免疫組化(2)理論課

關(guān)于免疫組化(2)理論課第一頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日免疫組化技術(shù)操作并不困難，雖然染色過(guò)程包括很多步驟，但只要注意一些主要問(wèn)題，就能完成一張質(zhì)量好的免疫組化切片。第二頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日內(nèi)容1.染色前需注意的問(wèn)題2.染色中需注意的問(wèn)題

3.如何進(jìn)行科研設(shè)計(jì)第三頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日免疫組化基本流程以石蠟組織為例sp法：

取材---固定---脫水---透明---浸蠟包埋---切片---烤片---染色開(kāi)始，脫蠟---入水---修復(fù)---阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶---正常羊血清封閉---一抗---二抗---三抗---顯色第四頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日染色前需注意的問(wèn)題第五頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日一、組織和細(xì)胞標(biāo)本類(lèi)型：二、組織取材對(duì)病理組織還應(yīng)做到以下幾點(diǎn)：①

材部位必須是主要病變區(qū)。②必須取病灶與正常組織的交界區(qū)③必要時(shí)取遠(yuǎn)離病灶的正常組織做對(duì)照。第六頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日三、組織固定在免疫組化中首選的固定液是10%中性緩沖福爾馬林液（市售甲醛1：9稀釋?zhuān)榇_保離體組織的抗原性，值得高度重視的是離體組織須馬上固定。組織離體后固定一般不要超過(guò)15分鐘，固定在常溫條件下時(shí)間為8-24小時(shí)，同時(shí)還要注意的是要避免福爾馬林過(guò)度固定造成的組織抗原損失第七頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日

為確保離體組織的抗原性，值得高度重視的是離體組織須馬上固定。組織離體后固定一般不要超過(guò)15分鐘，固定在常溫條件下時(shí)間為8-24小時(shí)，同時(shí)還要注意的是要避免福爾馬林過(guò)度固定造成的組織抗原損失，有研究發(fā)現(xiàn)新鮮組織經(jīng)過(guò)福爾馬林固定一周后組織抗原丟失嚴(yán)重，抗原幾乎不能被檢出。組織同樣不能長(zhǎng)時(shí)間放置在70%的乙醇中。脫鈣液對(duì)抗原破壞較為嚴(yán)重，所以脫鈣液中酸的濃度與脫鈣時(shí)間都必須盡量控制在最低的限度。第八頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日四、組織脫水五、組織透明六、組織浸蠟及包埋六、切片

第九頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日舉例：小動(dòng)物組織脫水、透明和浸蠟時(shí)間

75%乙醇30min，85%乙醇30min，95%乙醇Ⅰ1h，Ⅱ1h，Ⅲ過(guò)夜或2h；無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min；二甲苯Ⅰ15min，Ⅱ10min，Ⅲ10min；石蠟Ⅰ30min，石蠟Ⅱ30min，石蠟Ⅲ1-2h。第十頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日

總之，提高切片質(zhì)量須注意制片過(guò)程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)，特別是組織固定，可以說(shuō)固定是高質(zhì)量制片的基礎(chǔ)，脫水更關(guān)鍵，只有充分的固定組織，才不會(huì)影響整個(gè)脫水、透明、浸蠟以及切片、甚至包括染色的全過(guò)程，才能制作出合格的高質(zhì)量的切片。第十一頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日七、防脫片的制備

防脫玻片的處理各個(gè)實(shí)驗(yàn)室間一般多采用不同的粘附劑如APES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）、HistogripTM或Poly-L-Lysine。目前通用的是Sigma公司的多聚左旋賴(lài)氨酸（Poly-L-lysine）或硅化片，不論是免疫組化還是原位雜交該粘附劑都具有極好的防脫片效果。第十二頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日APES：現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留20-30秒鐘，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結(jié)合的APES，置通風(fēng)櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時(shí)應(yīng)注意組織要一步到位，并盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結(jié)果。第十三頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日

HistogripTM：將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中，停留1-2分鐘，然后用雙蒸水快速清洗三次，室溫干燥或60℃烤箱烘烤一小時(shí)，裝盒備用。

Poly-L-Lysine：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴(lài)氨酸溶液中，浸泡5分鐘，60℃烤箱烘烤1小時(shí)或室溫過(guò)夜干燥。裝盒備用。試驗(yàn)中使用的器具均為非玻璃制品。第十四頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日八、烤片

切片在56-60℃恒溫箱里烤片至少1小時(shí)才不至于脫片，邁新實(shí)驗(yàn)室推薦58-60℃恒溫箱里烤片2小時(shí)。也有的實(shí)驗(yàn)室在58-60℃恒溫箱里過(guò)夜烤片。但高溫烤片對(duì)抗原有破壞，原因是在高溫干燥條件下可以加速組織切片中抗原的氧化。第十五頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日九、切片保存

切片后的組織在室溫下長(zhǎng)期保存抗原可以損失。在實(shí)驗(yàn)中邁新實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)蠟塊切片后，在室溫下保存三個(gè)月以上，免疫組化染色結(jié)果會(huì)出現(xiàn)減弱或陰性情況，尤其核表達(dá)的抗原丟失更多。第十六頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日究其原因可能與空氣中的氧化作用有關(guān)，所以在實(shí)際工作可以采用蠟封切片來(lái)避免抗原損失以便長(zhǎng)期保存，也可4℃冰箱冷藏保存，提醒科研單位在連續(xù)性課題實(shí)驗(yàn)中注意切片的保存。第十七頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日染色中應(yīng)注意的問(wèn)題第十八頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日一、脫蠟和水化

免疫組化的脫蠟步驟與常規(guī)H&E脫蠟步驟相同，免疫組化實(shí)驗(yàn)室中脫蠟需與H&E常規(guī)脫蠟分離，以保證脫蠟徹底，否則可能導(dǎo)致染色結(jié)果的異常。第十九頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日二、抗體選擇第二十頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日

首先確定一抗種屬來(lái)源能否適應(yīng)標(biāo)本來(lái)源（人或動(dòng)物組織），能否適應(yīng)標(biāo)本處理形式（冰凍、石蠟），一抗單克隆抗體（鼠、兔）和多克隆抗體（兔、馬、羊等）及二，三抗的配套連接，不同方法連接方式不同（S-P、二步法等），購(gòu)買(mǎi)商品化抗體應(yīng)盡量購(gòu)買(mǎi)原液，質(zhì)量高，保存時(shí)間長(zhǎng)，而即用型抗體則現(xiàn)買(mǎi)現(xiàn)用，不可長(zhǎng)期保存。第二十一頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日多抗和單抗的比較

均一性，單抗的均一性很強(qiáng)穩(wěn)定性，單抗的穩(wěn)定性較差特異性，單抗的特異性強(qiáng)重復(fù)性，單抗的重復(fù)性好第二十二頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日抗體的稀釋方法直接測(cè)定法從以上結(jié)果分析，可以選擇1:200~1:400之間的濃度

稀釋濃度特異強(qiáng)度背景染色1:50++++++1:100++++++1:200+++++1:400+++﹣第二十三頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日

抗體的最佳稀釋度

由于各種抗體效價(jià)不同，組織中抗原強(qiáng)弱不一，應(yīng)根據(jù)不同情況作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以取得中等陽(yáng)性稀釋度為最佳，因其既適合于抗原性強(qiáng)和含量多的標(biāo)本，也可用于抗原性弱的標(biāo)本。第二十四頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日抗體滴片技術(shù)

所滴的抗體應(yīng)與切片上的組織剛好吻合。滴抗體前需把切片上的水弄干，但不能干片。要領(lǐng)：甩凈組織周?chē)乃？贵w滴片圖示：第二十五頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日三、抗原修復(fù)

第二十六頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日

常規(guī)甲醛固定的石蠟切片標(biāo)本在固定過(guò)程中會(huì)形成醛鍵，導(dǎo)致蛋白交聯(lián)封閉了組織中的部分抗原決定簇，染色前需進(jìn)行處理，打開(kāi)醛鍵暴露抗原，增加細(xì)胞和組織的通透性，以使抗體和抗原最大限度結(jié)合，提高免疫組化檢測(cè)陽(yáng)性率，達(dá)到能真實(shí)反映該組織蛋白表達(dá)水平或抗原含量。抗原修復(fù)有酶消化、微波修復(fù)、高壓處理等。

第二十七頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日1、微波修復(fù)

本實(shí)驗(yàn)室微波修復(fù)應(yīng)用最多，特點(diǎn)是簡(jiǎn)單、有效，主要根據(jù)微波發(fā)射高頻能量，組織經(jīng)微波幅射后，會(huì)加速組織內(nèi)部分子高速運(yùn)動(dòng)，抗原可完全被暴露出來(lái)，用于漿或部分核抗原，膜抗原不用或短時(shí)間應(yīng)用。在0.01MPH6.0檸檬酸緩沖液微波修復(fù)時(shí)，溫度控制在95-100℃之間維持10分鐘，不足或超過(guò)100℃達(dá)不到抗原修復(fù)最佳效果。第二十八頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日第二十九頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日子宮內(nèi)膜PR染色，修復(fù)良好子宮內(nèi)膜PR染色，修復(fù)不足第三十頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日2、酶消化

其作用是以化學(xué)的方式使醛鍵斷裂，暴露抗原決定族，增加細(xì)胞和組織的通透性，以便抗體與抗原最大限度的結(jié)合，增強(qiáng)特異性染色，避免非特異性染色，注意有些抗原顯示必須先行消化，有些不需要反而破壞抗原性，使陽(yáng)性率下降，須消化的組織或細(xì)胞抗原，也要視抗原在切片中的封閉程度而定。對(duì)某些組織抗原經(jīng)一種酶消化后，可能結(jié)果仍不理想，此時(shí)可采用雙消化法，消化的時(shí)間與固定的時(shí)間成反比。第三十一頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日胰蛋白酶，用于胞漿抗原，此酶較溫和，濃度及消化時(shí)間易控制，常用0.05%~0.1%,PH7.8,37℃消化20~30′或更長(zhǎng)，微波37℃可短時(shí)消化。胃蛋白酶，用于間質(zhì)抗原，常用0.2%PH2.5左右，消化20~30′或更長(zhǎng)，消化后切片應(yīng)充分洗滌，否則對(duì)組織中抗原會(huì)進(jìn)行緩慢消化，破壞組織結(jié)構(gòu)第三十二頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日第三十三頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日3、高壓處理家用壓力鍋，大小尺寸根據(jù)需要而定，1000W電爐，多用于核抗原修復(fù)，針對(duì)微波修復(fù)多陰性，進(jìn)行高壓處理為陽(yáng)性，如p27、p21WAP1、PR、Ki67效果好。將1500ml~3000ml的檸檬酸鹽緩沖液（工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內(nèi)，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當(dāng)壓力鍋開(kāi)始慢慢噴氣時(shí)（約加熱5~6分鐘后），計(jì)時(shí)1~2分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開(kāi)鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘×3，下接免疫組化染色步驟。第三十四頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日

加熱處理后免疫組化的染色敏感度大幅度地提高，其機(jī)理推測(cè)可能是加熱打開(kāi)了組織抗原因福爾馬林固定所引起的抗原決定簇的交聯(lián)，但機(jī)理目前仍然還不是十分清楚。第三十五頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日第三十六頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日4.抗原修復(fù)液的選擇

加熱抗原修復(fù)緩沖液有多種，如檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）,Tris(pH7-8),EDTA(pH8.0)等,目前首選檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0），優(yōu)點(diǎn)是染色背景清晰，適合于大多數(shù)抗體,Tris和EDTA兩種修復(fù)液對(duì)部分抗原修復(fù)效果較強(qiáng)，但其染色背景同時(shí)加深，如使用不當(dāng)易造成假陽(yáng)性結(jié)果的判斷。第三十七頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日值得注意的是沒(méi)有一種抗原修復(fù)液能適合于所有的抗體，檸檬酸緩沖液（pH6.0）可作為免疫組化常規(guī)使用的抗原修復(fù)緩沖液，但也不能除外某些抗體適用于EDTA和Tris緩沖修復(fù)液，一般抗原比較難于表達(dá)的抗體多選擇EDTA和Tris緩沖修復(fù)液。第三十八頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日四、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的滅活

若采用過(guò)氧化物酶的檢測(cè)系統(tǒng)，必須進(jìn)行內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的封閉處理。因壞死組織、中性粒細(xì)胞及紅細(xì)胞等均存在豐富的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，其活性穩(wěn)定、強(qiáng)，能與過(guò)氧化氫反應(yīng)，可使二氨基聯(lián)苯胺（DAB）還原產(chǎn)生棕色反應(yīng)物與免疫HRP標(biāo)記特異性染色相同，稱(chēng)之為假陽(yáng)性。故應(yīng)在染色前將內(nèi)源酶封閉、消除，常用3%H2O2，濃度適中，過(guò)低達(dá)不到阻斷作用，過(guò)高破壞細(xì)胞表面抗原，時(shí)間控制在10~15分鐘。

第三十九頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日蛻膜組織部分胞核PR陽(yáng)性，血管內(nèi)紅細(xì)胞過(guò)氧化物酶顯色第四十頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日壞死組織著色第四十一頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日內(nèi)源性生物素—腎小管

第四十二頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日IgG交叉反應(yīng)常引起非特異性背景著色，因不同種系動(dòng)物分子結(jié)構(gòu)相似，抗一種動(dòng)物IgG可與另一種動(dòng)物IgG交叉反應(yīng)，如：二抗羊抗鼠或羊抗兔血清可與人組織切片上人IgG結(jié)合，呈假陽(yáng)性，用二抗同種動(dòng)物正常血清封閉某些非特異性結(jié)合位點(diǎn)，（正常血清可提供白蛋白，與組織內(nèi)非特異蛋白結(jié)合，含天然抗體中IgG的FC段與待檢標(biāo)本FC段結(jié)合），一般用10%正常血清封閉組織10~15分鐘。五、正常血清封閉

第四十三頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日抗體與內(nèi)源性Ig交叉反應(yīng)：第四十四頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日

六、免疫組化技術(shù)掌握共同條件

1免疫組化染色中PH值和離子濃度對(duì)最終結(jié)果有影響，磷酸緩沖液（PBS）PH值中性及弱堿性條件(PH7.8)及低離子強(qiáng)度0.01-0.02M，有利于免疫復(fù)合物形成，而酸性條件及高離子強(qiáng)度有利于分解。通常采用0.01MPH7.2-7.4緩沖液作為反應(yīng)環(huán)境洗滌液。

第四十五頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日2.PBS洗滌技術(shù)（1）洗滌的目的①保證離子濃度和PH值。②減少非特異反應(yīng)（抗體不可靠很純）（2）方法：洗三次，每次5分鐘。第四十六頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日3、抗體最佳孵育溫度及時(shí)間（一抗孵育）濕盒孵育，以防抗體的蒸發(fā)和干片。室溫25℃或37℃孵育45~1h或更長(zhǎng)時(shí)間或轉(zhuǎn)4℃過(guò)夜。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇合適稀釋度，孵育時(shí)間與其成正比。孵育時(shí)避免干燥，否則會(huì)使抗體活性減低或消失。第四十七頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日

胞漿著色一抗過(guò)濃或交叉反應(yīng)：p63（乳腺）第四十八頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日七、正確設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)照

第四十九頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日免疫組化染色結(jié)果分析的質(zhì)量取決于正確使用各種對(duì)照，進(jìn)行常規(guī)免疫組化鑒別診斷需設(shè)陰性（空白）、陽(yáng)性、自身、Vimentin陽(yáng)性對(duì)照。

1陰性對(duì)照

不含靶抗原的組織切片與待檢切片進(jìn)行同樣處理，結(jié)果應(yīng)呈陰性。用PBS替代第一抗體，即空白對(duì)照。第五十頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日2陽(yáng)性對(duì)照

用已證實(shí)含有靶抗原組織切片與待檢標(biāo)本進(jìn)行同樣處理進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性，陽(yáng)性對(duì)照達(dá)到目的有兩點(diǎn)：

(1)預(yù)期得到陰性結(jié)果，必須有陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)腫瘤鑒別診斷較為重要，當(dāng)病理形態(tài)診斷與免疫組化結(jié)果相反時(shí)，需用類(lèi)似腫瘤標(biāo)本（已知陽(yáng)性片）作陽(yáng)性對(duì)照。

(2)證明染色技術(shù)可靠性，即陰性可靠性，它不是由于標(biāo)本處理使細(xì)胞內(nèi)抗原喪失，方法錯(cuò)誤、技術(shù)不熟練造成假陰性。第五十一頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日陽(yáng)性對(duì)照的標(biāo)本

1、多組織切片

2、“臘腸”“春卷”切片

3、組織芯片

4、闌尾2mm第五十二頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日第五十三頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日3自身對(duì)照

根據(jù)組織內(nèi)有不同細(xì)胞，抗原成分復(fù)雜特點(diǎn)，抗體只作用于一種細(xì)胞或某種抗原，陰性部位可作為陽(yáng)性自身對(duì)照，應(yīng)陽(yáng)性部位可作被檢部位陽(yáng)性對(duì)照，如區(qū)別血管源性和非血管源性腫瘤，用第八因子相關(guān)抗原檢測(cè)，血管可作陽(yáng)性對(duì)照，正常上皮可作檢測(cè)角蛋白自身對(duì)照。此對(duì)照用途廣，要在結(jié)果陽(yáng)性、陰性分明，背景清晰情況下才能作自身對(duì)照。第五十四頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日舉例：Vimentin陽(yáng)性對(duì)照

Vimentin在免疫組化中作為陽(yáng)性對(duì)照是由Battifora提出，他提出在每次實(shí)驗(yàn)中增加Vimentin染色作為對(duì)照，目的是觀察組織經(jīng)福爾馬林固定后預(yù)期抗原表達(dá)的敏感性，按福爾馬林固定后抗原損傷的程度來(lái)進(jìn)行分析。第五十五頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日Vimentin幾乎在任何組織中都有表達(dá)，尤其優(yōu)選于活檢組織中的免疫組化染色觀察。在與上皮組織相連接的間質(zhì)中存在著大量的血管Vimentin可陽(yáng)性表達(dá)，如果在同一張切片的間質(zhì)中出現(xiàn)Vimentin染色微弱或部分區(qū)域變?nèi)醯那闆r，表明是過(guò)度固定導(dǎo)致抗原破壞。所以在每批次實(shí)驗(yàn)中應(yīng)常規(guī)加入Vimentin染色，用于指導(dǎo)觀察福爾馬林固定后抗原表達(dá)敏感性情況。第五十六頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日第五十七頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日Vimentin染色結(jié)果第五十八頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日八、IHC結(jié)果的呈現(xiàn)方式常用的顯色體系為辣根過(guò)氧化物酶（Horseradishperoxidase，HRP）、堿性磷酸酶（Alkalinephasphotase,AP）和葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase,GOD）。常用顯色劑有AEC－磚紅色

NBT/BCIP－藍(lán)紫色

DAB－棕黃色或棕褐色

第五十九頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日

HRP的特點(diǎn)是：（1）酶催化的底物H2O2是特異的，所形成的產(chǎn)物易于觀察；（2）反應(yīng)過(guò)程和沉淀物是穩(wěn)定的。其余反應(yīng)是非特異的，可用各種電子供體介導(dǎo)，所以選用不同的電子供體可使終產(chǎn)物呈現(xiàn)不同的顏色，如AEC、DAB。第六十頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日DAB顯色原理DABdiaminobenzidine二氨基聯(lián)苯胺

氧化聚合吲哚胺多聚體

氧化環(huán)化苯乙肼聚合體第六十一頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日DAB顯色的優(yōu)點(diǎn)：背景清晰，陽(yáng)性物鮮艷易辨；切片可脫水透明故適合于照相及半永久保存。缺點(diǎn)：容易氧化，需新鮮配置；有一定的致癌性，注意防護(hù)。第六十二頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日AEC顯色的優(yōu)缺點(diǎn)AEC（3-amino-9-ethyl-carbazole）即為3-氨基-9-乙基咔唑優(yōu)點(diǎn)：室溫下較穩(wěn)定，較安全缺點(diǎn)：不能進(jìn)行脫水等處理，且時(shí)間長(zhǎng)易褪色，不宜照相。第六十三頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日NBT/BCIP染色NBT（硝基藍(lán)四氮唑）＋BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽）是AP的最佳底物組合之一，顯色反應(yīng)產(chǎn)物為藍(lán)紫色。ASO-AP+BCIPPH=9.5BCI-OH+Pi

BCI-OH+NBT

藍(lán)紫色

ASO

等位基因特異的寡核苷酸第六十四頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化照片CK10CD44v6ER第六十五頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日

應(yīng)用免疫組化進(jìn)行科研設(shè)計(jì)第六十六頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日1、采用新抗體，這是最簡(jiǎn)單的方法

2、舊抗體新用途

3、采用新方法（如量子點(diǎn)免疫熒光技術(shù)）

4、同時(shí)應(yīng)用多種抗體進(jìn)行普通免疫染色或雙重免疫染色研究?jī)煞N或兩種以上的抗原協(xié)同表達(dá)，只要選用合理，也會(huì)獲得新發(fā)現(xiàn)。第六十七頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日思考題

以檢測(cè)肝細(xì)胞癌組織某一蛋白的表達(dá)為例，說(shuō)說(shuō)怎樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)且實(shí)驗(yàn)結(jié)果理想？第六十八頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日雙重和多重標(biāo)記染色的意義在同一組織或細(xì)胞切片上，同時(shí)或先后顯示兩種或兩種以上的抗原成分或其它物質(zhì)，即為雙重或多重標(biāo)記。采取該方法能同時(shí)觀察不同抗原或分泌其它物質(zhì)的各類(lèi)細(xì)胞、組織之間的相互關(guān)系，以及抗原物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝的途徑，把形態(tài)和功能研究更好地結(jié)合起來(lái)。第六十九頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日免疫組化的雙重染色技術(shù)可用于顯示某組織中的兩種不同的抗原采用經(jīng)親和層析純化并生物素化的二抗與鏈霉菌素－卵白素－過(guò)氧化物酶和鏈霉菌素－卵白素－堿性磷酸酶交聯(lián)，其敏感性和特異性均較高。采用兩種不同的底物/色素/酶系統(tǒng)包括BCIP/NBT堿性磷酸酶和AEC/過(guò)氧化物酶，前者顯色為紫黑色，后者為深紅色。采用兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的量子點(diǎn)如QD605、QD545，前者顯色為橙紅色，后者為深綠色第七十頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日第七十一頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日注意事項(xiàng)選擇雙重染色的一抗時(shí)，應(yīng)避免兩種一抗的定位（胞核、胞漿、胞膜）重復(fù)。選擇的兩種抗體的抗原修復(fù)的方法（高壓、微波修復(fù)抗原或酶消化等）應(yīng)盡量相同。在進(jìn)行雙重染色之前，必須首先對(duì)所選擇的一抗分別進(jìn)行單獨(dú)染色的預(yù)實(shí)驗(yàn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)的操作條件必須與雙染時(shí)的實(shí)驗(yàn)條件相同。觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，抗體定位正確后，再進(jìn)行雙染實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前要脫蠟徹底，實(shí)驗(yàn)中要沖洗充分，嚴(yán)格控制操作步驟，盡量避免非特異性背景著色。第七十二頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日一、檢測(cè)PCNA抗原的表達(dá)可用免疫組織化學(xué)方法如S-P法檢測(cè)大腸癌組織中的抗原表達(dá)

以檢測(cè)人大腸癌組織中PCNA抗原和酸性粘液為例第七十三頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日二、AB染色檢測(cè)粘液的性質(zhì)在動(dòng)物體和人體中的各種腺體及許多器官組織都能制造或分泌粘液物質(zhì)，由于物質(zhì)中含酸基的不同,而又分為中性粘液物質(zhì)(neutralmucosubs