DB51∕T 2910-2022 鱘魚類志賀鄰單胞菌病診斷技術(shù)規(guī)程

ICS65.150CCSB52ICS65.150CCSB52四 川 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB51/T2910—2022鱘魚類志賀鄰單胞菌病診斷技術(shù)規(guī)程TechnicalspecificationforthediagnosisofPlesiomonasshigelloidesforsturgeon2022-05-20發(fā)布 2022-07-01實(shí)施四川省市場(chǎng)監(jiān)督管理局 發(fā)布DB51/T2910-2022DB51/T2910-2022標(biāo)準(zhǔn)下載目 次前言 II1范圍 12規(guī)性用件 13術(shù)和義 14試和料 15設(shè)與械 26臨檢查 27實(shí)室品集 28細(xì)分與化 29細(xì)鑒定 210果定 4合定 4附錄A（范）配方 5附錄B（料）志鄰單菌16SrRNA基考序列 6I前 言文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草?！敬螢槭状伟l(fā)布。IIDB51/T2910—2022DB51/T2910—2022標(biāo)準(zhǔn)下載鱘魚類志賀鄰單胞菌病診斷技術(shù)規(guī)程范圍（Acipenserdabryanus）（Acipenserbaerii）shigelloides）（GB/T4789.28-2013食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法GB/T18652-2002致病性嗜水氣單胞菌檢驗(yàn)方法SC/T7013-2008水生動(dòng)物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范SC/T7014-2006水生動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)規(guī)范SC/T7201.1-2006魚類細(xì)菌病檢疫技術(shù)規(guī)程第1部分：通用技術(shù)下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1鱘魚類志賀鄰單胞菌病Plesiomonasshigelloidesforsturgeon（Plesiomonas種細(xì)菌性疾病。檢驗(yàn)中所需試劑、染色液與培養(yǎng)基的配制按照GB/T4789.28、GB/T18652和SC/T7014規(guī)定執(zhí)行，Taq酶、dNTPs、10×PCR緩沖液（無(wú)Mg2+），DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物選用專業(yè)試劑公司提供的商品化試劑；微生物生化鑒定管可替代相應(yīng)鑒定培養(yǎng)基或鑒定試劑，上述未提及的見附錄A。水應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)格。引物16SrRNA基因DNAP-F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3P-R5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，-201PCR病魚共同特征為反應(yīng)遲鈍，離群獨(dú)游，游動(dòng)遲緩或側(cè)翻，攝食減少或停止攝食。SC/T7201.1中6.2剖檢肝臟腫大充血，出血；部分病魚腸道腸腔內(nèi)有少量淡黃色的粘液，部分病魚腸道無(wú)明顯的變化。樣品采集按SC/T7013執(zhí)行。LB℃培育24-48LBLBA.1參考GB/T18652-2002中2.2.5規(guī)定執(zhí)行。采用細(xì)菌生化鑒定管進(jìn)行試驗(yàn)，也可利用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定。（V-P）試驗(yàn)按SC/T7014中表2的規(guī)定執(zhí)行。有氣泡產(chǎn)生為陽(yáng)性；無(wú)氣泡產(chǎn)生為陰性。以毛細(xì)管吸取四甲基對(duì)二苯胺的1%水溶液滴在細(xì)菌的菌落上。菌落呈玫瑰紅色、深紫色為陽(yáng)性，不變色為陰性。2按SC/T7014表2的吲哚（靛基質(zhì)）試驗(yàn)的規(guī)定執(zhí)行。培養(yǎng)基變紅為陽(yáng)性；不變紅為陰性。（將待檢菌穿刺接種于糖、醇類發(fā)酵試驗(yàn)培養(yǎng)基（A.2），28℃培養(yǎng)24h后觀察。培養(yǎng)基變黃色為陽(yáng)性，不變黃色為陰性。按GB/T4789.28中2.8℃培養(yǎng)36h-48h16SrRNADNA酚氯仿法、高鹽法或采用商用試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。16SrRNA2PCR10PCR無(wú)Mg2+（25mmol/L）1.0μL(20μmol/L)P-FP-R1.0μL，TaqDNA（5U/μL）0.5μL，DNA模板1.0μL，50μL，3000r/min30s2PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，35次循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保溫。用TAE（A.3）配制16μL樣品和μL（A.4）DNA120V電泳約20min-40min（1500bp）PCRPCR按每0.1瓊脂糖凝膠加0.1mL酚，將酚加入9.3.31min-2min701h371min-2min；14000r/min離心5min（25﹕24﹕1）（A.5）12000r/min離心5min（24:1）（A.6）12000r/min離心5min1/10體積的3mol/L2-20-70℃放置1h-2。14000r/min離心10minDNATE-20PCR將上述純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，并與參考序列（附錄B）進(jìn)行比對(duì)分析。328℃培養(yǎng)24h-48h，形成圓形、隆起、光滑、邊緣整齊的菌落。革蘭氏染色為陰性短桿菌。生理生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果見表1。表1類志賀鄰單胞菌的生理生化反應(yīng)結(jié)果反應(yīng)項(xiàng)目結(jié)果反應(yīng)項(xiàng)目結(jié)果反應(yīng)項(xiàng)目結(jié)果氧化酶+甘露醇-V-P-吲哚+葡萄糖+運(yùn)動(dòng)性+注：“+”為陽(yáng)性，“-”為陰性16SrRNA測(cè)定的16SrRNA基因序列與附錄B所列的基因序列比較，同源性達(dá)98%以上。符合以下所有特征者判定為類志賀鄰單胞菌病a)臨床癥狀與6相符；b)菌落形態(tài)和染色觀察與10.1和10.2相符；c)生理生化反應(yīng)結(jié)果與10.3相符；d)16SrRNA基因序列同源性分析結(jié)果與10.4相符。4附錄A（規(guī)范性）試劑配方LB胰蛋白胨105gNaCl瓊脂或者瓊脂糖15g蒸餾水1000mLpH7.0-7.2，115℃滅菌20min。蛋白胨2gNaCl5gK2HPO40.2g被測(cè)糖或醇類10g瓊脂6g溴百里酚藍(lán)1％水溶液3mL（溴百里酚藍(lán)先用少量95％乙醇溶解后，再加水配制1％的水溶液）蒸餾水1000mLpH7.0-7.2，分裝試管，培養(yǎng)基高度約4.5cm，115℃滅菌20min。50×TAE在800mL雙蒸水中溶解242gTris堿，加入57.1mL冰乙酸和37.2gEDTA，充分混勻后，加雙蒸水定容至1L，室溫保存。使用時(shí)，配成1×TAE電泳緩沖液。6將溴酚藍(lán)100mg，加雙蒸水5mL，在室溫下過(guò)夜。待溶解后再稱取蔗糖25g，加雙蒸水溶解后移入溴酚藍(lán)溶液中，搖勻后定容至50mL，加入NaOH溶液1滴，調(diào)至藍(lán)色。A.5酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）將2524體積的氯仿和4A.6氯仿：異戊醇（24:1）將24體積的氯仿和1體積的異戊醇混合即可，室溫貯存于不透光的瓶中。5附錄B（資料性）類志賀鄰單胞菌16SrRNA基因參考序列AAGTGGTAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACATACTTTATGGGATTCGCTCACTATCGCTAGCTTGCCGCCCTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGACCGAATCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAATCGACATCGTTTACAGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTAGCTTGCCAGTTTCAAATGCAGTTCCCAAGTTGAGCTCGGGGATTTCACATCTGACTTAACAAACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGAGTAACGTCAATGCCACTAGGTATTAACTAGTGACCCTTCCTCCCCGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGGTCATTCTCTC