。1．4生物分子的光調(diào)控通過遠程光源誘發(fā)生物分子上所連光活性基團的反應(yīng)，從而對生物分子實現(xiàn)具有時空分辨率的結(jié)構(gòu)及功能調(diào)控，并發(fā)現(xiàn)動態(tài)生命體系中新的分子機制。７.２生物大分子的化學(xué)生物學(xué)7.2.1核酸化學(xué)生物學(xué)在分子水平上研究核酸的結(jié)構(gòu)、功能及作用機理，運用核酸探針研究和調(diào)控細胞生命活動，并在研究過程中強調(diào)化學(xué)方法與化學(xué)手段的運用與創(chuàng)新.7。2。２蛋白質(zhì)與多肽化學(xué)生物學(xué)在分子水平上研究蛋白質(zhì)與多肽分子的結(jié)構(gòu)、功能及生物學(xué)、醫(yī)學(xué)應(yīng)用,并在研究過程中強調(diào)化學(xué)方法與化學(xué)手段的運用與創(chuàng)新。7.2。3糖、脂化學(xué)生物學(xué)運用化學(xué)方法與技術(shù)，在分子水平上研究糖和脂這兩類生物分子的結(jié)構(gòu)與功能,探索糖、脂在生命過程中的基本規(guī)律，促進糖、糖綴合物和脂的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。7．2。４生物大分子的修飾與功能運用化學(xué)生物學(xué)方法與技術(shù)研究生物大分子的化學(xué)修飾、機理、調(diào)控基因表達等生物功能。７．3計算化學(xué)生物學(xué)活性分子設(shè)計理論及應(yīng)用;生物分子功能的理論預(yù)測;生物網(wǎng)絡(luò)計算與模擬;生物體系分子動態(tài)學(xué)以及生命體系的人工設(shè)計與模擬等.７.4細胞化學(xué)生物學(xué)7.４。１探針分子與生物大分子的相互作用發(fā)展特異識別生物大分子的化學(xué)探針,并利用該特異性結(jié)合調(diào)控生物大分子生理功能的探索是化學(xué)生物學(xué)研究的一項重要內(nèi)容.７．4.2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的分子識別利用化學(xué)生物學(xué)方法和技術(shù),研究重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及這些過程中的重要生物大分子在細胞生理和病理條件下的作用機制.7.4．３細胞重編程過程的小分子調(diào)控將小分子化合物用于干細胞的自我更新、定向分化及體細胞重編程等方面的研究是國際上干細胞研究領(lǐng)域的熱點問題,也是采用化學(xué)生物學(xué)策略進行干細胞研究的優(yōu)勢所在。7。4．４非編碼ＲNＡ體系的小分子調(diào)控非編碼RNA體系的小分子調(diào)控是通過設(shè)計、合成、篩選等手段,開發(fā)出能夠特異性地識別、結(jié)合非編碼ＲNA并調(diào)控非編碼RNA生理功能的活性小分子，以期實現(xiàn)小分子在非編碼ＲNA相關(guān)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)問題中的研究與應(yīng)用。7。5藥物發(fā)現(xiàn)的化學(xué)生物學(xué)基礎(chǔ)癌癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、代謝性疾病、免疫疾病、病毒和病菌感染等重大疾病的藥物靶標和先導(dǎo)化合物的開發(fā)。7.6化學(xué)生物學(xué)的應(yīng)用７。6。1生物標志物與疾病診斷的化學(xué)生物學(xué)研究可以標記系統(tǒng)、器官、組織、細胞及亞細胞結(jié)構(gòu)，以及與疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的各種細胞學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)或分子指標。7．６。２功能性分子的生物合成生物合成是生物體內(nèi)進行的同化反應(yīng)的總稱，為許多常規(guī)化學(xué)方法不能或不易合成的化合物提供新合成途徑。７．6.3生命復(fù)雜體系的組裝與模擬在超分子水平上研究生物活性分子間相互作用的本質(zhì)和協(xié)同規(guī)律，在此基礎(chǔ)上實現(xiàn)對組裝過程的調(diào)控,創(chuàng)造具有特定功能的自組裝體系.7．6．4納米技術(shù)的化學(xué)生物學(xué)發(fā)展生命調(diào)控的納米材料，提供生命研究的功能化納米分子工具,研究解決與重大疾病的診斷和治療相關(guān)的問題.8人才培養(yǎng)與平臺建設(shè)我國基本上與國際同步開展化學(xué)生物學(xué)方法發(fā)展和應(yīng)用研究,具備良好的發(fā)展基礎(chǔ)。通過過去十多年的努力,我國已經(jīng)培養(yǎng)、造就了一支較強的化學(xué)生物學(xué)研究隊伍，擁有一批具有較高水平的學(xué)術(shù)帶頭人，發(fā)展和儲備了一系列化學(xué)生物學(xué)新方法和新技術(shù)。許多高等院校開始培養(yǎng)化學(xué)生物學(xué)碩士、博士研究生，部分高校已經(jīng)開始招收化學(xué)生物學(xué)本科生。近期，國務(wù)院學(xué)位辦公室和教育部等部門先后將化學(xué)生物學(xué)設(shè)立為二級學(xué)科。這也進一步說明，化學(xué)生物學(xué)作為一門新興的學(xué)科已日趨成熟和完善.8．1人才培養(yǎng)根據(jù)國際化學(xué)生物學(xué)研究的發(fā)展狀況，我國相繼成立了開展化學(xué)生物學(xué)研究的機構(gòu)。北京大學(xué)、清華大學(xué)、南開大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)、南京大學(xué)、廈門大學(xué)、武漢大學(xué)、湖南大學(xué)、四川大學(xué)、中山大學(xué)、華東理工大學(xué)等十多所高校相繼成立了化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室、化學(xué)生物學(xué)系或研究生專業(yè);中科院上海生命科學(xué)研究院和中科院上海有機化學(xué)研究所(生命有機化學(xué)國家重點實驗室)成立了化學(xué)生物學(xué)聯(lián)合研究中心；中科院化學(xué)所、大連化物所、福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所、蘭州化物所、武漢物理數(shù)學(xué)研究所等也成立了化學(xué)生物學(xué)研究中心或研究室。201１年“藥物化學(xué)生物學(xué)”國家重點實驗室經(jīng)批準在南開大學(xué)建立,這標志著化學(xué)生物學(xué)學(xué)科有了自己的第一個國家重點實驗室。與此同時,因創(chuàng)新藥物研究的需要，我國培養(yǎng)了一批化學(xué)生物學(xué)研究所必須的組合化學(xué)、高通量篩選和活性化合物設(shè)計研究隊伍；因基因組和功能基因組研究的需要,我國也培養(yǎng)了一批生物信息學(xué)和基因組研究人才隊伍。此外，我國在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的人才培養(yǎng)也有了長足的進步,為化學(xué)家與生物學(xué)家在相互感興趣的交叉領(lǐng)域展開充分的合作奠定了基礎(chǔ)。8。２研究平臺建設(shè)8.2.1項目資助近年來,國家自然科學(xué)基金委員會、科技部、教育部等部門對化學(xué)生物學(xué)的資助力度逐年加大.這里重點介紹國家自然科學(xué)基金委員會的“基于化學(xué)小分子探針的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程研究”重大研究計劃項目。該重大研究計劃于2007年1月正式發(fā)布指南，接受申請。申請項目涉及國家自然科學(xué)基金委員會數(shù)理、化學(xué)、生命、工材、信息和醫(yī)學(xué)6個學(xué)部。第一批資助的43項培育項目已于２0１0年底順利結(jié)題.在2011年國家自然科學(xué)基金委員會組織的重大研究計劃中期評估中，該重大研究計劃被評為優(yōu)秀，并在所有參評重大研究計劃當(dāng)中排名第一。最近兩年，該重大研究計劃以小分子探針為主要工具,充分發(fā)揮化學(xué)和生命科學(xué)等多學(xué)科交叉合作的優(yōu)勢,對細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要分子事件和機理進行了深入的研究,在一些前沿研究方向上取得了突出的成績，相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在《Cell》、《Proｃ。Ｎatｌ．Acaｄ．Scｉ．UＳA》《Nａt(yī)uｒeＣｈｅmｉcalBiolｏgy》、《Ｎａt(yī)ureCheｍisｔｒｙ》、《NatureMethｏds》、《NaｔuｒeProtｏcol》、《SｃｉenceＳignalinｇ》、《ＣhemBioＣhem》、《J。Am.Cｈｅm.Ｓｏc．》、《Anｇew。Chem．Int．Ｅd.》等重要的期刊上.這一重大研究計劃使得我國的化學(xué)生物學(xué)研究隊伍的規(guī)模有了更為快速的增長。它的順利實施使得一批化學(xué)和生命科學(xué)的研究人員開展了實質(zhì)性的合作,為我國培養(yǎng)了大批化學(xué)生物學(xué)的專門人才,并在全國范圍內(nèi)形成了從事化學(xué)生物學(xué)的穩(wěn)定科研隊伍?；蚬こ痰亩x:按照預(yù)先設(shè)計好的藍圖,利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，特別是酶學(xué)技術(shù)，對遺傳物質(zhì)DNＡ直接進行體外重組操作與改造,將一種生物(供體)的基因轉(zhuǎn)移到另外一種生物（受體）中去,從而實現(xiàn)受體生物的定向改造與改良?；蚬こ痰幕具^程:切、接、轉(zhuǎn)、增、檢基因工程理論依據(jù)：a）生物的遺傳物質(zhì)是DNA。b）DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機理.c）遺傳信息的傳遞方式(中心法則）和三聯(lián)體密碼子系統(tǒng)的建立遺傳工程：指以改變生物有機體性狀為目標，采用類似工程技術(shù)手段而進行的對遺傳物質(zhì)的操作,以改良品質(zhì)或創(chuàng)造新品種.包括細胞工程和基因工程等不同的技術(shù)層次?？寺　Ｖ赣赏瑐€祖先經(jīng)過無性繁殖方式得到的一群由遺傳上同一的DNＡ分子、細胞或個體組成的特殊生命群體。限制性核酸內(nèi)切酶。是一類能識別雙鏈DNＡ中特殊核苷酸序列,并使每條鏈的一個磷酸二酯鍵斷開的內(nèi)脫氧核糖核酸酶。限制性內(nèi)切酶由三個基因位點所控制:hsdR-－—限制性內(nèi)切酶，hsｄＭ—-－限制性甲基化酶，ｈｓdS———控制兩個系統(tǒng)的表達.HｓdS-識別特定DＮA序列，HsdM－甲基化,HsdR-限制性內(nèi)切酶功能。命名法:例如Ｈａemoｐhｉlｕsinfｌuenzue)d株中分離的第三個酶：ＨｉndＩＩI同裂酶:不同來源的限制酶具有相同的識別位點和切割位點。同尾酶:來源不同、識別序列不同,但產(chǎn)生相同粘性末端的酶粘性末端：DNＡ末端一條鏈突出的幾個核苷酸能與另一個具有突出單鏈的DＮA末端通過互補配對粘合,這樣的DNA末端，稱之。酶活性單位.在合適的溫度和緩沖液中，在50μｌ反應(yīng)體系中,1小時內(nèi)完全切割1微克DNA所需的酶量為１個酶活性單位Ｕ.星活性：指限制性內(nèi)切酶在非標準條件下,對與識別序列相似的其它序列也進行切割反應(yīng)，導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性的ＤNＡ片段的現(xiàn)象。引起星活性原因:若使用buｆfer不當(dāng),會有sｔaｒａctｉvｉty,而sｔaraｃｔivｉty是指限制酶對所作用的ＤNA及序列失去專一性，當(dāng)酶辨認切割位置的能力降低,導(dǎo)致相似的序列或是錯誤的辨認序列長度也會作用，而產(chǎn)生錯誤的結(jié)果.連桿:化學(xué)合成的8～12個核苷酸組成的寡核苷酸片段.以中線為軸兩邊對稱，其上有一種或幾種限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列,酶切后可產(chǎn)生一定的粘性末端,便于與具有相同粘性末端的另一ＤNA片段連接。底物位點優(yōu)勢效應(yīng)：酶對同一個DNA底物上的不同酶切位點的切割速率不同銜接頭：化學(xué)合成的寡核苷酸，含有一種以上的限制性核酸內(nèi)切酶識別序列。其一端或兩端具有一種或兩種內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的黏性末端.逆轉(zhuǎn)錄酶：以mＲNA為模板合成其互補DＮA。RNＡ聚合酶：以DNA為模板合成ｍRNＡ,不需引物,但必須有啟動子。末端轉(zhuǎn)移酶:不依賴于DＮA的DNＡ聚合酶,來自于小牛胸腺組織,在DNA分子的3端增加一個或多個脫氧核苷酸。多核苷酸激酶:對核酸末端羥基進行磷酸化的酶。防止載體分子的自身環(huán)化作用：使用不同的限制酶切;堿性磷酸酶預(yù)先處理質(zhì)粒載體;DNA片段5’端脫磷酸化作用后連接。;ＤNA片段末端同聚物加尾后進行連接載體：指能夠運載外源DＮA片段（目的基因）進入受體細胞，具有自我復(fù)制能力,使外源DＮA片段在受體細胞中得到擴增和表達，不被受體細胞的酶系統(tǒng)所破壞的一類ＤNA分子。功能:1運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞2為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力3為外源基因的擴增或表達提供條作為工程載體必備的條件：具有多個單一的限制酶切位點；有復(fù)制起點，在受體細胞中能自我復(fù)制,或整合到染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制；具有篩選轉(zhuǎn)化子的選擇性標記基因;安全，不含對受體細胞有害的基因,不會任意轉(zhuǎn)入受體細胞以外的其它生物細胞中;分子量小，拷貝數(shù)多;攜帶外源基因的幅度寬.克隆載體：用于在受體細胞中進行目的基因擴增的載體.一般具有較低的分子量、較高的拷貝數(shù)和松弛型復(fù)制子。表達載體。指專用于在宿主細胞中高水平表達外源蛋白質(zhì)的載體,可將重組體ＤNA導(dǎo)入適合的受體細胞,使所載的目的基因能夠復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯.穿梭載體:能在兩種不同的生物體內(nèi)復(fù)制的載體。主要用于原核細胞與真核細胞之間進行基因轉(zhuǎn)移質(zhì)粒：指獨立存在于宿主細胞染色體外、能夠自我復(fù)制的DNA分子.嚴謹型質(zhì)粒：拷貝數(shù)為1至幾個的質(zhì)粒.松弛型質(zhì)粒:拷貝數(shù)多于１0個的質(zhì)粒。氯霉素擴增:用氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細菌染色體復(fù)制時，帶有pMB1或ColＥI復(fù)制子的質(zhì)粒扔會利用豐富的原料大量復(fù)制的的現(xiàn)象.質(zhì)粒不親和性:指在無選擇壓力的情況下,兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能在同一個寄主細胞中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。接合質(zhì)粒。指質(zhì)粒所攜帶的基因的功能是使細胞彼此有效地接觸，以便將質(zhì)粒DNA從供體細胞轉(zhuǎn)移至受體細胞的質(zhì)粒。質(zhì)粒有哪些性質(zhì):自主復(fù)制性、可擴增性、不親和性、轉(zhuǎn)移和遷移、重組性。cos位點：指在連接酶的作用下，連接黏性末端結(jié)合形成的雙鏈ＤNＡ區(qū)段.柯斯質(zhì)粒載體:是一類人工構(gòu)建的含有DNAcos位點、噬菌體包裝有關(guān)的DNＡ短序列、質(zhì)粒DNA復(fù)制起點、抗生素標記基因等元件的特殊質(zhì)粒載體.在宿主細胞中可以作為正常噬菌體進行復(fù)制，但不表達噬菌體的任何功能。人工染色體:指人工構(gòu)建的含有天然染色體基本功能單位的載體系統(tǒng)。主要有酵母人工染色體（ＹＡＣ,在大規(guī)模的測序中例如人類基因組計劃是非常有用的還有用于高等生物構(gòu)建基因組文庫，缺點是：1存在嵌合現(xiàn)象，嵌合體比例比較高，2YAC克隆的穩(wěn)定性差,插入片段存在重排和丟失現(xiàn)象,３插入片段的分離和純化困難，不容易與酵母自身染色體相分離。)、細菌人工染色體（BＡC）、源于噬菌體P１的人工染色體（PＡＣ),它們的特點是載體的容載能力擴大，人工染色體具備三個元件:復(fù)制起始區(qū)／自主復(fù)制序列,參與染色體DNA復(fù)制起始結(jié)構(gòu)的形成;著絲粒，負責(zé)染色體向子細胞傳遞；端粒,對染色體ＤNA兩個末端起封口和保護作用。λ-DNＡ作為載體的優(yōu)點:１)λ-DＮＡ可在體外包裝成噬菌體顆粒,能高效感染大腸桿菌；2）λ—ＤNA作為載體，其裝載外源DNA的能力為25kb,遠遠大于質(zhì)粒的裝載量;3)重組λ-DＮA的篩選較為方便，可進行正向篩選和雜交篩選；4)重組λ—ＤＮA分子的提取比質(zhì)粒容易PCＲ反應(yīng)體系的成份:Taｑ酶、模板DNA、引物、dNTP、PCＲ緩沖液PCＲ反應(yīng)的步驟:①DNA變性：(９0℃—96℃）：雙鏈DNＡ模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。②退火：(60℃－6５℃)：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合,形成局部雙鏈。③延伸:(７０℃－7５℃）:在Tａq酶(在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dＮTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸,合成與模板互補的DNＡ鏈。探針：具有一定序列的核苷酸片段,能與互補的核酸序列復(fù)性雜交,并且能通過適當(dāng)標記進行檢測。目的基因.是指已被或欲被分離、改造、擴增和表達的特定基因或DＮA片段.基因文庫：是某種特定的生物所含有的能夠包含所有基因的足夠數(shù)目的克隆的集合cＤNA文庫。以mRNA為模板,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段分別與克隆載體重組，貯存在一種受體菌群體中，這樣的群體稱為cDＮＡ文庫。構(gòu)建步驟：分離純化總ＲNＡ及ｍＲNＡ；?ｃDNA第一鏈的合成?雙鏈cDNA合成?與載體重組、轉(zhuǎn)化基因組文庫：某種生物的基因組的全部遺傳信息通過克隆載體貯存在一個受體菌的群體中,這個群體即為這種生物的基因組文庫.探針雜交原理。任意兩條單鏈核酸分子都有相互形成堿基對的趨勢.但形成的大多數(shù)分子對由于只有少數(shù)鏈間氫鍵形成，雜交結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定.如果多聚核苷酸鏈是互補的,堿基對的大量形成使雙鏈分子穩(wěn)定。原位雜交技術(shù)：基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列,將有放射性或非放射性的外源核酸（即探針)與組織、細胞或染色體上待測DNＡ或RNA互補配對，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。ｃDNA文庫的構(gòu)建步驟:分離純化總ＲNＡ及ｍRNA（Ｐ10４—110)、ｃDNA第一鏈的合成、雙鏈ｃＤNA合成、與載體重組、轉(zhuǎn)化從基因文庫中獲取目的基因的方法:ＰCR法、化學(xué)合成法、分離目的基因的方法和原理:1從生物基因組群體中分離目的基因(原核生物基因組較小，基因容易定位，用限制性內(nèi)切酶將基因組切成若干段后，用帶有標記的核酸探針，從中選出目的基因.真核生物一般通過基因組文庫的方法獲得目的基因。）2人工合成目的基因DＮＡ片段(人工合成目的基因ＤＮＡ片段有化學(xué)合成和酶促合成法兩條途徑．一般是采用ＤＮA合成儀來合成長度不是很大的DNA片段.）３PCＲ反應(yīng)合成ＤNA(PCR是以ＤNA變性、復(fù)制的某些特性為原理設(shè)計）受體細胞選擇的原則;?外源DNＡ分子能穩(wěn)定存在，限制酶缺陷型;?重組基因缺陷型；?易于轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)；?易篩選?遺傳穩(wěn)定性高,易于擴大培養(yǎng);?安全性高；?內(nèi)源蛋白酶基因缺失或缺陷；?遺傳密碼無明顯偏好性;?具有較好的轉(zhuǎn)譯加工機制；?較高的理論和實踐應(yīng)用價值。轉(zhuǎn)化：以質(zhì)粒為載體的重組ＤＮA分子引入受體細胞的過程。轉(zhuǎn)染：以噬菌體或病毒為載體的重組DNＡ分子引入受體細胞的過程。轉(zhuǎn)導(dǎo)：是指通過λ噬菌體(病毒）顆粒感染宿主細胞的途徑把外源DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細胞內(nèi)的過程。感受態(tài)細胞：指處于能吸收周圍環(huán)境中DＮA分子的生理狀態(tài)的細胞.轉(zhuǎn)化率:是指DNA分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率幾種常見的轉(zhuǎn)化方法:1化學(xué)轉(zhuǎn)化法:?原理:0oC、低濃度（5０~100mM）CaＣl2,Ca2+改變細胞膜的磷脂層結(jié)構(gòu)，提高膜的通透性，而且增強進入細胞的DNA分子抗DNasｅ的能力。特點：操作簡便,不需特殊儀器,一般實驗室均可進行。2電激法?原理：利用高壓電脈沖作用，在細菌細胞膜上進行電穿孔,形成可逆的瞬間通道,促進外源DNA的有效吸收。?特點：感受態(tài)細胞制備簡單；用途廣泛，但需特殊儀器電激儀。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、噬菌體轉(zhuǎn)化。正向選擇?重組子在培養(yǎng)基上能生長，而非重組子不能生長。根據(jù)插入序列的表型特征進行篩選:1限制性內(nèi)切酶法：可以通過限制性酶酶切重組質(zhì)粒,電泳分析插入片段長度是否正確。2PCＲ法：如果已知插入DNA片段的某些序列,就可以通過PCR的方法進行鑒定。3菌落原位雜交法：直接把菌落或噬菌斑印跡轉(zhuǎn)移到雜交膜上,不必進行核酸分離純化、限制酶酶切及凝膠電泳分離等操作,而是經(jīng)溶菌和變性處理后使DＮA暴露出來并與雜交膜結(jié)合,再與特異性標記探針雜交,篩選出含有插入序列的菌落或噬菌斑。4基因產(chǎn)物檢測法：如果使用的是表達載體,那么就可以通過鑒定基因產(chǎn)物的方法鑒定正確的克隆.α-互補：laｃZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體lacZ’可以與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β—半乳糖苷酶陰性突變體之間實現(xiàn)互補。根據(jù)載體的選擇標記的初步篩選：①抗藥性選擇標記插入失活/插入表達篩選法（正向選擇?重組子在培養(yǎng)基上能生長，而非重組子不能生長。）②β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法（α—互補篩選）(α—互補概念)③利用報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細胞（通過不同報告基因產(chǎn)生不同的酶而采用不同的手段篩選)④利用遺傳選擇標記篩選哺乳動物轉(zhuǎn)基因細胞外源基因表達系統(tǒng)：指目的基因與表達載體重組后,導(dǎo)入合適的受體細胞，并能在其中有效表達，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物。大腸桿菌基因表達載體的重要組成元件:?復(fù)制起始區(qū)(oｒｉ）?選擇標記?正確插入的多克隆位點（控制有效轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控）?啟動子：Lａc和Tac；PL和PR；T７?核糖體結(jié)合位點?翻譯起始點AUG等真核基因在大腸桿菌中表達遇到的問題和對策：細菌不能識別真核基因的表達信號.解決的方法是將外源基因插入載體中，使其處于一系列的E.colｉ表達信號的控制之下。這樣基因可以轉(zhuǎn)錄和表達.克隆載體提供了表達的信號，所以可以用來生產(chǎn)重組蛋白,被稱為表達載體。或者:1)外源基因可能含有內(nèi)元。E．colｉ缺乏切除內(nèi)元的機制。２）外源基因可能含有在E.coｌi作為終止子的序列。3）基因的密碼子可能不適合于E.cｏli中翻譯。解決策略：1)如果克隆的基因含有內(nèi)元，可以使用mRNA。2）定點突變的方法改變可能的終止序列。3用E。coli偏愛的密碼子.融合蛋白：將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，沒有改變兩個基因的閱讀框，以這種形式表達的蛋白，稱之.分泌型蛋白：外源基因的表達產(chǎn)物N端連有一信號肽序列,通過運輸和分泌的方式穿過細胞的外膜進入培養(yǎng)基中.包涵體:一定條件下，外源基因表達產(chǎn)物在大腸桿菌中積累并致密地聚集在一起形成無膜的裸露結(jié)構(gòu),稱為包涵體?；虮磉_產(chǎn)物的檢測方法：?報告基因的酶法檢測?酶聯(lián)免疫吸附法?Weｓterｎ印跡法?表達產(chǎn)物生物學(xué)活性檢測植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法：1直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)(基因槍法、原生質(zhì)體法、脂質(zhì)體法、花粉管通道法、電激轉(zhuǎn)化法、PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法）2生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法(農(nóng)桿菌介導(dǎo)和病毒介導(dǎo)兩種轉(zhuǎn)化方法）,常用于雙子葉植物。Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)植物基因工程的應(yīng)用：一。利用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究基因的表達與調(diào)控(可以利用報告基因研究環(huán)境因素的變化對基因表達的影響;Ｔi質(zhì)粒上的T－DＮA能隨機整合入植物染色體中，因而已廣泛應(yīng)用于植物基因的定性及分離上.）二。利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)