分子熒光法測(cè)定維生素B2的含量Word版

整理為word格式整理為word格式整理為word格式【實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目】分子熒光法定量測(cè)定維生素B2的含量【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆諛?biāo)準(zhǔn)曲線法定量分析維生素B2的基本原理。了解熒光分光光度計(jì)的基本原理、結(jié)構(gòu)及性能，掌握其基本操作?！緦?shí)驗(yàn)原理】熒光是光致發(fā)光。任何熒光物質(zhì)都具有激發(fā)光譜和發(fā)射光譜,發(fā)射波長(zhǎng)總是大于激發(fā)波長(zhǎng)。熒光激發(fā)光譜是通過(guò)測(cè)定熒光體的發(fā)光通量隨波長(zhǎng)變化而獲得的光譜，反映不同波長(zhǎng)激發(fā)光引起熒光的相對(duì)效率。熒光發(fā)射光譜是當(dāng)熒光物質(zhì)在固定的激發(fā)光源照射后所產(chǎn)生的分子熒光，是熒光強(qiáng)度對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)的關(guān)系曲線，表示在所發(fā)射的熒光中各種波長(zhǎng)相對(duì)強(qiáng)度。由于各種不同的熒光物質(zhì)有它們各自特定的熒光發(fā)射波長(zhǎng)，可用它來(lái)鑒定熒光物質(zhì)。有些發(fā)熒光的物質(zhì)其熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比，故可用熒光分光光度法測(cè)定其含量。維生素B2溶液在430~440nm藍(lán)光的照射下，發(fā)出綠色熒光，熒光峰在535nm附近。維生素B2在pH＝6~7的溶液中熒光強(qiáng)度最大，而且其熒光強(qiáng)度與維生素B2溶液濃度呈線性關(guān)系，因此可以用熒光光譜法測(cè)維生素B2的含量。維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射會(huì)發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為另一物質(zhì)——光黃素，光黃素也是一個(gè)能發(fā)熒光的物質(zhì)，其熒光比維生素B2的熒光強(qiáng)得多，故測(cè)維生素B2的熒光時(shí)溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進(jìn)行。在稀溶液中，熒光強(qiáng)度F與物質(zhì)的濃度c有以下關(guān)系：F＝2.303ФI0εbc當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時(shí)，熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系：F=Kc【儀器與試劑】?jī)x器：熒光分光光度計(jì)（型號(hào)：F2500HITA[H]）；1cm石英比色皿；50mL容量瓶整理為word格式整理為word格式整理為word格式試劑：維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液（10.0μg/mL）（已加乙酸）【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟】1.系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)溶液的配制取維生素B2（10.0μg/mL）標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL分別置于50mL的容量瓶中，標(biāo)定，搖勻。取2.00mL待測(cè)溶液于50mL的容量瓶中，標(biāo)定，搖勻。2.激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜的繪制（用3.00mLd的標(biāo)準(zhǔn)溶液）設(shè)置λEm=520nm為發(fā)射波長(zhǎng)，在250~400范圍內(nèi)掃描，記錄發(fā)射波長(zhǎng)強(qiáng)度和激發(fā)波長(zhǎng)的關(guān)系曲線，便得到激發(fā)光譜。記錄最大激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置λEx為最大激發(fā)波長(zhǎng)即371nm，在400~600nm范圍內(nèi)掃描，記錄發(fā)射強(qiáng)度與發(fā)射波長(zhǎng)間的函數(shù)關(guān)系，便得到熒光發(fā)射光譜從熒光發(fā)射光譜上找出其最大的發(fā)射波長(zhǎng)λEm和熒光強(qiáng)度。標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品的熒光測(cè)定將激發(fā)波長(zhǎng)固定在371nm，熒光發(fā)射波長(zhǎng)為521nm，測(cè)量上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光發(fā)射強(qiáng)度，按濃度從從低到高測(cè)定。在同樣條件下測(cè)定未知溶液的熒光強(qiáng)度，并由標(biāo)準(zhǔn)曲線確定未知試樣中維生素B2的濃度?！緦?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)】1.激發(fā)波長(zhǎng)λEx=371nm熒光發(fā)射波長(zhǎng)λEm=521nm2.標(biāo)準(zhǔn)溶液劑待測(cè)溶液的濃度和熒光強(qiáng)度記錄維生素B2溶液濃度（μg/mL）0.20.40.60.81.0待測(cè)溶液相對(duì)熒光強(qiáng)度26.7051.7675.3598．81121.050.38可得待測(cè)溶液的濃度為0.393μg/mL.整理為word格式整理為word格式整理為word格式【實(shí)驗(yàn)圖像】1.以λEm=520為發(fā)射波長(zhǎng)，溶液濃度為0.6μg/mL，在250~400nm范圍掃描得到的熒光強(qiáng)度和激發(fā)波長(zhǎng)的關(guān)系曲線設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為371nm，溶液濃度為0.6μg/mL，在400~600nm范圍內(nèi)掃描，所得發(fā)射強(qiáng)度與發(fā)射波長(zhǎng)間的熒光發(fā)射光譜如下：整理為word格式整理為word格式整理為word格式3.以激發(fā)波長(zhǎng)λEx=371nm熒光發(fā)射波長(zhǎng)λEm=521nm，測(cè)量系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光發(fā)射強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：【結(jié)果分析與討論】1.石英皿是四面透光的，拿的時(shí)候不能接觸到四個(gè)透光面，只能拿上下角部，擦外壁殘留液時(shí)由于擦鏡紙不吸水，故可先用吸水紙巾擦干，再用擦鏡紙擦。整理為word格式整理為word格式整理為word格式2.本次實(shí)驗(yàn)所得到的R值為0.99977，而理論R值為1，相關(guān)度很接近，說(shuō)明準(zhǔn)確度比較高，溶液配制比較準(zhǔn)確。3.配制好的溶液應(yīng)盡快測(cè)量，避免久置成分變化而影響結(jié)果。4.干擾熒光分光分光度法的因素：(1)溶劑：同一熒光物質(zhì)在不同的溶劑中可能表現(xiàn)出不同的熒光性質(zhì)。溶劑的極性增強(qiáng)，對(duì)激發(fā)態(tài)會(huì)產(chǎn)生更大的穩(wěn)定作用，結(jié)果使物質(zhì)的熒光波長(zhǎng)紅移，熒光強(qiáng)度增大。(2)溫度：升高溫度會(huì)使非輻射躍遷概率增大，熒光效率降低。(3)PH：大多數(shù)含有酸性或堿性取代基團(tuán)的芳香族化合物的熒光性質(zhì)受PH的影響很大。(4)溶液表面活性劑的存在，減少非輻射躍遷的概率，提高了熒光效率。(5)溶液中溶解氧的存在，由于氧分子的順磁性質(zhì)，使激發(fā)單重態(tài)分子向三重態(tài)的體系間竄躍速率加大，因而會(huì)使熒光效率降低?！舅伎碱}】1、試解釋熒光光度法較吸收光度法靈敏度高的原因？答：原因是由于現(xiàn)代電子技術(shù)具有檢測(cè)十分微弱光信號(hào)的能力，并且熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比，提高激發(fā)光強(qiáng)度也可以增大熒光強(qiáng)度，使測(cè)定的靈敏度提高；而吸收光度法測(cè)定的是吸光度，不管是增大入射光強(qiáng)度，還是提高檢測(cè)器的靈敏度，都會(huì)使透射光信號(hào)與入射光信號(hào)以同樣的比例增大，吸光度值不會(huì)改變，因此靈敏度不能提高。2、維生素B2在pH=6~7時(shí)熒光最強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)為何在酸性溶液中測(cè)定？整理為word格式整理為word格式整理為w