毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用課件

毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用1電泳

在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實(shí)現(xiàn)分離。

1808年，Reuss（俄國）首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。1937年，Tiselius（瑞典）用于人血清蛋白質(zhì)混合液的分離：

發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定；第一次的自由溶液電泳；第一臺電泳儀；1948年，獲諾貝爾化學(xué)獎；電泳在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在2經(jīng)典電泳

利用電泳現(xiàn)象對某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。

按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳；按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳；傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。1981年，Jorgenson和Luckas，用75μm內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析，柱效高達(dá)40萬/m，促進(jìn)電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)——毛細(xì)管電泳。經(jīng)典電泳利用電泳現(xiàn)象對某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析3毛細(xì)管電泳（CapillaryElectrophoresis,CE）高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)：采用了25-100μm內(nèi)徑的毛細(xì)管；采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。毛細(xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場電壓可以很高。電壓升高，電場推動力大，又可進(jìn)一步使柱徑變小，柱長增加，毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于HPLC，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬。毛細(xì)管電泳（CapillaryElectrophoresi4分離過程

電場作用下，毛細(xì)管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。

帶電粒子的遷移速度=電泳+電滲流；兩種速度的矢量和。

陽離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動方向一致，在負(fù)極最先流出；

中性粒子無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；

陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動方向相反。ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負(fù)極最后流出除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場力大小不一樣也同時被相互分離。分離過程電場作用下，毛細(xì)管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。5毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)1.儀器簡單、易自動化電源、毛細(xì)管、檢測器、溶液瓶2.分析速度快、分離效率高

在3.1min內(nèi)分離36種無機(jī)及有機(jī)陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種陽離子；3.操作方便、消耗少

進(jìn)樣量極少，水介質(zhì)中進(jìn)行；4.應(yīng)用范圍極廣有機(jī)物、無機(jī)物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、環(huán)境保護(hù)、材料等；

毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)1.儀器簡單、易自動化6一、CE基本原理二、電滲現(xiàn)象與電滲流electroosmoticflow三、影響電滲流的因素四、淌度mobility五、CE中的參數(shù)與關(guān)系式六、影響分離效率的因素毛細(xì)管電泳理論基礎(chǔ)一、CE基本原理毛細(xì)管電泳理論基礎(chǔ)7毛細(xì)管電泳(CE)基本原理

電泳是指帶電離子在電場中的定向移動，不同離子具有不同的遷移速度，遷移速度與哪些因素有關(guān)？當(dāng)帶電離子以速度ν在電場中移動時，受到大小相等、方向相反的電場推動力和平動摩擦阻力的作用。電場力：FE=qE

阻力：F=fν故：qE=fνq—離子所帶的有效電荷；E—電場強(qiáng)度；ν—離子在電場中的遷移速度；f—平動摩擦系數(shù)(對于球形離子：f=6πηγ；γ—離子的表觀液態(tài)動力學(xué)半徑；η—介質(zhì)的粘度；)毛細(xì)管電泳(CE)基本原理

電泳是指帶電離子在電場中8所以，遷移速度：（球形離子）

物質(zhì)離子在電場中差速遷移是電泳分離的基礎(chǔ)。淌度μ

：單位電場強(qiáng)度下的平均電泳速度。

q—離子所帶的有效電荷；E—電場強(qiáng)度；γ—離子的表觀液態(tài)動力學(xué)半徑η—介質(zhì)的粘度；所以，遷移速度：（球形離子）物質(zhì)離子在電場中9電滲現(xiàn)象與電滲流

electroosmosisandelectroosmoticflow1.電滲流現(xiàn)象

當(dāng)固體與液體接觸時，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差。

當(dāng)液體兩端施加電壓時，就會發(fā)生液體相對于固體表面的移動，這種液體相對于固體表面的移動的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。

電滲現(xiàn)象中整體移動著的液體叫電滲流（electroosmoticflow，簡稱EOF）。

電滲現(xiàn)象與電滲流

electroosmosisande102.HPCE中的電滲現(xiàn)象與電滲流

石英毛細(xì)管柱，內(nèi)充液pH>3時，表面電離成-SiO-,管內(nèi)壁帶負(fù)電荷，形成雙電層。

在高電場的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴(kuò)散層向陰極移動，由于這些陽離子實(shí)際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動，速度ν電滲流。2.HPCE中的電滲現(xiàn)象與電滲流石英毛細(xì)管柱，內(nèi)充113.CE中電滲流的大小與方向

電滲流的大小用電滲流速度ν電滲流表示，取決于電滲淌度μ和電場強(qiáng)度E。即

ν電滲流=μE電滲淌度取決于電泳介質(zhì)及雙電層的Zeta電勢，即

μ=ε0εξε0—真空介電常數(shù)；ε—介電常數(shù)；ξ—毛細(xì)管壁的Zeta電勢。

ν電滲流=ε0εξ

E實(shí)際電泳分析，可在實(shí)驗(yàn)測定相應(yīng)參數(shù)后，按下式計(jì)算

ν電滲流=Lef/teoLef—毛細(xì)管有效長度；teo—電滲流標(biāo)記物（中性物質(zhì)）的遷移時間。3.CE中電滲流的大小與方向電滲流的大小用電滲流速度12CE中電滲流的方向

電滲流的方向取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)：內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向負(fù)極；內(nèi)表面帶正負(fù)電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向正極；石英毛細(xì)管；帶負(fù)電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向的方法：

（1）毛細(xì)管改性表面鍵合陽離子基團(tuán)；

（2）加電滲流反轉(zhuǎn)劑內(nèi)充液中加入大量的陽離子表面活性劑，將使石英毛細(xì)管壁帶正電荷，溶液表面帶負(fù)電荷。電滲流流向正極。CE中電滲流的方向電滲流的方向取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的134.CE中電滲流的流形

電荷均勻分布，整體移動，電滲流的流動為平流，塞式流動（譜帶展寬很?。?；液相色譜中的溶液流動為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。4.CE中電滲流的流形電荷均勻分布，整體移動，電滲流145.CE中電滲流的作用

電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5～7倍；

各種電性離子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為：

ν+=ν電滲流+ν+ef陽離子運(yùn)動方向與電滲流一致；ν-=ν電滲流-ν-ef陰離子運(yùn)動方向與電滲流相反；ν0=ν電滲流中性粒子運(yùn)動方向與電滲流一致；（1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離；（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中的流速；（3）電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性；在CE中，控制電滲流非常重要。5.CE中電滲流的作用電滲流的速度約等于一般離子電泳15CE中影響電滲流的因素1.電場強(qiáng)度的影響

電滲流速度和電場強(qiáng)度成正比，當(dāng)毛細(xì)管長度一定時，電滲流速度正比于工作電壓。2.毛細(xì)管材料的影響

不同材料毛細(xì)管的表面電荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大小不同；CE中影響電滲流的因素1.電場強(qiáng)度的影響2.毛細(xì)管材料163.電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響（1）溶液pH的影響對于石英毛細(xì)管，溶液pH增高時，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢增大，電滲流增大，pH=7，達(dá)到最大；pH<3，完全被氫離子中和，表面電中性，電滲流為零。分析時，采用緩沖溶液來保持pH穩(wěn)定。（2）陰離子的影響在其他條件相同，濃度相同而陰離子不同時，毛細(xì)管中的電流有較大差別，產(chǎn)生的焦耳熱不同。緩沖溶液離子強(qiáng)度，影響雙電層的厚度、溶液黏度和工作電流，明顯影響電滲流大小。緩沖溶液離子強(qiáng)度增加，電滲流下降。3.電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響（1）溶液pH的影響17毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用課件184.溫度的影響毛細(xì)管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。溫度變化來自于“焦耳熱”；

焦耳熱：毛細(xì)管溶液中有電流通過時，產(chǎn)生的熱量；CE中的焦耳熱與背景電解質(zhì)的摩爾電導(dǎo)、濃度及電場強(qiáng)度成正比。溫度每變化1，將引起背景電解質(zhì)溶液黏度變化2%～3%；4.溫度的影響毛細(xì)管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降195.添加劑的影響（1）加入濃度較大的中性鹽，如K2SO4，溶液離子強(qiáng)度增大，使溶液的黏度增大，電滲流減小。（2）加入有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，使電滲流增大。

（3）加入表面活性劑，可改變電滲流的大小和方向；加入陰離子表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS），可以使壁表面負(fù)電荷增加，zeta電勢增大，電滲流增大；加入不同陽離子表面活性劑來控制電滲流。5.添加劑的影響（1）加入濃度較大的中性鹽，如K2SO4，20淌度Mobility

淌度：帶電離子在單位電場下的遷移速度；

淌度不同是電泳分離的基礎(chǔ)。1.絕對淌度(absolutemobility)μab無限稀釋溶液中帶電離子在單位電場強(qiáng)度下的平均遷移速度，簡稱淌度?？稍谑謨灾胁殚啞?.有效淌度(effectivemobility)μef實(shí)際溶液中的淌度(實(shí)驗(yàn)中測定的)。μef=∑aiμi

ai—溶質(zhì)i的解離度；μi—溶質(zhì)i在解離狀態(tài)下的絕對淌度淌度Mobility淌度：帶電離子在單位電場下21CE中的參數(shù)與關(guān)系式

1.遷移時間（保留時間）

CE兼具有電化學(xué)的特性和色譜分析的特性。有關(guān)色譜理論也適用。V—外加電壓；L—毛細(xì)管總長度；2.分離效率（塔板數(shù)）

在CE中，僅存在縱向擴(kuò)散，σ2=2Dt

擴(kuò)散系數(shù)小的溶質(zhì)比擴(kuò)散系數(shù)大的分離效率高，分離生物大分子的依據(jù)。CE中的參數(shù)與關(guān)系式1.遷移時間（保留時間）V—外加223.分離度

影響分離度的主要因素；工作電壓V；毛細(xì)管有效長度與總長度比；有效淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計(jì)算：3.分離度影響分離度的主要因素；工作電壓V；毛細(xì)23影響分離效率的因素—區(qū)帶展寬1.縱向擴(kuò)散的影響

在HPCE中，縱向擴(kuò)散引起的峰展寬：σ2=2Dt由擴(kuò)散系數(shù)和遷移時間決定。大分子的擴(kuò)散系數(shù)小，可獲得更高的分離效率，大分子生物試樣分離的依據(jù)。2.進(jìn)樣的影響

當(dāng)進(jìn)樣塞長度太大時，引起的峰展寬大于縱向擴(kuò)散。分離效率明顯下降；理想情況下，進(jìn)樣塞長度：

Winj=(24Dt)1/2實(shí)際操作時進(jìn)樣塞長度小于或等于毛細(xì)管總長度的1%～2%。影響分離效率的因素—區(qū)帶展寬1.縱向擴(kuò)散的影響243.焦耳熱與溫度梯度的影響

電泳過程產(chǎn)生的焦耳熱可由下式計(jì)算：m—電解質(zhì)溶液的摩爾電導(dǎo)；I—工作電流：cm—電解質(zhì)濃度；

散熱過程中，在毛細(xì)管內(nèi)形成溫度梯度（中心溫度高），破壞了塞流，導(dǎo)致區(qū)帶展寬。改善方法：（1）減小毛細(xì)管內(nèi)徑；（2）控制散熱；3.焦耳熱與溫度梯度的影響電泳過程產(chǎn)生的焦耳熱可由254.溶質(zhì)與管壁間的相互作用

存在吸附與疏水作用，造成譜帶展寬；蛋白質(zhì)、多肽帶電荷數(shù)多，有較多的疏水基，吸附問題特別嚴(yán)重，是目前分離分析該類物質(zhì)的一大難題。細(xì)內(nèi)徑毛細(xì)管柱，一方面有利于散熱，另一方面比表面積大，又增加了溶質(zhì)吸附的機(jī)會。減小吸附的方法和途徑：加入兩性離子代替強(qiáng)電解質(zhì)，兩性離子一端帶正電，另一端帶負(fù)電，帶正電一端與管壁負(fù)電中心作用，濃度約為溶質(zhì)的100-1000倍時，抑制對蛋白質(zhì)吸附，又不增加溶液電導(dǎo)，對電滲流影響不大。4.溶質(zhì)與管壁間的相互作用存在吸附與疏水作用，造成265.其他影響因素

（1）電分散作用對譜帶展寬的影響當(dāng)溶質(zhì)區(qū)帶與緩沖溶液區(qū)帶的電導(dǎo)不同時，也造成譜帶展寬；盡量選擇與試樣淌度相匹配的背景電解質(zhì)溶液。（2）“層流”現(xiàn)象對譜帶展寬的影響一般情況下，CE中不存在層流，但當(dāng)毛細(xì)管兩端存在壓力差時，出現(xiàn)拋物線形的層流；

產(chǎn)生的原因：毛細(xì)管兩端液面高度不同。實(shí)際操作時，保持毛細(xì)管兩端緩沖溶液平面高度相同。5.其他影響因素（1）電分散作用對譜帶展寬的影響27一、高效毛細(xì)管電泳儀二、流程與主要部件三、進(jìn)樣方式四、檢測器毛細(xì)管電泳儀一、高效毛細(xì)管電泳儀毛細(xì)管電泳儀28毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用課件29儀器流程與主要部件

電壓：0～30kV；分離柱不涂敷任何固定液；紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測器；（可檢測到：10-19～10-21mol/L）儀器流程與主要部件電壓：0～30kV；301.高壓電源（1）0～30kV穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；（2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出；（3）電場強(qiáng)度程序控制系統(tǒng)；（4）電壓穩(wěn)定性：0.1%；（5）電源極性易轉(zhuǎn)換；2.毛細(xì)管柱

（1）材料：石英：各項(xiàng)性能好；玻璃：光學(xué)、機(jī)械性能差；（2）規(guī)格：內(nèi)徑20～75μm，外徑350～400μm；長度<=1m1.高壓電源（1）0～30kV穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；313.緩沖液池

化學(xué)惰性，機(jī)械穩(wěn)定性好；4.檢測器

要求：具有極高靈敏度，可柱端檢測；檢測器、數(shù)據(jù)采集與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理一體化；

類型檢測限/mol特點(diǎn)紫外-可見10-13～10-15加二極管陣列，光譜信息熒光10-15～10-17靈敏度高，樣品需衍生激光誘導(dǎo)熒光10-18～10-20靈敏度極高，樣品需衍生電導(dǎo)10-18～10-19離子靈敏，需專用的裝置；3.緩沖液池化學(xué)惰性，機(jī)械穩(wěn)定性好；類型32CE具體操作步驟：毛細(xì)管電泳的基本步驟包括清洗毛細(xì)管、更換電泳緩沖液、進(jìn)樣、電泳并同時在線檢測。1).清洗毛細(xì)管對于一根新的或久未使用的毛細(xì)管，需用1mol/L的NaOH溶液、0.1mol/LNaOH溶液、超純水依次清洗。在有些情況下還需用0.1mol/LHCl、甲醇或去垢劑清洗,強(qiáng)堿溶液可以清除吸附在毛細(xì)管內(nèi)壁的油脂、蛋白質(zhì)等，強(qiáng)酸溶液可以清除一些金屬或金屬離子，甲醇、去垢劑可去除疏水性強(qiáng)的雜質(zhì)。CE具體操作步驟：33

在進(jìn)行每次分析前可用相當(dāng)于毛細(xì)管總體積2~3倍的0.1mol/L的NaOH溶液清洗一遍，一般為2~3min，而后注入電泳緩沖液，以保證分析結(jié)果的重復(fù)性。在進(jìn)行每次分析前可用相當(dāng)于毛細(xì)管總體積2~3倍的34

2).更替電泳緩沖液在進(jìn)行每次分析前可用相當(dāng)于毛細(xì)管總體積2~3倍的0.1mol/L的NaOH溶液清洗一遍，一般為2~3min，而后注入電泳緩沖液，以保證分析結(jié)果的重復(fù)性。上一步清洗過程結(jié)束后，毛細(xì)管和電極從清洗液中移至電泳緩沖液，不可避免地將強(qiáng)堿或強(qiáng)酸等溶液帶至其中。緩沖液本身也會因揮發(fā)、電泳等而改變其離子強(qiáng)度。因此對于精確分析，每分析五次后需更換一次樣品盤中的緩沖液。一般分析，半天更換一次即可。2).更替電泳緩沖液353）毛細(xì)管電泳的進(jìn)樣方式

進(jìn)樣量：毛細(xì)管長度的1%-2%；nL級、非常??；1.流體力學(xué)進(jìn)樣方式

（1）進(jìn)樣端加壓（2）出口端抽真空（3）虹吸進(jìn)樣3）毛細(xì)管電泳的進(jìn)樣方式

進(jìn)樣量：毛細(xì)管長度的1%-36

毛細(xì)管一端插入樣品瓶，加電壓；2.電動進(jìn)樣方式

進(jìn)樣不均：電歧視現(xiàn)象，淌度大的離子比淌度小的進(jìn)樣量大；離子丟失：淌度大且與電滲流方向相反的離子可能進(jìn)不去；

特別適合黏度大的試樣；3.擴(kuò)散進(jìn)樣試樣通過擴(kuò)散作用進(jìn)入分離柱端口處。毛細(xì)管一端插入樣品瓶，加電壓；2.電動進(jìn)樣方式37Buffer:50mMphosphate–TEA(pH2.5)with4.0%HP-β-CD(w/v)and50%methanol;Appliedpotential:30kV;Sample:1mg/Lpropranololdissolvedin(A)(B)water,(C)methanol;(A)Pressureinjection0.5psi.,5s,(B)(C)electrokineticinjection10kV,5s.

CABEffectofinjectionmodeBuffer:50mMphosphate–TEA(38(A)ConditioningofthecapillarywithalowpHbuffercontainingCTAB,andinjectionofalongwaterplugintothecapillarybypressure;(B)Field-amplifiedinjectionofcationsandstackingontheboundaryofwaterplugandtheBGS,whileremovingofthewaterplugoutofthecapillary;(C)Separationvoltageisapplied.TheenantiomerscomplexwithCDandareseparated,andtherestofwaterplugisremoved.SchematicdiagramstheFAEP(A)Conditioningofthecap39分離模式八種分離類型，介紹常用的幾種；根據(jù)試樣性質(zhì)不同，采用不同的分離類型；每種機(jī)理的選擇性不同；分離模式八種分離類型，介紹常用的幾種；40一、毛細(xì)管區(qū)帶電泳

capillaryzoneelectrophoresis，CZE

帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流速度的矢量和。

正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動方向一致，在負(fù)極最先流出；中性粒子：無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；

陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動方向相反；ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負(fù)極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,同種類離子由于差速遷移被相互分離。

最基本、應(yīng)用廣的分離模式；一、毛細(xì)管區(qū)帶電泳

capillaryzoneelect41二、毛細(xì)管凝膠電泳

capillarygelelectrophoresis，CGE將聚丙烯酰胺等在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖銳，分離效率高。蛋白質(zhì)、DNA等的電荷/質(zhì)量比與分子大小無關(guān)，CZE模式很難分離，采用CGE能獲得良好分離，DAN排序的重要手段。特點(diǎn)：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。無膠篩分技術(shù)：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。二、毛細(xì)管凝膠電泳

capillarygelelect42

1.緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達(dá)到臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。三、膠束電動毛細(xì)管色譜（MEKC）

Micellarelectrokineticcapillarychromatography，MEKC

在電場力的作用下，膠束在柱中移動。1.緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達(dá)到臨界濃43

2.電泳流和電滲流的方向相反，且ν電滲流>ν電泳，負(fù)電膠束以較慢的速度向負(fù)極移動；

5.色譜與電泳分離模式的結(jié)合。3.中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強(qiáng)的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時間長；4.可用來分離中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍；2.電泳流和電滲流的方向相反，且ν電滲流>ν44

1.根據(jù)等電點(diǎn)差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)；2.毛細(xì)管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合成的具有不同等電點(diǎn)范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當(dāng)施加直流電壓（6～8V）時，管內(nèi)將建立一個由陽極到陰極逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關(guān)，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負(fù)電荷。在其等電點(diǎn)時，呈電中性，淌度為零；四、毛細(xì)管等電聚焦

Capillaryisoelectricfocusing，CIEF1.根據(jù)等電點(diǎn)差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)45

4.聚焦：具有不同等電點(diǎn)的生物試樣在電場力的作用下遷移，分別到達(dá)滿足其等電點(diǎn)pH的位置時，呈電中性，停止移動，形成窄溶質(zhì)帶而相互分離；

5.陽極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀NaOH溶液；6.加壓將毛細(xì)管內(nèi)分離后的溶液推出經(jīng)過檢測器檢測；7.電滲流在CIEF中不利，應(yīng)消除或減小。4.聚焦：具有不同等電點(diǎn)的生物試樣在電場力的作用下遷移46

1.將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導(dǎo)離子(充滿毛細(xì)管)和尾隨離子，試樣離子的淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動。2.負(fù)離子分析時，前導(dǎo)電解質(zhì)的淌度大于試樣中所有負(fù)離子的。所有試樣都按前導(dǎo)離子的速度等速向陽極前進(jìn)，逐漸形成各自獨(dú)立的區(qū)帶而分離。陰極進(jìn)樣，陽極檢測。五、毛細(xì)管等速電泳

Capillaryisotachophoresis，CITP1.將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導(dǎo)離子(充滿毛47

3.不同離子的淌度不同，所形成區(qū)帶的電場強(qiáng)度不同(ν=μE)，淌度大的離子區(qū)帶電場強(qiáng)度?。谎爻隹诘竭M(jìn)口，將不同區(qū)帶依次排序1、2、3、4電場強(qiáng)度依次增大。假設(shè)“2”號中離子擴(kuò)散到“3”號，該區(qū)電場強(qiáng)度大，離子被加速，返回到“2”區(qū)；當(dāng)“2”號中離子跑到“1”號區(qū)，離子被減速使之歸隊(duì)；4.特點(diǎn)：界面明顯，富集、濃縮作用；capillaryisotachophoresis，CITP3.不同離子的淌度不同，所形成區(qū)帶的電場強(qiáng)度不同(ν=48

在毛細(xì)管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定液，以“電滲泵”取代機(jī)械泵，試樣組分在兩相間的分配為分離機(jī)理的電動色譜過程。六、毛細(xì)管電動色譜

Capillaryelectrokineticchromatography，CEC在毛細(xì)管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定液，以“電滲49七、毛細(xì)管微乳電動色譜

(Microemulsionelectrokineticchromatography,

MEEKC)

Watern-OctaneSO3-SO3-

OH

OHOHOH

OHNa+Na+WaterNa+SO3-WaterButan-1-olSDSSodiumionOH七、毛細(xì)管微乳電動色譜

(Microemulsionele50CE相關(guān)技術(shù)1.毛細(xì)管電泳柱技術(shù)毛細(xì)管是CE的核心部件之一．早期研究集中在毛細(xì)管直徑、長度、形狀和材料方面，目前集中在管壁的改性和各種柱的制備。

CE相關(guān)技術(shù)511)動態(tài)修飾毛細(xì)管內(nèi)壁

管壁改性主要是消除吸附和控制電滲流，通常采用動態(tài)修飾和表面涂層兩類方法。動態(tài)修飾采用在運(yùn)行緩沖液中加入添加劑，如加入陽離子表面活性劑十四烷基三甲基溴化銨(TTAB)，能在內(nèi)壁形成物理吸附層，使EOF反向．添加劑還有聚胺、聚乙烯亞胺(PEI)等，甲基纖維素(MC)可形成一中性親水性覆蓋層。

1)動態(tài)修飾毛細(xì)管內(nèi)壁522)毛細(xì)管內(nèi)壁表面涂層

涂層方法有很多種，包括物理涂布、化學(xué)涂層。最常用的方法是采用雙官能團(tuán)的偶聯(lián)劑，如各種有機(jī)硅烷，第一個官能團(tuán)(如甲氧基)與管壁上的游離羥基進(jìn)行反應(yīng)，使其與管壁進(jìn)行共價結(jié)合，再用第二個官能團(tuán)(如乙烯基)與涂漬物(如聚丙烯酰胺)進(jìn)行反應(yīng)，形成一穩(wěn)定的涂層．此外還有將纖維素、PEI和聚醚組成多層涂層，親水性的絨毛涂層(fuzzy)和聯(lián)鎖聚醚涂層。2)毛細(xì)管內(nèi)壁表面涂層53化學(xué)鍵合物理吸附化學(xué)鍵合物理吸附543)凝膠柱和無膠篩分

CGE的關(guān)鍵是毛細(xì)管凝膠柱的制備，常用聚丙烯酰胺凝膠栓來進(jìn)行DNA片段分析和測序。測定蛋白質(zhì)和肽的分子量常用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺電泳(SDS-LPAGE)。如將聚丙烯胺單體溶液中的交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)濃度降為零，得到線性非交聯(lián)的親水性聚合物用作操作溶液，仍有按分子大小分離的作用，稱無膠篩分。此法簡單，使用方便，分離能力比CGE差。3)凝膠柱和無膠篩分554)CEC的毛細(xì)管柱制備

包括開管和填充柱

開管柱：鍵合色譜涂層毛細(xì)管柱，例如：將核糖核酸酶、己糖激酶、腺苷脫氨酶等固定到毛細(xì)管表面，構(gòu)成一開管反應(yīng)器，再和CE連接，可進(jìn)行核酸選擇性檢測、微量在線合成和分離寡核昔酸等工作。

填充柱：可將HPLC中眾多的固定相微粒填充到毛細(xì)管中。4)CEC的毛細(xì)管柱制備562.毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)

CE對檢測器靈敏度要求相當(dāng)高，故檢測是CE中的關(guān)鍵問題。迄今為止除了原子吸收光譜與紅外光譜末用于CE外，其它檢測手段均已用于CE?，F(xiàn)選擇重要的幾類檢測器介紹其最新進(jìn)展。2.毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)571)紫外檢測器(UV)

在合適位置除去涂層，將透明部分對準(zhǔn)光路。UV檢測器集中在提高靈敏度，可采用毛細(xì)管彎折、吹泡技術(shù)擴(kuò)大光路?；虿捎闷矫娣e分檢測池，這種設(shè)計(jì)可使檢測光路增加到1cm。也有用光散射二極管(LEDS)作光源，其線性范圍和信噪比優(yōu)于汞燈?？傮w來說進(jìn)展不大。1)紫外檢測器(UV)582)激光誘導(dǎo)熒光檢測[LIF]

LIF是CE最靈敏的檢測器之一，極大地拓展了CE的應(yīng)用，DNA測序就須用LIF，單細(xì)胞和單分子檢測也離不開LIF。利用CE-LIF技術(shù)可檢出染色的單個DNA分子，有望用于癌癥的早期診斷及臨床酶和免疫學(xué)檢測等。CE／LIF和微透析結(jié)合可測定腦中神經(jīng)肽。采用波長分辨熒光檢測器可提供有關(guān)蛋白和DNA序列的一些結(jié)構(gòu)和動態(tài)信息。一些適用于二極管激光器的熒光標(biāo)記試劑如CY—5等，正在不斷開發(fā)和應(yīng)用。2)激光誘導(dǎo)熒光檢測[LIF]59

CE/LIF向三個方向發(fā)展：在原有氦—鎘激光器(325nm)和氬離子激光器(488nm)之外，發(fā)展價廉、長波長的二極管激光器；發(fā)展更多的熒光標(biāo)記試劑來擴(kuò)展應(yīng)用面；開展更多的應(yīng)用研究。LIF不但提高了靈敏度，也可增加選擇性，缺點(diǎn)在于被測物須用熒光試劑標(biāo)記成染色。CE/LIF向三個方向發(fā)展：在原有氦—鎘激光器(3603).CE/MS聯(lián)用

CE/MS聯(lián)用,彌補(bǔ)了CE定性鑒定的不足，故發(fā)展特別快。CE/MS聯(lián)用主要在兩方面發(fā)展：一是各種CE模式和MS聯(lián)用，二是CE和各種MS聯(lián)用。關(guān)鍵是解決接口裝置。最早報(bào)道CE/MS聯(lián)用是采用單級四極桿質(zhì)譜，現(xiàn)已發(fā)展到三級四極質(zhì)譜、離子阱質(zhì)譜等。CE/MS聯(lián)用特別適合于復(fù)雜生物體系的分離鑒定。因所需樣品少，目前大部分工作集中在基因工程產(chǎn)品和蛋白樣品，CE/MS聯(lián)用現(xiàn)在已成為CE研究中的熱點(diǎn)。3).CE/MS聯(lián)用614)電化學(xué)檢測器（EC）

EC可避免光學(xué)類檢測器遇到的光程太短的問題，故和LIF同為CE中靈敏度最高的檢測器。報(bào)道最多的是電化學(xué)伏安檢測器，常用碳纖維微電極進(jìn)行單細(xì)胞極微量神經(jīng)遞質(zhì)(如多巴胺等)的測定?？捎妹}沖伏安法測定糖、糖肽及金屬離子，也可用循環(huán)伏安法，另一類常用的EC為電導(dǎo)檢測器，Li＋的檢測限達(dá)10-7mol/L(10-15mol)。4)電化學(xué)檢測器（EC）625)化學(xué)發(fā)光檢測器(CL)

CL具有結(jié)構(gòu)簡單、靈敏度高的特點(diǎn)，近年來引起重視。用CE—CL檢測血紅蛋白，其檢測限比CE—UV低約4個數(shù)量級。應(yīng)用最多的仍是魯米那(luminol)體系，因?yàn)樵擉w系對多數(shù)待測物如一些金屬離子、氨基酸及其衍生物的檢測靈敏度很高，且反應(yīng)在水相進(jìn)行。電致化學(xué)發(fā)光(ECL)也已成功地用作CE檢測。

5)化學(xué)發(fā)光檢測器(CL)636)其它檢測器

采用激光作激勵源的除LIF外，還有激光熱透鏡檢測、激光光熱檢測和激光拉曼檢測等。普通熒光檢測器研究集中在開發(fā)新的熒光染料，以提高靈敏度。同位素檢測器具有高選擇性和高靈敏度〔可達(dá)10-9加mol/L〕，但測定時需經(jīng)同位素標(biāo)記步驟，故應(yīng)用受到限制。6)其它檢測器64

總之，檢測器是CE中具有挑戰(zhàn)性的研究工作。CE/MS聯(lián)用是最有應(yīng)用價值的檢測器，但價格昂貴，不易推廣。發(fā)展新型檢測器、提高UV等檢測器靈敏度，以及發(fā)展CE和其它分離方法、檢測方法的聯(lián)用是CE研究重點(diǎn)之一?？傊?，檢測器是CE中具有挑戰(zhàn)性的研究工65Lightsource(-)(+)-----------bufferbuffer毛細(xì)管電泳—間接紫外檢測法

測定植物中的低分子量有機(jī)酸Lightsource(-)(+)b66----------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++EOF-+-------67莧菜根、莖、葉樣品溶液電泳圖1甲酸2蘋果酸3檸檬酸4琥珀酸5戊二酸6未知峰7乙酸莧菜根、莖、葉樣品溶液電泳圖1甲酸68毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用69電泳

在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實(shí)現(xiàn)分離。

1808年，Reuss（俄國）首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。1937年，Tiselius（瑞典）用于人血清蛋白質(zhì)混合液的分離：

發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定；第一次的自由溶液電泳；第一臺電泳儀；1948年，獲諾貝爾化學(xué)獎；電泳在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在70經(jīng)典電泳

利用電泳現(xiàn)象對某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。

按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳；按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳；傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。1981年，Jorgenson和Luckas，用75μm內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析，柱效高達(dá)40萬/m，促進(jìn)電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)——毛細(xì)管電泳。經(jīng)典電泳利用電泳現(xiàn)象對某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析71毛細(xì)管電泳（CapillaryElectrophoresis,CE）高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)：采用了25-100μm內(nèi)徑的毛細(xì)管；采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。毛細(xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場電壓可以很高。電壓升高，電場推動力大，又可進(jìn)一步使柱徑變小，柱長增加，毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于HPLC，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬。毛細(xì)管電泳（CapillaryElectrophoresi72分離過程

電場作用下，毛細(xì)管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。

帶電粒子的遷移速度=電泳+電滲流；兩種速度的矢量和。

陽離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動方向一致，在負(fù)極最先流出；

中性粒子無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；

陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動方向相反。ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負(fù)極最后流出除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場力大小不一樣也同時被相互分離。分離過程電場作用下，毛細(xì)管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。73毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)1.儀器簡單、易自動化電源、毛細(xì)管、檢測器、溶液瓶2.分析速度快、分離效率高

在3.1min內(nèi)分離36種無機(jī)及有機(jī)陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種陽離子；3.操作方便、消耗少

進(jìn)樣量極少，水介質(zhì)中進(jìn)行；4.應(yīng)用范圍極廣有機(jī)物、無機(jī)物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、環(huán)境保護(hù)、材料等；

毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)1.儀器簡單、易自動化74一、CE基本原理二、電滲現(xiàn)象與電滲流electroosmoticflow三、影響電滲流的因素四、淌度mobility五、CE中的參數(shù)與關(guān)系式六、影響分離效率的因素毛細(xì)管電泳理論基礎(chǔ)一、CE基本原理毛細(xì)管電泳理論基礎(chǔ)75毛細(xì)管電泳(CE)基本原理

電泳是指帶電離子在電場中的定向移動，不同離子具有不同的遷移速度，遷移速度與哪些因素有關(guān)？當(dāng)帶電離子以速度ν在電場中移動時，受到大小相等、方向相反的電場推動力和平動摩擦阻力的作用。電場力：FE=qE

阻力：F=fν故：qE=fνq—離子所帶的有效電荷；E—電場強(qiáng)度；ν—離子在電場中的遷移速度；f—平動摩擦系數(shù)(對于球形離子：f=6πηγ；γ—離子的表觀液態(tài)動力學(xué)半徑；η—介質(zhì)的粘度；)毛細(xì)管電泳(CE)基本原理

電泳是指帶電離子在電場中76所以，遷移速度：（球形離子）

物質(zhì)離子在電場中差速遷移是電泳分離的基礎(chǔ)。淌度μ

：單位電場強(qiáng)度下的平均電泳速度。

q—離子所帶的有效電荷；E—電場強(qiáng)度；γ—離子的表觀液態(tài)動力學(xué)半徑η—介質(zhì)的粘度；所以，遷移速度：（球形離子）物質(zhì)離子在電場中77電滲現(xiàn)象與電滲流

electroosmosisandelectroosmoticflow1.電滲流現(xiàn)象

當(dāng)固體與液體接觸時，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差。

當(dāng)液體兩端施加電壓時，就會發(fā)生液體相對于固體表面的移動，這種液體相對于固體表面的移動的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。

電滲現(xiàn)象中整體移動著的液體叫電滲流（electroosmoticflow，簡稱EOF）。

電滲現(xiàn)象與電滲流

electroosmosisande782.HPCE中的電滲現(xiàn)象與電滲流

石英毛細(xì)管柱，內(nèi)充液pH>3時，表面電離成-SiO-,管內(nèi)壁帶負(fù)電荷，形成雙電層。

在高電場的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴(kuò)散層向陰極移動，由于這些陽離子實(shí)際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動，速度ν電滲流。2.HPCE中的電滲現(xiàn)象與電滲流石英毛細(xì)管柱，內(nèi)充793.CE中電滲流的大小與方向

電滲流的大小用電滲流速度ν電滲流表示，取決于電滲淌度μ和電場強(qiáng)度E。即

ν電滲流=μE電滲淌度取決于電泳介質(zhì)及雙電層的Zeta電勢，即

μ=ε0εξε0—真空介電常數(shù)；ε—介電常數(shù)；ξ—毛細(xì)管壁的Zeta電勢。

ν電滲流=ε0εξ

E實(shí)際電泳分析，可在實(shí)驗(yàn)測定相應(yīng)參數(shù)后，按下式計(jì)算

ν電滲流=Lef/teoLef—毛細(xì)管有效長度；teo—電滲流標(biāo)記物（中性物質(zhì)）的遷移時間。3.CE中電滲流的大小與方向電滲流的大小用電滲流速度80CE中電滲流的方向

電滲流的方向取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)：內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向負(fù)極；內(nèi)表面帶正負(fù)電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向正極；石英毛細(xì)管；帶負(fù)電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向的方法：

（1）毛細(xì)管改性表面鍵合陽離子基團(tuán)；

（2）加電滲流反轉(zhuǎn)劑內(nèi)充液中加入大量的陽離子表面活性劑，將使石英毛細(xì)管壁帶正電荷，溶液表面帶負(fù)電荷。電滲流流向正極。CE中電滲流的方向電滲流的方向取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的814.CE中電滲流的流形

電荷均勻分布，整體移動，電滲流的流動為平流，塞式流動（譜帶展寬很?。?；液相色譜中的溶液流動為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。4.CE中電滲流的流形電荷均勻分布，整體移動，電滲流825.CE中電滲流的作用

電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5～7倍；

各種電性離子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為：

ν+=ν電滲流+ν+ef陽離子運(yùn)動方向與電滲流一致；ν-=ν電滲流-ν-ef陰離子運(yùn)動方向與電滲流相反；ν0=ν電滲流中性粒子運(yùn)動方向與電滲流一致；（1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離；（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中的流速；（3）電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性；在CE中，控制電滲流非常重要。5.CE中電滲流的作用電滲流的速度約等于一般離子電泳83CE中影響電滲流的因素1.電場強(qiáng)度的影響

電滲流速度和電場強(qiáng)度成正比，當(dāng)毛細(xì)管長度一定時，電滲流速度正比于工作電壓。2.毛細(xì)管材料的影響

不同材料毛細(xì)管的表面電荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大小不同；CE中影響電滲流的因素1.電場強(qiáng)度的影響2.毛細(xì)管材料843.電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響（1）溶液pH的影響對于石英毛細(xì)管，溶液pH增高時，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢增大，電滲流增大，pH=7，達(dá)到最大；pH<3，完全被氫離子中和，表面電中性，電滲流為零。分析時，采用緩沖溶液來保持pH穩(wěn)定。（2）陰離子的影響在其他條件相同，濃度相同而陰離子不同時，毛細(xì)管中的電流有較大差別，產(chǎn)生的焦耳熱不同。緩沖溶液離子強(qiáng)度，影響雙電層的厚度、溶液黏度和工作電流，明顯影響電滲流大小。緩沖溶液離子強(qiáng)度增加，電滲流下降。3.電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響（1）溶液pH的影響85毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用課件864.溫度的影響毛細(xì)管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。溫度變化來自于“焦耳熱”；

焦耳熱：毛細(xì)管溶液中有電流通過時，產(chǎn)生的熱量；CE中的焦耳熱與背景電解質(zhì)的摩爾電導(dǎo)、濃度及電場強(qiáng)度成正比。溫度每變化1，將引起背景電解質(zhì)溶液黏度變化2%～3%；4.溫度的影響毛細(xì)管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降875.添加劑的影響（1）加入濃度較大的中性鹽，如K2SO4，溶液離子強(qiáng)度增大，使溶液的黏度增大，電滲流減小。（2）加入有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，使電滲流增大。

（3）加入表面活性劑，可改變電滲流的大小和方向；加入陰離子表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS），可以使壁表面負(fù)電荷增加，zeta電勢增大，電滲流增大；加入不同陽離子表面活性劑來控制電滲流。5.添加劑的影響（1）加入濃度較大的中性鹽，如K2SO4，88淌度Mobility

淌度：帶電離子在單位電場下的遷移速度；

淌度不同是電泳分離的基礎(chǔ)。1.絕對淌度(absolutemobility)μab無限稀釋溶液中帶電離子在單位電場強(qiáng)度下的平均遷移速度，簡稱淌度。可在手冊中查閱。2.有效淌度(effectivemobility)μef實(shí)際溶液中的淌度(實(shí)驗(yàn)中測定的)。μef=∑aiμi

ai—溶質(zhì)i的解離度；μi—溶質(zhì)i在解離狀態(tài)下的絕對淌度淌度Mobility淌度：帶電離子在單位電場下89CE中的參數(shù)與關(guān)系式

1.遷移時間（保留時間）

CE兼具有電化學(xué)的特性和色譜分析的特性。有關(guān)色譜理論也適用。V—外加電壓；L—毛細(xì)管總長度；2.分離效率（塔板數(shù)）

在CE中，僅存在縱向擴(kuò)散，σ2=2Dt

擴(kuò)散系數(shù)小的溶質(zhì)比擴(kuò)散系數(shù)大的分離效率高，分離生物大分子的依據(jù)。CE中的參數(shù)與關(guān)系式1.遷移時間（保留時間）V—外加903.分離度

影響分離度的主要因素；工作電壓V；毛細(xì)管有效長度與總長度比；有效淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計(jì)算：3.分離度影響分離度的主要因素；工作電壓V；毛細(xì)91影響分離效率的因素—區(qū)帶展寬1.縱向擴(kuò)散的影響

在HPCE中，縱向擴(kuò)散引起的峰展寬：σ2=2Dt由擴(kuò)散系數(shù)和遷移時間決定。大分子的擴(kuò)散系數(shù)小，可獲得更高的分離效率，大分子生物試樣分離的依據(jù)。2.進(jìn)樣的影響

當(dāng)進(jìn)樣塞長度太大時，引起的峰展寬大于縱向擴(kuò)散。分離效率明顯下降；理想情況下，進(jìn)樣塞長度：

Winj=(24Dt)1/2實(shí)際操作時進(jìn)樣塞長度小于或等于毛細(xì)管總長度的1%～2%。影響分離效率的因素—區(qū)帶展寬1.縱向擴(kuò)散的影響923.焦耳熱與溫度梯度的影響

電泳過程產(chǎn)生的焦耳熱可由下式計(jì)算：m—電解質(zhì)溶液的摩爾電導(dǎo)；I—工作電流：cm—電解質(zhì)濃度；

散熱過程中，在毛細(xì)管內(nèi)形成溫度梯度（中心溫度高），破壞了塞流，導(dǎo)致區(qū)帶展寬。改善方法：（1）減小毛細(xì)管內(nèi)徑；（2）控制散熱；3.焦耳熱與溫度梯度的影響電泳過程產(chǎn)生的焦耳熱可由934.溶質(zhì)與管壁間的相互作用

存在吸附與疏水作用，造成譜帶展寬；蛋白質(zhì)、多肽帶電荷數(shù)多，有較多的疏水基，吸附問題特別嚴(yán)重，是目前分離分析該類物質(zhì)的一大難題。細(xì)內(nèi)徑毛細(xì)管柱，一方面有利于散熱，另一方面比表面積大，又增加了溶質(zhì)吸附的機(jī)會。減小吸附的方法和途徑：加入兩性離子代替強(qiáng)電解質(zhì)，兩性離子一端帶正電，另一端帶負(fù)電，帶正電一端與管壁負(fù)電中心作用，濃度約為溶質(zhì)的100-1000倍時，抑制對蛋白質(zhì)吸附，又不增加溶液電導(dǎo)，對電滲流影響不大。4.溶質(zhì)與管壁間的相互作用存在吸附與疏水作用，造成945.其他影響因素

（1）電分散作用對譜帶展寬的影響當(dāng)溶質(zhì)區(qū)帶與緩沖溶液區(qū)帶的電導(dǎo)不同時，也造成譜帶展寬；盡量選擇與試樣淌度相匹配的背景電解質(zhì)溶液。（2）“層流”現(xiàn)象對譜帶展寬的影響一般情況下，CE中不存在層流，但當(dāng)毛細(xì)管兩端存在壓力差時，出現(xiàn)拋物線形的層流；

產(chǎn)生的原因：毛細(xì)管兩端液面高度不同。實(shí)際操作時，保持毛細(xì)管兩端緩沖溶液平面高度相同。5.其他影響因素（1）電分散作用對譜帶展寬的影響95一、高效毛細(xì)管電泳儀二、流程與主要部件三、進(jìn)樣方式四、檢測器毛細(xì)管電泳儀一、高效毛細(xì)管電泳儀毛細(xì)管電泳儀96毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用課件97儀器流程與主要部件

電壓：0～30kV；分離柱不涂敷任何固定液；紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測器；（可檢測到：10-19～10-21mol/L）儀器流程與主要部件電壓：0～30kV；981.高壓電源（1）0～30kV穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；（2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出；（3）電場強(qiáng)度程序控制系統(tǒng)；（4）電壓穩(wěn)定性：0.1%；（5）電源極性易轉(zhuǎn)換；2.毛細(xì)管柱

（1）材料：石英：各項(xiàng)性能好；玻璃：光學(xué)、機(jī)械性能差；（2）規(guī)格：內(nèi)徑20～75μm，外徑350～400μm；長度<=1m1.高壓電源（1）0～30kV穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；993.緩沖液池

化學(xué)惰性，機(jī)械穩(wěn)定性好；4.檢測器

要求：具有極高靈敏度，可柱端檢測；檢測器、數(shù)據(jù)采集與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理一體化；

類型檢測限/mol特點(diǎn)紫外-可見10-13～10-15加二極管陣列，光譜信息熒光10-15～10-17靈敏度高，樣品需衍生激光誘導(dǎo)熒光10-18～10-20靈敏度極高，樣品需衍生電導(dǎo)10-18～10-19離子靈敏，需專用的裝置；3.緩沖液池化學(xué)惰性，機(jī)械穩(wěn)定性好；類型100CE具體操作步驟：毛細(xì)管電泳的基本步驟包括清洗毛細(xì)管、更換電泳緩沖液、進(jìn)樣、電泳并同時在線檢測。1).清洗毛細(xì)管對于一根新的或久未使用的毛細(xì)管，需用1mol/L的NaOH溶液、0.1mol/LNaOH溶液、超純水依次清洗。在有些情況下還需用0.1mol/LHCl、甲醇或去垢劑清洗,強(qiáng)堿溶液可以清除吸附在毛細(xì)管內(nèi)壁的油脂、蛋白質(zhì)等，強(qiáng)酸溶液可以清除一些金屬或金屬離子，甲醇、去垢劑可去除疏水性強(qiáng)的雜質(zhì)。CE具體操作步驟：101

在進(jìn)行每次分析前可用相當(dāng)于毛細(xì)管總體積2~3倍的0.1mol/L的NaOH溶液清洗一遍，一般為2~3min，而后注入電泳緩沖液，以保證分析結(jié)果的重復(fù)性。在進(jìn)行每次分析前可用相當(dāng)于毛細(xì)管總體積2~3倍的102

2).更替電泳緩沖液在進(jìn)行每次分析前可用相當(dāng)于毛細(xì)管總體積2~3倍的0.1mol/L的NaOH溶液清洗一遍，一般為2~3min，而后注入電泳緩沖液，以保證分析結(jié)果的重復(fù)性。上一步清洗過程結(jié)束后，毛細(xì)管和電極從清洗液中移至電泳緩沖液，不可避免地將強(qiáng)堿或強(qiáng)酸等溶液帶至其中。緩沖液本身也會因揮發(fā)、電泳等而改變其離子強(qiáng)度。因此對于精確分析，每分析五次后需更換一次樣品盤中的緩沖液。一般分析，半天更換一次即可。2).更替電泳緩沖液1033）毛細(xì)管電泳的進(jìn)樣方式

進(jìn)樣量：毛細(xì)管長度的1%-2%；nL級、非常小；1.流體力學(xué)進(jìn)樣方式

（1）進(jìn)樣端加壓（2）出口端抽真空（3）虹吸進(jìn)樣3）毛細(xì)管電泳的進(jìn)樣方式

進(jìn)樣量：毛細(xì)管長度的1%-104

毛細(xì)管一端插入樣品瓶，加電壓；2.電動進(jìn)樣方式

進(jìn)樣不均：電歧視現(xiàn)象，淌度大的離子比淌度小的進(jìn)樣量大；離子丟失：淌度大且與電滲流方向相反的離子可能進(jìn)不去；

特別適合黏度大的試樣；3.擴(kuò)散進(jìn)樣試樣通過擴(kuò)散作用進(jìn)入分離柱端口處。毛細(xì)管一端插入樣品瓶，加電壓；2.電動進(jìn)樣方式105Buffer:50mMphosphate–TEA(pH2.5)with4.0%HP-β-CD(w/v)and50%methanol;Appliedpotential:30kV;Sample:1mg/Lpropranololdissolvedin(A)(B)water,(C)methanol;(A)Pressureinjection0.5psi.,5s,(B)(C)electrokineticinjection10kV,5s.

CABEffectofinjectionmodeBuffer:50mMphosphate–TEA(106(A)ConditioningofthecapillarywithalowpHbuffercontainingCTAB,andinjectionofalongwaterplugintothecapillarybypressure;(B)Field-amplifiedinjectionofcationsandstackingontheboundaryofwaterplugandtheBGS,whileremovingofthewaterplugoutofthecapillary;(C)Separationvoltageisapplied.TheenantiomerscomplexwithCDandareseparated,andtherestofwaterplugisremoved.SchematicdiagramstheFAEP(A)Conditioningofthecap107分離模式八種分離類型，介紹常用的幾種；根據(jù)試樣性質(zhì)不同，采用不同的分離類型；每種機(jī)理的選擇性不同；分離模式八種分離類型，介紹常用的幾種；108一、毛細(xì)管區(qū)帶電泳

capillaryzoneelectrophoresis，CZE

帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流速度的矢量和。

正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動方向一致，在負(fù)極最先流出；中性粒子：無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；

陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動方向相反；ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負(fù)極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,同種類離子由于差速遷移被相互分離。

最基本、應(yīng)用廣的分離模式；一、毛細(xì)管區(qū)帶電泳

capillaryzoneelect109二、毛細(xì)管凝膠電泳

capillarygelelectrophoresis，CGE將聚丙烯酰胺等在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖銳，分離效率高。蛋白質(zhì)、DNA等的電荷/質(zhì)量比與分子大小無關(guān)，CZE模式很難分離，采用CGE能獲得良好分離，DAN排序的重要手段。特點(diǎn)：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。無膠篩分技術(shù)：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。二、毛細(xì)管凝膠電泳

capillarygelelect110

1.緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達(dá)到臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。三、膠束電動毛細(xì)管色譜（MEKC）

Micellarelectrokineticcapillarychromatography，MEKC

在電場力的作用下，膠束在柱中移動。1.緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達(dá)到臨界濃111

2.電泳流和電滲流的方向相反，且ν電滲流>ν電泳，負(fù)電膠束以較慢的速度向負(fù)極移動；

5.色譜與電泳分離模式的結(jié)合。3.中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強(qiáng)的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時間長；4.可用來分離中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍；2.電泳流和電滲流的方向相反，且ν電滲流>ν112

1.根據(jù)等電點(diǎn)差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)；2.毛細(xì)管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合成的具有不同等電點(diǎn)范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當(dāng)施加直流電壓（6～8V）時，管內(nèi)將建立一個由陽極到陰極逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關(guān)，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負(fù)電荷。在其等電點(diǎn)時，呈電中性，淌度為零；四、毛細(xì)管等電聚焦

Capillaryisoelectricfocusing，CIEF1.根據(jù)等電點(diǎn)差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)113

4.聚焦：具有不同等電點(diǎn)的生物試樣在電場力的作用下遷移，分別到達(dá)滿足其等電點(diǎn)pH的位置時，呈電中性，停止移動，形成窄溶質(zhì)帶而相互分離；

5.陽極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀NaOH溶液；6.加壓將毛細(xì)管內(nèi)分離后的溶液推出經(jīng)過檢測器檢測；7.電滲流在CIEF中不利，應(yīng)消除或減小。4.聚焦：具有不同等電點(diǎn)的生物試樣在電場力的作用下遷移114

1.將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導(dǎo)離子(充滿毛細(xì)管)和尾隨離子，試樣離子的淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動。2.負(fù)離子分析時，前導(dǎo)電解質(zhì)的淌度大于試樣中所有負(fù)離子的。所有試樣都按前導(dǎo)離子的速度等速向陽極前進(jìn)，逐漸形成各自獨(dú)立的區(qū)帶而分離。陰極進(jìn)樣，陽極檢測。五、毛細(xì)管等速電泳

Capillaryisotachophoresis，CITP1.將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導(dǎo)離子(充滿毛115

3.不同離子的淌度不同，所形成區(qū)帶的電場強(qiáng)度不同(ν=μE)，淌度大的離子區(qū)帶電場強(qiáng)度??；沿出口到進(jìn)口，將不同區(qū)帶依次排序1、2、3、4電場強(qiáng)度依次增大。假設(shè)“2”號中離子擴(kuò)散到“3”號，該區(qū)電場強(qiáng)度大，離子被加速，返回到“2”區(qū)；當(dāng)“2”號中離子跑到“1”號區(qū)，離子被減速使之歸隊(duì)；4.特點(diǎn)：界面明顯，富集、濃縮作用；capillaryisotachophoresis，CITP3.不同離子的淌度不同，所形成區(qū)帶的電場強(qiáng)度不同(ν=116

在毛細(xì)管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定液，以“電滲泵”取代機(jī)械泵，試樣組分在兩相間的分配為分離機(jī)理的電動色譜過程。六、毛細(xì)管電動色譜

Capillaryelectrokineticchromatography，CEC在毛細(xì)管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定液，以“電滲117七、毛細(xì)管微乳電動色譜

(Microemulsionelectrokineticchromatography,

MEEKC)

Watern-OctaneSO3-SO3-

OH

OHOHOH

OHNa+Na+WaterNa+SO3-WaterButan-1-olSDSSodiumionOH七、毛細(xì)管微乳電動色譜

(Microemulsionele118CE相關(guān)技術(shù)1.毛細(xì)管電泳柱技術(shù)毛細(xì)管是CE的核心部件之一．早期研究集中在毛細(xì)管直徑、長度、形狀和材料方面，目前集中在管壁的改性和各種柱的制備。

CE相關(guān)技術(shù)1191)動態(tài)修飾毛細(xì)管內(nèi)壁

管壁改性主要是消除吸附和控制電滲流，通常采用動態(tài)修飾和表面涂層兩類方法。動態(tài)修飾采用在運(yùn)行緩沖液中加入添加劑，如加入陽離子表面活性劑十四烷基三甲基溴化銨(TTAB)，能在內(nèi)壁形成物理吸附層，使EOF反向．添加劑還有聚胺、聚乙烯亞胺(PEI)等，甲基纖維素(MC)可形成一中性親水性覆蓋層。

1)動態(tài)修飾毛細(xì)管內(nèi)壁1202)毛細(xì)管內(nèi)壁表面涂層

涂層方法有很多種，包括物理涂布、化學(xué)涂層。最常用的方法是采用雙官能團(tuán)的偶聯(lián)劑，如各種有機(jī)硅烷，第一個