植物組織中可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

植物組織中可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定1.斐林-酚試劑法一、原理斐林（Folin）-酚試劑法結(jié)合了雙縮脲試劑和酚試劑與蛋白質(zhì)的反應(yīng)，其中包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下，與銅試劑作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物；第二步是此絡(luò)合物將磷鉬酸、磷鎢酸試劑還原，生成磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)的深藍(lán)色混合物，顏色深淺與蛋白含量成正相關(guān)。在650nm時(shí)比色測(cè)定的靈敏度比雙縮脲法高100倍。由于肽鍵顯色效果增強(qiáng)，從而減少了因蛋白質(zhì)種類引起的偏差。該法適于微量蛋白的測(cè)定（范圍為5~100μg蛋白質(zhì)）。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料各種植物材料。（二）儀器設(shè)備722分光光度計(jì)，離心機(jī)，恒溫水浴，定量加樣器，冷凝回流裝置一套，研缽，離心管，刻度移液管，微量滴定管、試管等。試劑（1）0.5mol/LNaOH。（2）斐林-酚試劑甲液：由A、B兩種溶液組成：A液：4%碳酸鈉（Na2CO3）溶液與0.2mol/L氫氧化鈉（NaOH）溶液等體積混合；B液：1%硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶液與2%酒石酸鉀鈉溶液等休積混合。使用前將A與B按50：1的比例混合即成，此試劑只能在使用當(dāng)天配制。（3）斐林-酚試劑乙液：稱取鎢酸鈉（Na2-WO4·2H2O）100g，鉬酸鈉（Na2MoO4·2H20）25g，加蒸餾水700mL溶解于1500mL的圓底燒瓶中。之后加入85%的H3PO450mL，濃HCl100mL，安上回流裝置（使用磨口接頭，若用軟木塞或橡皮塞時(shí)，就必須用錫鉑紙包起來），使其慢慢沸騰10h。冷卻后加入硫酸鋰（Li2SO4·H2O）150g，蒸餾水50mL，澳水2~3滴，打開瓶口煮沸15min，以逐出過量的溴，冷卻后溶液呈黃色（若仍呈綠色，須再滴加幾滴溴水，繼續(xù)煮沸15min）。待冷卻后稀釋至1000mL，過濾入棕色瓶中保存。使用時(shí)大約加水1倍，使最終濃度相當(dāng)于1mol/L酸度。因此在使用前應(yīng)進(jìn)行標(biāo)定。標(biāo)定方法：取5ml.福林-酚試劑乙液放入錐形瓶?jī)?nèi)，用1mol/L標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，酚酞作指示劑、當(dāng)溶液突然轉(zhuǎn)紅再轉(zhuǎn)灰綠時(shí)，即為滴定終點(diǎn)。計(jì)算其相當(dāng)?shù)乃岫龋名}酸或氫氧化鈉溶液調(diào)至相當(dāng)于1mol/L的酸度。在測(cè)定時(shí)要注意，因?yàn)榉釉噭﹥H在酸性條件下穩(wěn)定，但此實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)只在pH≠10的情況下發(fā)生，所以當(dāng)加酚試劑時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞前即能發(fā)生還原反應(yīng)，否則會(huì)使顯色程度減弱。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱取25mg牛血清蛋白，溶于100ml.蒸餾水中，使終濃度為250μg/mL。三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（1）取18mm×200mm試管7支，1~7編號(hào)，分別加入0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用蒸餾水補(bǔ)足1mL，使每管含蛋白量分別為0pg/mL、25pg/mL、50g./ml、100gs/mL、150μg/mL、200yg/mL、250μg/mL。（2）用定量加樣器給每支試管中加入5mL甲液、混勻，于30℃下放置10min。（3）再向試管中噴射加入0.5mL乙液，立即振蕩混勻，在30℃下準(zhǔn)確保溫30min。（4）以不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白的1號(hào)管為空白，在650nm下用1cm光徑的比色皿測(cè)定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（二）樣品的測(cè)定樣品的提?。悍Q取鮮樣0.5g，用5ml.蒸餾水或緩沖液研磨成勻漿后，10000r/min離心10min，取上清液1.0mL（視蛋白質(zhì)含量適當(dāng)稀釋）于試管中，然后重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制中的2~4步驟，以空白管調(diào)零，測(cè)定吸光度。根據(jù)吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出樣品中的蛋白質(zhì)含量。四、結(jié)果計(jì)算式中：C為查標(biāo)準(zhǔn)曲線值，μg；V，為提取液總體積，mL；W，為樣品鮮重，g；V、為測(cè)定時(shí)加樣量，mL?！咀⒁馐马?xiàng)】還原物質(zhì)，其他酚類物質(zhì)及檸檬酸對(duì)此反應(yīng)有干擾。Ⅱ.考馬斯亮藍(lán)G-250染色法一、原理考馬斯亮藍(lán)G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。該染料在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中當(dāng)它與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，前者最大光吸收?65nm，后者在595nm。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（1~1000μg），蛋白質(zhì)與色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定?？捡R斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)十分迅速，2min左右即達(dá)到平衡。其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。此法靈敏度高（比斐林-酚法還高4倍），易于操作，干擾物質(zhì)少，是一種比較好的定量法。其缺點(diǎn)是在蛋白質(zhì)含量很高時(shí)線性偏低，且不同來源蛋白質(zhì)與色素結(jié)合狀況有一定差異。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料小麥葉片及其他植物材料。（二）儀器設(shè)備722分光光度計(jì)，研缽，燒杯，量瓶，移液管，具塞刻度試管等。（三）試劑（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：100μg/mL牛血清白蛋白：稱取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸餾水稀釋至100mL即可。（2）考馬斯亮藍(lán)G-250溶液：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50mL90%乙醇中，加入100mL85%（W/V）的磷酸，再用蒸餾水定容到1L，貯于棕色瓶中。常溫下可保存一個(gè)月。三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取6支具塞試管，按表2-29-1加入試劑（0~100μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白）?；旌暇鶆蚝螅蚋鞴苤屑尤?mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，搖勻，并放置5min左右，用1cm光徑比色皿在595nm下比色測(cè)定吸光度。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（二）樣品測(cè)定（1）樣品提取。方法與斐林-酚試劑法相同。（2）吸取樣品提取液1.0mL，放入具塞試管中（每個(gè)樣品重復(fù)2次），加入5ml考馬斯亮藍(lán)G-250溶液、充分混合，放置2min后在595nm下比色，測(cè)定吸光度，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。四、結(jié)果計(jì)算Ⅲ.紫外吸收法一、原理蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、色氨酸等殘基在280nm波長(zhǎng)下具有最大光吸收。由于各種蛋白質(zhì)中都含有酪氨酸，因此280mm的光吸收度是蛋白質(zhì)的一種普遍性質(zhì)。在一定程度下，蛋白質(zhì)溶液在280nm吸光度與其濃度成正比，故可作定量測(cè)定。核酸在紫外區(qū)（260nm）也有吸收，可通過校正加以消除。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料小麥葉片及其他植物材料。（二）儀器設(shè)備紫外分光光度計(jì)，離心機(jī)，刻度移液管。（三）試劑0.1mol/