DB51∕T 2905-2022 豬A型塞內(nèi)卡病毒分離鑒定技術(shù)規(guī)范

ICS11.220CCSICS11.220CCSB41四 川 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB51/T2905—2022豬ATechnicalspecificationforisolationandidentificationforswinesenecavirusA2022-05-20發(fā)布 2022-07-01實(shí)施四川省市場(chǎng)監(jiān)督管理局 發(fā)布DB51/T2905DB51/T2905—2022標(biāo)準(zhǔn)下載目 次前言 II112范引文件 13語(yǔ)定義 14略語(yǔ) 15劑設(shè)備 15.1主試劑 15.2主儀設(shè)備 26品采、存輸 26.1樣采集 26.2保與輸 27毒細(xì)分培養(yǎng) 2生安措施 2樣的理 2單細(xì)制備 27.4樣接種 37.5病收獲 38毒酸定 3RT-LAMP和RT-PCR引物 3核提和轉(zhuǎn)錄 3RT-LAMP反應(yīng) 3RT-PCR4試結(jié)觀察 49果定 59.1RT-LAMP 59.2RT-PCR 59.3病分鑒定 5附錄A（范）試配置 6附錄B（料）豬A型塞卡毒VP1白因LAMP和RT-PCR增列 7I前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由四川省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出、歸口并解釋。本文件主要起草單位：四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)。本文件首次發(fā)布。II豬A型塞內(nèi)卡病毒分離鑒定技術(shù)規(guī)范范圍本文件規(guī)定了豬A型塞內(nèi)卡病毒分離鑒定方法、RT-LAMP及RT-PCR診斷方法。本文件適用于豬A型塞內(nèi)卡病毒的病原分離和鑒定、實(shí)驗(yàn)室診斷、病毒檢測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查。（GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義?？s略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。CPE：細(xì)胞病變DMEM：細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液DNAmarker：DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記FBS：胎牛血清HEPES：4RT-LAMP：逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)SVA：豬A型塞內(nèi)卡病毒GB/T6682PK-15DMEMHEPES(1mol/L0.01mol/LpH7.0~7.41PBS（參見附錄A）；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR反應(yīng)混合液（2×）、LAMP反應(yīng)各組分試劑。PCR用一次性注射器吸取臨床發(fā)病豬只水泡液0.5mL~1mL，并將水泡液裝入保存管，加青霉素至終濃度1000IU/mL、鏈霉素至終濃度500IU/mL，不能立即使用應(yīng)置于-70℃冷凍保存；用0.01mol/LPBS（pH7.4）清洗水泡表面，然后用滅菌手術(shù)剪刀剪取水泡皮2g~5g，裝入樣品保存管，加適量50%甘油-PBS保存液，使保存液液面沒過樣品，不能立即使用應(yīng)置于-70℃冷凍保存；5g~10g，50%甘油-PBS采集的樣品應(yīng)按照NY/T541要求包裝和運(yùn)輸。SVA分離鑒定時(shí)，應(yīng)在高等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室操作，按照GB19489（所有部分）的規(guī)定執(zhí)行。水泡液4℃3000r/min離心10min，以0.22μm無菌濾膜過濾除菌后，-70℃保存?zhèn)溆?；?.5g待檢組織樣品，加入1mL~1.5mLPBS，用組織破碎儀充分破碎，用含青、鏈霉素的DMEM作3:1℃3000r/min0.22μm1.5mL，-702PK-1525cm28FBS的DMEM培養(yǎng)基5mL，細(xì)胞2×105個(gè)/mL~3×105個(gè)/mL48h。，37℃、5%CO2h0.2mLPK-15（5mL瓶~42瓶~437°C15mL含2%FBSDMEMCO24848hCPE°C3000r/min1070°C1代72hCPE/PK-151mL4mL37°C代~5RT-LAMPRT-PCRRT-LAMP和RT-PCR引物針對(duì)SVAVP1蛋白基因保守區(qū)域，引物序列見表1。表1 引物列檢測(cè)方法引物序列(5′→3′)位置(bp)RT-LAMPSVVF3CCGATCTCGACTACTGAATG2866～2886SVVB3GAGAACGCCACTGTCAGAC3017～3036SVVFIPCATCGTCCTGCTGTGCACCT-AGAAGGACGCCGTCTTCC2881～2941SVVBIPTTCTAACACCCCGCCCAACA-TTGACGTACAGGCCGAAAC2953～3013RT-PCRSVVFTACAGTTTGGCCTGTTTCACT3063～3083SVVRCGCCCAGTAAAGTGGTAGGG3210～3229采用RNA/cDNA，于-20RT-LAMPRT-LAMP反應(yīng)體系中各組分見表2，反應(yīng)體系可根據(jù)表中各組分比例適當(dāng)調(diào)整。3表2 RT-LAMP應(yīng)系反應(yīng)試劑體積（μL）BstDNA聚合酶緩沖液2.5RNA酶抑制劑（40U/μL）0.5反轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL）0.75BstDNA聚合酶1甜菜堿（1mmol/L）2MgSO4（8mmol/L）2引物F3/B3（0.2μmol/L）各2引物FIP/BIP（1.6μmol/L）各4dNTPs（1.4mmol/L）2RNA模板1ddH2O1.25RT-LAMP將8.4.165°C4580°C反應(yīng)104°CRT-PCRRT-PCR反應(yīng)體系見表3，反應(yīng)體系可根據(jù)表中各組分比例適當(dāng)調(diào)整。表3 RT-PCR應(yīng)系PCR反應(yīng)試劑體積（μL）2×TaqPCRmasterMix5上游引物：F（10μmol/L）0.5下游引物：R（10μmol/L）0.5cDNA模板1ddH2O3RT-PCR反應(yīng)程序見表4。表4 RT-PCR應(yīng)序步驟時(shí)間和溫度(min、s/°C)循環(huán)數(shù)(個(gè))預(yù)變性5min、95°C1變性30s、95°C35退火30s、56°C延伸30s、72°C延伸7min、72°C1RT-LAMP在每個(gè)RT-LAMP反應(yīng)管內(nèi)加入熒光染料SYBRGreenI0.5μL，渦旋混勻，在紫外光下觀察。4取適量擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像儀中觀察結(jié)果。RT-LAMP陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)1條梯狀條帶并發(fā)出綠色熒光，陰性對(duì)照無條帶不顯色，說明對(duì)照成立。若樣品電泳結(jié)果出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照一致條帶，且顯色反應(yīng)樣品管發(fā)出綠色熒光，判定為SVA核酸陽(yáng)性；若樣品電泳結(jié)果無條帶，顯色反應(yīng)樣品管無綠色熒光變化，判定為SVA核酸陰性。RT-PCR167bpSVASVAB.2CPE8.18.2SVA3CPE8.18.25RT-LAMPRT-PCR8.2SVA3CPE8.18.2SVA5附錄A（.01mol/LpH7.0~7.4PBSNaCl8gKCl0.2gNa2HPO4?12H2O3.58gKH2PO40.27g滅菌雙蒸水800mLNaOH或者HCl調(diào)pH值7.0~7.4，滅菌雙蒸水定容至1000mL,121℃、15min高壓鍋滅菌冷卻，置常溫或4℃?zhèn)溆谩AE（50三羥甲基甲烷堿（Trisbase）242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L（pH8.0）乙二胺四乙酸（EDTA）100mL蒸餾水100mL待上述混合物完全溶解后，加蒸餾水至1000mL，置4℃冰箱中備用，如配制1%的瓊脂糖凝膠和用作電泳緩沖液，則用蒸餾水稀釋50倍，成TAE電泳緩沖液。1.0瓊脂糖1.0g1×TAE緩沖液100mL0.5ug/mLGoldView5uL微波爐充分溶解后，加入溴化乙錠，倒入凝膠板中，在距離底板0.5mm的位置上放置梳子，凝膠的厚度為4mm，待凝膠完全凝固后，小心移去梳子，將凝膠板放入電泳槽中，電泳緩沖液沒過膠面。6附錄B（資料性）豬A型塞內(nèi)卡病毒VP1蛋白基因LAMP和RT-PCR擴(kuò)增序列豬AVP1F3、B3CCGATCTCGACTACTGAATGTAATTAAGGTACTGGAGAAGGACGCCGTCTTCCCCCGTCCTTTCCCCACAGCAACAGGTGCACAGCAGGACGATGGTTACTTTTGTCTTCTAACACCCCGCCCAACAGTCGCTTCCCGACC