微生物分類鑒定

微生物分類鑒定微生物分類鑒定微生物分類鑒定V:1.0精細(xì)整理，僅供參考微生物分類鑒定日期：20xx年X月第三節(jié)微生物的分類鑒定方法一、微生物鑒定的依據(jù)獲得純化的微生物分離菌株后，首先判定是原核微生物還是真核微生物，這實際上在分離過程中所使用的方法和選擇性培養(yǎng)基已經(jīng)決定了分離菌株的大類的歸屬，從平板菌落的特征和液體培養(yǎng)的性狀都可加以判定。然后，如是原核微生物，便可根據(jù)表14-3所示的經(jīng)典分類鑒定指標(biāo)進(jìn)行鑒定，如條件允許，可做碳源利用的BIOLOG-GN分析和16SrDNA序列分析。多項結(jié)果結(jié)合起來確定分離菌株的屬和種。表14-3微生物經(jīng)典分類鑒定方法的指標(biāo)依據(jù)經(jīng)典分類法個體：細(xì)胞形態(tài)、大小、排列方式，染色反應(yīng)，有無運動，各種特殊構(gòu)造特征等形態(tài)特征：菌落形態(tài)，在固體、半固體或液體培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)等營養(yǎng)要求：碳源、氮源、礦質(zhì)元素、生長因子等生理生化特征：代謝產(chǎn)物種類、產(chǎn)量、顯色反應(yīng)等酶：產(chǎn)酶種類和反應(yīng)特征等生態(tài)學(xué)特性：生長溫度，對氧的需要，酸堿度要求，宿主種類，生態(tài)分布等血清學(xué)反應(yīng)噬菌體的敏感性其他二、微生物鑒定的技術(shù)與方法根據(jù)目前微生物分類學(xué)中使用的技術(shù)和方法，可把它們分成四個不同的水平：①細(xì)胞形態(tài)和行為水平，②細(xì)胞組分水平，③蛋白質(zhì)水平，④基因組水平；在微生物分類學(xué)發(fā)展的早期，主要的分類鑒定指標(biāo)是以在細(xì)胞形態(tài)和習(xí)性為主，可稱為經(jīng)典的分類鑒定法。其他三種實驗技術(shù)主要是60年代以后采用的，稱為化學(xué)分類和遺傳學(xué)分類法，這些方法再加上數(shù)值分類鑒定法，可稱為現(xiàn)代的分類鑒定方法。（一）、經(jīng)典分類鑒定法經(jīng)典分類法是一百多年來進(jìn)行微生物分類的傳統(tǒng)方法。其特點是人為地選擇幾種形態(tài)生理生化特征進(jìn)行分類，并在分類中將表型特征分為主、次。一般在科以上分類單位以形態(tài)特征、科以下分類單位以形態(tài)結(jié)合生理生化特征加以區(qū)分。最后，采用雙歧法整理實驗結(jié)果，排列一個個的分類單元，形成雙歧檢索表（圖14-4）。A.能在60oC以上生長B.細(xì)胞大，寬度1.3~1.8mm………1.熱微菌屬(Thermomicrobium)BB.細(xì)胞小，寬度0.4~0.8mmC.能以葡萄糖為碳源生長D.能在pH4.5生長……………2.熱酸菌屬(Acidothermus)DD.不能在pH4.5生長…………………3.棲熱菌屬(Thermus)CC.不能以葡萄糖為唯一碳源………4.棲熱嗜油菌屬(棲熱嗜獅菌屬Thermoleophilum)AA.不能在60oC以上生長圖14-4雙歧法檢索表例樣應(yīng)用BIOLOG-GN儀檢測分離菌株對眾多碳源的利用情況判斷分離菌株的分類地位，近年來也時有應(yīng)用。在BIOLOG-GN儀上有96個小孔，其中95孔內(nèi)分裝有95種不同碳源的緩沖液，1孔為無碳源的緩沖液對照，各孔接入適宜菌濃度和液量的分離菌株培養(yǎng)物，定溫培養(yǎng)，每日定時讀取BIOLOG-GN儀計算機上各碳源利用情況，一般為時1周，BIOLOG-GN儀可顯示出該鑒定菌株的最可能歸屬。（二）、數(shù)值分類法又稱阿德遜氏分類法()。它的特點是根據(jù)較多的特征進(jìn)行分類，一般為50～60個，多者可達(dá)100個以上，在分類上，每一個特性的地位都是均等重要。通常是以形態(tài)、生理生化特征，對環(huán)境的反應(yīng)和忍受性以及生態(tài)特性為依據(jù)。最后，將所測菌株兩兩進(jìn)行比較，并借用電子計算機計算出菌株間的總相似值，列出相似值矩陣(圖14-5)。為便于觀察，應(yīng)將矩陣重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后將矩陣圖轉(zhuǎn)換成樹狀譜(dendrogram)(圖14-6)，再結(jié)合主觀上的判斷(如劃分類似程度大于85％者為同種，大于65％者為同屬等)，排列出—個個分類群。圖14-5顯示6個細(xì)菌菌株的遺傳相似矩陣圖圖14-6根據(jù)相似矩陣圖轉(zhuǎn)換的相似關(guān)系樹狀譜數(shù)值分類法的優(yōu)越性在于它是以分析大量分類特征為基礎(chǔ)，對于類群的劃分比較客觀和穩(wěn)定；而且促進(jìn)對細(xì)菌類群的全面考查和觀察，為細(xì)菌的分類鑒定積累大量資料。但在使用數(shù)值分類法對細(xì)菌菌株分群歸類定種或定屬時，還應(yīng)做有關(guān)菌株的DNA堿基的G+Cmol%和DNA雜交，以進(jìn)一步加以確證。（三）、化學(xué)分類法微生物分類中，根據(jù)微生物細(xì)胞的特征性化學(xué)組分對微生物進(jìn)行分類的方法稱化學(xué)分類法(chemotaxonomy)。在近二十多年中，采用化學(xué)和物理技術(shù)采研究細(xì)菌細(xì)胞的化學(xué)組成，已獲得很有價值的分類和鑒定資料，各種化學(xué)組分在原核微生物分類中的意義見表14-4。表14-4細(xì)菌的化學(xué)組分分析及其在分類水平上的應(yīng)用細(xì)胞成份分析內(nèi)容在分類水平上的作用細(xì)胞壁肽聚糖結(jié)構(gòu)種和屬多糖胞壁酸膜脂肪酸種和屬極性類脂霉菌酸類異戊二烯苯醌蛋白質(zhì)氨基酸序列分析屬和屬以上單位血清學(xué)比較電泳圖酶譜代謝產(chǎn)物脂肪酸種和屬全細(xì)胞成分分析熱解—氣液色譜分析種和亞種熱解—質(zhì)譜分析隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞化學(xué)組分分析用于微生物分類日趨顯示出重要性。細(xì)胞壁的氨基酸種類和數(shù)量現(xiàn)己被接受為細(xì)菌屬的水平的重要分類學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。在放線菌分類中，細(xì)胞壁成分和細(xì)胞特征性糖的分析作為分屬的依據(jù)，已被廣泛應(yīng)用。脂質(zhì)是區(qū)別細(xì)菌還是古菌的標(biāo)準(zhǔn)之一，細(xì)菌具有?；?脂鍵)，而古菌具有醚鍵脂，因此醚鍵脂的存在可用以區(qū)分古菌。霉菌酸的分析測定己成為諾卡氏菌形放線菌分類鑒定中的常規(guī)方法之一。鞘氨醇單胞菌和鞘氨醇桿菌等細(xì)胞膜都含有鞘氨醇，因此鞘氨醇的有無可作為此類細(xì)菌的一個重要標(biāo)志。此外某些細(xì)菌原生質(zhì)膜中的異戊間二烯醌，細(xì)胞色素，以及紅外光譜等分析對于細(xì)菌、放線菌中某些科、屬、種的鑒定也都十分有價值。（四）、遺傳學(xué)分類法分子遺傳學(xué)分類法是以微生物的遺傳型(基因型)特征為依據(jù)，判斷微生物問的親緣關(guān)系，排列出一個個的分類群。目前較常使用的方法有：1、DNA中G+Cmol%分析每一個微生物種的DNA中GCmol%的數(shù)值是恒定的，不會隨著環(huán)境條件、培養(yǎng)條件等的變化而變化，而且在同一個屬不同種之間，DNA中GCmol%的數(shù)值不會差異太大，可以某個數(shù)值為中心成簇分布，顯示同屬微生物種的GCmol%范圍。DNA中GCmol%分析主要用于區(qū)分細(xì)菌的屬和種，因為細(xì)菌DNA中GC含量的變化范圍一般在25％～75％；而放線菌DNA中的GC比例范圍非常窄(37％～51%)。一般認(rèn)為任何兩種微生物在GC含量上的差別超過了10％，這兩種微生物就肯定不是同一個種。因此可利用G+Cmol％來鑒別各種微生物種屬間的親緣關(guān)系及其遠(yuǎn)近程度。值得注意的是，親緣關(guān)系相近的菌，其G+Cmol％含量相同或者近似，但G+Cmol％相同或近似的細(xì)菌，其親緣關(guān)系并不一定相似，這是因為這一數(shù)據(jù)還不能反映出堿基對的排列序列，而且如放線菌的DNA的GCmol%在37～51之間，企圖在這么小的范圍內(nèi)區(qū)分放線菌的幾十個屬顯然是不現(xiàn)實的。要比較兩種細(xì)菌的DNA堿基對排列序列是否相同，以及相同的程度如何，就需做核酸雜交試驗。2、DNA-DNA雜交DNA雜交法的基本原理是用DNA解鏈的可逆性和堿基配對的專一性，將不同來源的DNA在體外加熱解鏈，并在合適的條件下，使互補的堿基重新配對結(jié)合成雙鏈DNA，然后根據(jù)能生成雙鏈的情況，檢測雜合百分?jǐn)?shù)。如果兩條單鏈DNA的堿基順序全部相同，則它們能生成完整的雙鏈，即雜合率為100%。如果兩條單鏈DNA的堿基序列只有部分相同，則它們能生成的“雙鏈”僅含有局部單鏈，其雜合率小于100%。由此；雜合率越高，表示兩個DNA之間堿基序列的相似性越高，它們之間的親緣關(guān)系也就越近。如兩株大腸埃希氏菌的DNA雜合率可高達(dá)100％，而大腸埃希氏菌與沙門氏菌的DNA雜合率較低，約有70％。G+Cmol％的測定和DNA雜交實驗為細(xì)菌種和屬的分類研究開辟了新的途徑，解決了以表觀特征為依據(jù)所無法解決的一些疑難問題，但對于許多屬以上分類單元間的親緣關(guān)系及細(xì)菌的進(jìn)化問題仍不能解決。3、DNA—rRNA雜交目前研究RNA堿基序列的方法有兩種。一是DNA與rRNA雜交，二是16SrRNA寡核苷酸的序列分析。DNA與rRNA雜交的基本原理、實驗方法同DNA雜交一樣，不同的是①是DNA雜交中同位素標(biāo)記的部分是DNA，而DNA與rRNA雜交中同位素標(biāo)記的部分是rRNA。②DNA雜交結(jié)果用同源性百分?jǐn)?shù)表示，而DNA與rRNA雜交結(jié)果用Tm(e)和RNA結(jié)合數(shù)表示。Tm(e)值是DNA與rRNA雜交物解鏈一半時所需要的溫度。RNA結(jié)合數(shù)是100mgDNA所結(jié)合的rRNA的mg數(shù)。根據(jù)這個參數(shù)可以作出RNA相似性圖。在rRNA相似性圖上，關(guān)系較近的菌就集中到一起。關(guān)系較遠(yuǎn)的菌在圖上占據(jù)不同的位置。用rRNA同性試驗和16SrRNA寡核苷酸編目的相似性比較rRNA順反子的實驗數(shù)據(jù)可得到屬以上細(xì)菌分類單元的較一致的系統(tǒng)發(fā)育概念，并導(dǎo)致了古細(xì)菌的建立。4、16SrRNA(16SrDNA)寡核苷酸的序列分析首先，16SrRNA普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是18SrRNA）中。rRNA參與生物蛋白質(zhì)的合成過程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物進(jìn)化的漫長歷程中保持不變，可看作為生物演變的時間鐘。其次，在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，因而它適用于進(jìn)化距離不同的各類生物親緣關(guān)系的研究。第三，16SrRNA的相對分子量大小適中，約1540個核苷酸，便于序列分析。因此，它可以作為測量各類生物進(jìn)化和親緣關(guān)系的良好工具。分離菌株16SrRNA基因的分離較為簡單。從平板中直接挑取一環(huán)分離菌株細(xì)胞,加入100μL無菌重蒸H2O中,旋渦混勻后,沸水浴2min,12000rmin-1離心5min,上清液中即含16SrRNA基因，可直接用于PCR擴增。分離菌株16SrRNA基因的PCR擴增和序列測定的一般步驟為：16SrRNA基因的PCR引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。擴增反應(yīng)體積50mL，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共進(jìn)行29個循環(huán)，PCR反應(yīng)在PTC-200型熱循環(huán)儀上進(jìn)行。取測序得到分離菌株16SrDNA部分序列，此序列一般以*.f.seq形式保存，可以用寫字板或Editsequence軟件打開，將所得序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析(/blast)，具體步驟如下：點擊網(wǎng)站中NucleotideBLAST下Nucleotide-nucleotideBLAST[blastn]選項，將測序所得序列粘貼在“search”網(wǎng)頁空白處，或輸入測序結(jié)果所在文件夾目錄，點擊核酸比對選項，即“blast”，然后點擊“format”，計算機自動開始搜索核苷酸數(shù)據(jù)庫中序列并進(jìn)行序列比較，根據(jù)同源性高低列出相近序列及其所屬種或?qū)?，以及菌株相關(guān)信息，從而初步判斷16SrDNA鑒定結(jié)果。遺傳距離矩陣與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，可采用DNAStar軟件包中的MegAlign程序計算樣本間的遺傳距離。由GenBank中得到相關(guān)菌株的序列，與本研究分離菌株所測得序列一起輸入Clustalx1.8程序進(jìn)行DNA同源序列排列，并經(jīng)人工仔細(xì)核查。在此基礎(chǔ)上，序列輸入Phylip3.6軟件包，以簡約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用Kimura2-parameter法，系統(tǒng)樹各分枝的置信度經(jīng)重抽樣法（Bootstrap）500次重復(fù)檢測，DNA序列變異中的轉(zhuǎn)換和顛換賦于相同的加權(quán)值。第一章微生物檢驗常規(guī)鑒定技術(shù)課堂教學(xué)計劃（1學(xué)時）名稱第一章微生物常規(guī)鑒定技術(shù)目的要求復(fù)習(xí)微生物檢驗基本知識，并重點掌握微生物常規(guī)鑒定技術(shù)；如形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察以及微生物檢驗中常用的生化反應(yīng)。重點難點微生物常規(guī)鑒定技術(shù)教學(xué)內(nèi)容及教學(xué)組織教學(xué)方法、手段及時間安排第一章微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一、接種二、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)三、培養(yǎng)二一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察1、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過染色2、細(xì)菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基表面形成的細(xì)胞群體叫菌落二、生理生化試驗微生物檢驗中常用的生化反應(yīng)通過講授和演示等方式進(jìn)行；并采取舉例方式進(jìn)行教學(xué)，使其理論與實踐相結(jié)合，便于理解記憶。第一章微生物檢驗基本知識包括顯微鏡、染色技術(shù)、培養(yǎng)基制備技術(shù)、接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)等。接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)一、接種將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。１、接種工具和方法接種和分離工具1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀常用的接種方法有以下幾種：１）劃線接種這是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來回直線形的移動，就可達(dá)到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。２）三點接種在研究霉菌形態(tài)時常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點，讓它各自獨立形成菌落后，來觀察、研究它們的形態(tài)。除三點外，也有一點或多點進(jìn)行接種的。３）穿刺接種在保藏厭氧菌種或研究微生物的動力時常采用此法。做穿刺接種時，用的接種工具是接種針。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺，如某細(xì)菌具有鞭毛而能運動，則在穿刺線周圍能夠生長。４）澆混接種該法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后再倒入冷卻至45°C左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達(dá)到稀釋的目的。待平板凝固之后，置合適溫度下培養(yǎng)，就可長出單個的微生物菌落。５）涂布接種與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作來回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可長出單個的微生物的菌落。６）液體接種從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，倒入液體培養(yǎng)基中，或者從液體培養(yǎng)物中，用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)物中將菌液移至固體培養(yǎng)基中，都可稱為液體接種。７）注射接種該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，如人或其它動物中，常見的疫苗預(yù)防接種，就是用注射接種，接入人體，來預(yù)防某些疾病。８）活體接種活體接種是專門用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法，因為病毒必須接種于活的生物體內(nèi)才能生長繁殖。所用的活體可以是整個動物；也可以是某個離體活組織，例如猴腎等；也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。２、無菌操作培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個過程叫做無菌接種操作。在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌操作。圖5－４斜面接種時的無菌操作(1)接種滅菌(2)開啟棉塞(3)管口滅菌(4)挑起菌苔(5)接種(6)塞好棉塞二、分離純化含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（Mixedculture）。如果在一個菌落中所有細(xì)胞均來自于一個親代細(xì)胞，那么這個菌落稱為純培養(yǎng)（Pureculture）。在進(jìn)行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純化，方法有許多種。１、傾注平板法首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40-50°左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合，然后把這混合液傾注到無菌的培養(yǎng)皿中，待凝固之后，把這平板倒置在恒箱中培養(yǎng)。單一細(xì)胞經(jīng)過多次增殖后形成一個菌落，取單個菌落制成懸液，重復(fù)上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。（圖5－５，a）圖5－５傾注平板法（a）涂布平板法（b）圖解1.菌懸液2.熔化的培養(yǎng)基3.培養(yǎng)物4.無菌水２、涂布平板法首先把微生物懸液通過適當(dāng)?shù)南♂專∫欢康南♂屢悍旁跓o菌的已經(jīng)凝固的營養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上，經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個菌落。（圖5－５，b）３、平板劃線法最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進(jìn)行劃線。劃線的方法很多，常見的比較容易出現(xiàn)單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。（圖5－６）當(dāng)接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動時，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，最后在所劃的線上分散著單個細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)，每一個細(xì)胞長成一個菌落。（圖5－７）４、富集培養(yǎng)法富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡單。我們可以創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生物生長，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進(jìn)行競爭，在生長能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他微生物。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群體中，使其大量生長。通過多次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。圖5－６平板劃線分離法1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法５、厭氧法在實驗室中，為了分離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng)容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數(shù)分鐘，以便逐出培養(yǎng)基中的溶解氧。然后快速冷卻，并進(jìn)行接種。接種后，加入無菌的石蠟于培養(yǎng)基表面，使培養(yǎng)基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種后，利用N2或CO2取代培養(yǎng)基中的氣體，然后在火焰上把試管口密封。有時為了更有效地分離某些厭氧菌，可以把所分離的樣品接種于培養(yǎng)基上，然后再把培養(yǎng)皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。三、培養(yǎng)1、根據(jù)培養(yǎng)時是否需要氧氣，可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)兩大類。好氧培養(yǎng)：也稱“好氣培養(yǎng)”。就是說這種微生物在培養(yǎng)時，需要有氧氣加入，否則就不能生長良好。在實驗室中，斜面培養(yǎng)是通過棉花塞從外界獲得無菌的空氣。三角燒瓶液體培養(yǎng)多數(shù)是通過搖床振蕩，使外界的空氣源源不斷地進(jìn)入瓶中。厭氧培養(yǎng)：也稱“厭氣培養(yǎng)”。這類微生物在培養(yǎng)時，不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養(yǎng)過程中，最重要的一點就是要除去培養(yǎng)基中的氧氣。一般可采用下列幾種方法：a.降低培養(yǎng)基中的氧化還原電位：常將還原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等，加入到培養(yǎng)基中，便可達(dá)到目的。有的將一些動物的死的或活的組織如牛心、羊腦加入到培養(yǎng)基中，也可適合厭氧菌的生長。b.化合去氧：這也有很多方法，主要有：用焦性沒食子酸吸收氧氣；用磷吸收氧氣；用好氧菌與厭氧混合培養(yǎng)吸收氧氣；用植物組織如發(fā)芽的種子吸收氧氣；用產(chǎn)生氫氣與氧化合的方法除氧。c.隔絕阻氧：深層液體培養(yǎng)；用石蠟油封存；半固體穿刺培養(yǎng)。d.替代驅(qū)氧用二氧氣碳驅(qū)代氧氣；用氮氣驅(qū)代氧氣；用真空驅(qū)代氧氣；用氫氣驅(qū)代氧氣；用混和氣體驅(qū)代氧氣。２、根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩大類。固體培養(yǎng)：液體培養(yǎng)：第二章微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察１、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過染色，在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)（包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進(jìn)行觀察，直觀地了解細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。２、細(xì)菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基表面形成的細(xì)胞群體叫菌落（colony）。不同微生物在某種培養(yǎng)基中生長繁殖，所形成的菌落特征有很大差異，而同一種的細(xì)菌在一定條件下，培養(yǎng)特征卻有一定穩(wěn)定性。以此可以對不同微生物加以區(qū)別鑒定。因此，微生物培養(yǎng)特性的觀察也是微生物檢驗鑒別中的一項重要內(nèi)容。１）細(xì)菌的培養(yǎng)特征包括以下內(nèi)容：在固體培養(yǎng)基上，觀察菌落大小、形態(tài)、顏色（色素是水溶性還是脂溶性）、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養(yǎng)中的表面生長情況（菌膜、環(huán)）混濁度及沉淀等。半固體培養(yǎng)基穿刺接種觀察運動、擴散情況。（圖３－８）圖３－８細(xì)菌的培養(yǎng)特征1.點狀2.圓形3.絲狀4.不規(guī)則形5.假根狀6.紡錘狀7.扁平8.隆起9.凸起10.墊狀11.臍狀12.邊緣整齊13.波狀14.裂片狀15.嚙蝕狀16.絲狀17.卷發(fā)狀18.絲線狀19.刺毛狀20.串珠狀21.疏展?fàn)?2.樹根狀23.假根狀24.絲狀25.串珠狀26.乳頭狀27.絨毛狀28.樹根狀29.量杯狀30.蘿卜狀31.漏斗狀32.囊狀33.層狀34.絮狀35.環(huán)狀36.蹼狀37.膜狀２）霉菌酵母菌的培養(yǎng)特征：大多數(shù)酵母菌沒有絲狀體，在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和細(xì)菌的很相似，只是比細(xì)菌菌落大且厚。液體培養(yǎng)也和細(xì)菌相似，有均勻生長、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長，在條件適宜的培養(yǎng)基里，菌絲無限伸長沿培養(yǎng)基表面蔓延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無色，基內(nèi)菌絲褐色。霉菌在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。二、生理生化試驗微生物生化反應(yīng)：指用化學(xué)反應(yīng)來測定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應(yīng)常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。微生物檢驗中常用的生化反應(yīng)有：１、糖酵解試驗不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣。可用指示劑及發(fā)酵管檢驗。試驗方法：以無菌操作，用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基管，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。接種后，置36±1.0°C培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，檢視培養(yǎng)基顏色有無改變（產(chǎn)酸），小倒管中有無氣泡，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽性，若為半固體培養(yǎng)基，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡，有時還可看出接種菌有無動力，若有動力、培養(yǎng)物可呈彌散生長。本試驗主要是檢查細(xì)菌對各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力，從而進(jìn)行各種細(xì)菌的鑒別，因而每次試驗，常需同時接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫，溴百里藍(lán)和An-drade指示劑。２、淀粉水解試驗?zāi)承┘?xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。試驗方法：以18~24h的純培養(yǎng)物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個平板可分區(qū)接種，試驗數(shù)種培養(yǎng)物）或直接移種于淀粉肉湯中，于36±1°C培養(yǎng)24~48h，或于20°培養(yǎng)5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。立即檢視結(jié)果，陽性反應(yīng)（淀粉被分解）為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無色透明環(huán)、或肉湯顏色無變化。陰性反應(yīng)則無透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色。淀粉水解系逐步進(jìn)行的過程，因而試驗結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養(yǎng)時間，培養(yǎng)基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系。培養(yǎng)基pH必須為中性或微酸性，以pH7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時制備為妥。３、V-P試驗?zāi)承┘?xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應(yīng)。試驗方法：１）O’Meara氏法：將試驗菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1°C培養(yǎng)48h，培養(yǎng)液1ml加O’Meara試劑（加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氫氧化鈉水溶液）1ml，搖動試管1~2min，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱，若4h內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅、即判定為陰性。亦有主張在48~50°C水浴放置2h后判定結(jié)果者。２）Barritt氏法：將試驗菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1°C培養(yǎng)4天、培養(yǎng)液2.5ml先加入5°Cα萘酚（2-na-phthol）純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml，搖動2~5min，陽性菌常立即呈現(xiàn)紅色，若無紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱，如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色、可判定為陰性。３）快速法：將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán)，乳化接種于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動后放置5min，判定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用。本試驗一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細(xì)菌時，通用培養(yǎng)基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生，故應(yīng)省去或以氯化鈉代替。４、甲基紅（MethylRed）試驗?zāi)c桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。試驗方法：挑取新的待試純培養(yǎng)物少許，接種于通用培養(yǎng)基，培養(yǎng)于36±1°C或30°C（以30°C較好）3~5天，從第二天起，每日取培養(yǎng)液1ml，加甲基紅指示劑1~2滴，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性為黃色。迄至發(fā)現(xiàn)陽性或至第5天仍為陰性、即可判定結(jié)果。甲基紅為酸性指示劑，pH范圍為4.4~6.0，其pK值為5.0。故在pH5.0以下，隨酸度而增強黃色，在pH5.0以上，則隨堿度而增強黃色，在pH5.0或上下接近時，可能變色不夠明顯，此時應(yīng)延長培養(yǎng)時間，重復(fù)試驗。５、靛基質(zhì)（Imdole）試驗?zāi)承┘?xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。試驗方法：將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗培養(yǎng)基管，于36±1C培養(yǎng)24h時后，取約2ml培養(yǎng)液，加入Kovacs氏試劑2~3滴，輕搖試管，呈紅色為陽性，或先加少量乙醚或二甲苯，搖動試管以提取和濃縮靛基質(zhì)，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數(shù)滴，在接觸面呈紅色，即為陽性。實驗證明靛基質(zhì)試劑可與17種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽性反應(yīng)，若先用二甲苯或乙醚等進(jìn)行提取，再加試劑，則只有靛基質(zhì)或5-甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色，因而結(jié)果更為可靠。６、硝酸鹽（Nitrate）還原試驗有些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗。試驗方法：臨試前將試劑的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（α－萘胺乙醇溶液）試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加于液體培養(yǎng)物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面，立即或于10min內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為試驗陽性，若無紅色出現(xiàn)則為陰性。用α-萘胺進(jìn)行試驗時，陽性紅色消退很快、故加入后應(yīng)立即判定結(jié)果。進(jìn)行試驗時必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對照。α-萘胺具有致癌性、故使用時應(yīng)加注意。７、明膠（Gelatin）液化試驗有些細(xì)菌具有明膠酶（亦稱類蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進(jìn)一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化。試驗方法：挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點種于平板培養(yǎng)基。于20~22℃培養(yǎng)7~14天。明膠高層亦可培養(yǎng)于36±1℃。每天觀察結(jié)果，若因培養(yǎng)溫度高而使明膠本身液化時應(yīng)不加搖動、靜置冰箱中待其凝固后、再觀察其是否被細(xì)菌液化，如確被液化，即為試驗陽性。平板試驗結(jié)果的觀察為在培養(yǎng)基平板點種的菌落上滴加試劑，若為陽性，10~20min后，菌落周圍應(yīng)出現(xiàn)清晰帶環(huán)。否則為陰性。８、尿素酶（Urease）試驗有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因為不論底物尿素是否存在，細(xì)菌均能合成此酶。其活性最適pH為7.0。試驗方法：挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物大量接種于液體培養(yǎng)基管中，搖均，于36±1℃培養(yǎng)10，60和120min，分別觀察結(jié)果?；蛲坎疾⒋┐探臃N于瓊脂斜面，不要到達(dá)底部，留底部作變色對照。培養(yǎng)2，4和24h分別觀察結(jié)果，如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定，變?yōu)榉奂t色為陽性。９、氧化酶（Oxidase）試驗氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶，為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，氧化酶先使細(xì)胞色素C氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。試驗方法：在瓊脂斜面培養(yǎng)物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1~2滴，陽性者Kovacs氏試劑呈粉紅色~深紫色，Ewing氏改進(jìn)試劑呈藍(lán)色。陰性者無顏色改變。應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)判定試驗結(jié)果。10、硫化氫（H2S）試驗有些細(xì)菌可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。試驗方法：在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養(yǎng)基中，沿管壁穿刺接種，于36±1℃培養(yǎng)24~28h，培養(yǎng)基呈黑色為陽性。陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至6天。也可用醋酸鉛紙條法：將待試菌接種于一般營養(yǎng)肉湯，再將醋酸鉛紙條懸掛于培養(yǎng)基上空，以不會被濺濕為適度；用管塞壓住置36±1℃培養(yǎng)1~6天。紙條變黑為陽性。11、三糖鐵（TSI）瓊脂試驗試驗方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置36±1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。12、硫化氫-靛基質(zhì)-動力（SIM）瓊脂試驗試驗方法：以接種針挑取菌落或純養(yǎng)物穿刺接種約1/2深度，置36±1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。培養(yǎng)物呈現(xiàn)黑色為硫化氫陽性，混濁或沿穿刺線向外生長為有動力，然后加Kovacs氏試劑數(shù)滴于培養(yǎng)表面，靜置10min，若試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽性。培養(yǎng)基未接種的下部，可作為對照。本試驗用于腸桿菌科細(xì)菌初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著提高篩選功效。三、血清學(xué)試驗血清學(xué)反應(yīng)是指：相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集現(xiàn)象。在食品微生物檢驗中，常用血清學(xué)反應(yīng)來鑒定分離到的細(xì)菌，以最終確認(rèn)檢測結(jié)果。血清學(xué)反應(yīng)的一般特點：1)抗原體的結(jié)合具有特異性，當(dāng)有共同抗原體存在時，會出現(xiàn)交叉反應(yīng)。2)抗原體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，這種結(jié)合雖相當(dāng)穩(wěn)定，但是可逆的。3)抗原體的結(jié)合是按一定比例進(jìn)行的，只有比例適當(dāng)時，才能出現(xiàn)可見反應(yīng)。4)血清學(xué)反應(yīng)大體分為兩個階段進(jìn)行，但其間無嚴(yán)格界限。第一階段為抗原體特異性結(jié)合階段，反應(yīng)速度很快，只需幾秒至幾分鐘反應(yīng)即可完畢，但不出現(xiàn)肉眼可見現(xiàn)象。第二階段為抗原體反應(yīng)的可見階段，表現(xiàn)為凝集、沉淀、補體結(jié)合反應(yīng)等。反應(yīng)速度慢，需幾分、幾十分以至更長時間。而且，在第二階段反應(yīng)中，電解質(zhì)、PH、溫度等環(huán)境因素的變化，都直接影響血清學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。習(xí)慣上將經(jīng)典的血清學(xué)反應(yīng)分三種類別：凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)和補體結(jié)合反應(yīng)。１、凝集