連續(xù)培養(yǎng)的基本原理課件

第六章連續(xù)培養(yǎng)的基本原理第一節(jié)微生物生長的基本特征微生物的種類（可分為三大類）：Ⅰ、非細胞型微生物（病毒）；Ⅱ、原核細胞型微生物，僅有原始細胞核，如細菌、放線菌等；Ⅲ、真核細胞型微生物，霉菌、酵母菌和單細胞藻類，原生動物。

微生物的作用：

微生物是生物反應過程的催化劑，催化原料轉(zhuǎn)化為有用的產(chǎn)品；微生物如同一個微小的容器，原料中的反應物透過微生物細胞周圍的細胞壁和細胞膜進入微生物體內(nèi)，把反應物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，接著這些產(chǎn)物又被釋放出來。

一、生長現(xiàn)象與繁殖方式

微生物可分為成三大類：Ⅰ、非細胞型微生物學（病毒）；Ⅱ、是原核細胞型微生物，僅有原始細胞核，如細菌、放線菌等；Ⅲ、是真核細胞型微生物，霉菌、酵母菌和單細胞藻類，原生動物。

微生物細胞在生長過程中的變化：

其形態(tài)、組成、活性都處在動態(tài)變化過程中，使其經(jīng)歷生長、繁殖、維持、死亡等階段。并使反應系統(tǒng)中的環(huán)境條件也處在動態(tài)變化之中。微生物細胞的基本組成：蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、核酸等。

二、生長的測定

微生物生長的測定，通常是測群體的重量或細胞數(shù)，而不是測細胞個體的重量或大小。生長測定的常用理化方法，分為測定細胞數(shù)和細胞重量兩類。1、計數(shù)器計數(shù)法濁度計比濁法測定稀的細胞懸液的透光量，間接測出細胞數(shù)量的生長計數(shù)器計數(shù)法在顯微鏡下用血球計數(shù)器直接數(shù)出酵母菌或霉菌孢子數(shù)目，以及用細菌計數(shù)片直接測出細菌數(shù)的生長2、測定細胞重量

細胞干重稱量法直接測定單位體積培養(yǎng)物的細胞干重，由此代表菌體細胞物質(zhì)總量的生長細胞堆積容積測量法

用錐形刻度管測量經(jīng)離心的細胞沉淀物的容積，由此間接表示細胞重量的生長細胞組成分析法測定一種大分子的細胞組成(蛋白質(zhì)、RNA、DNA等)，間接地算出細胞重量的生長

第二節(jié)微生物生長動力學

什么是微生物生長動力學？微生物生長動力學是研究微生物生長過程的速率及其影響速率的各種因素，從而獲得相關(guān)信息。微生物生長動力學可反映細胞適應環(huán)境變化的能力。

一、微生物生長曲線

細胞的生長過程可以用細胞濃度的變化來描述和表達。若取細胞濃度的對數(shù)值與細胞生長時間對應作圖，可得到分批培養(yǎng)時的細胞濃度變化曲線。二、微生物生長動力學1、比生長速率specificgrowthrate若細胞物質(zhì)或細胞數(shù)目增長一倍的時間間隔是常數(shù)，則微生物是以指數(shù)速率增長，可用數(shù)學模型來描述。（1）

（2）

式（1）表明，細胞物質(zhì)隨時間的增加而增加式（2）表明，細胞數(shù)目隨時間的增加而增加當微生物處在最高的生長時期，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物過量，此時生長速率與營養(yǎng)物濃度無關(guān)，而與細胞濃度有關(guān)，其關(guān)系表現(xiàn)為微生物細胞濃度（以重量表示）的瞬時增長速率dX/dt和培養(yǎng)液中微生物細胞濃度X成正比，或任一瞬間生長速率與細胞濃度成正比。若μ為常數(shù)，則：

對式（1）積分得：

在大多數(shù)情況下，生長是以物質(zhì)的增加衡量的，因而得到應用。此式可在△t=td（td為倍增時間）時求得，td即在時所需時間，于是td=ln2/μ=0.693/μ。

為比生長速率，單位是h-1。對式（2）積分得：

lgNt-lgN0=μ(t1-t0)/2.303例題1：某微生物的＝0.125h-1，求td。2：N0時每ml培養(yǎng)液中細菌數(shù)為104，經(jīng)過4小時后該培養(yǎng)液中細菌的數(shù)目增加到108，求此條件下細菌的比生長速率（μ）μ=(lgNt-lgN0)/(t1-t0)2.303=(8-4)/42.303/h=2.303h-1代表在該條件下，每個細菌以每小時增加2.303個細菌的速度增加

比生長速率的意義

比生長速率是菌體繁殖速率與培養(yǎng)基中菌體濃度之比，它與微生物的生命活動有聯(lián)系

在對數(shù)生長期，是一個常數(shù)，這時

Monod方程是典型的均衡生長模型，其基本假設如下：①細胞的生長為均衡式生長，因此描述細胞生長的唯一變量是細胞的濃度；②培養(yǎng)基中只有一種基質(zhì)是生長限制性基質(zhì)，而其它組分為過量，不影響細胞的生長；③

細胞的生長視為簡單的單一反應，細胞生長速率為一常數(shù)。

Monod方程中為比生長速率(h-1)；為最大比生長速率(h-1)，S為限制性基質(zhì)濃度(g／L)；Ks為飽和常數(shù)(g/L)，其值等于比生長速率為最大比生長速率一半時的限制性基質(zhì)濃度。

當一種限制性營養(yǎng)物濃度S大大低于Ks時，μ=μmaxS/Ks，即μ很小，此時生長很慢當S=Ks時，μ=0.5μmax，隨營養(yǎng)物濃度增加，μ相應增加，逐漸趨向μmax，μ成為營養(yǎng)物濃度的重要函數(shù)，此時營養(yǎng)物濃度仍是生長的限制因素，在Monod模型上表現(xiàn)為曲線當S無限大時，μμmax，理論上最大潛力

當營養(yǎng)物濃度S大大高于Ks時，營養(yǎng)物濃度不再影響微生物生長，即S的變化不再成為生長限制因素，此時，μ接近μmax，在Monod曲線上表現(xiàn)為直線在分批培養(yǎng)時，Ks表示微生物對營養(yǎng)物的親和力，在一定營養(yǎng)條件下，Ks越小，微生物對限制性營養(yǎng)物的親和力越大，限制性營養(yǎng)物的濃度必須降低到十分低的水平，才能影響微生物的生長，Ks越大，親和力越小，即使限制性營養(yǎng)物濃度很高，生長率也下降將Monod方程變?yōu)椴⒆鲌D。通過該圖，即可以獲得兩個重要的動力學參數(shù)。Ks和μm值隨菌種、限制性基質(zhì)種類的變化微生物限制生長基質(zhì)Ksμm（hr）大腸桿菌葡萄糖0.22--大腸桿菌乳糖0.58--啤酒酵母乳糖2.6~3.00.18啤酒酵母葡萄糖0.56--纖維素分解菌葡萄糖0.860.125固氮菌葡萄糖0.16~0.330.13青霉菌氧氣0.0070.35Monod方程雖然表述簡單，但它不足以完整地說明復雜的生化反應過程，并且已發(fā)現(xiàn)它在某些情況與實驗結(jié)果不符，因此人們又提出了另外一些方程,歸納于下表

單基質(zhì)限制的細胞生長動力學模型第三節(jié)連續(xù)培養(yǎng)動力學及連續(xù)培養(yǎng)的應用現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)中，絕大多數(shù)的培養(yǎng)采用純種液體培養(yǎng)方法,其操作方法主要有:間歇培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和流加培養(yǎng)三種。連續(xù)培養(yǎng)是在1949年莫諾建立的，在連續(xù)培養(yǎng)中，將新鮮的培養(yǎng)基連續(xù)地加入有均勻培養(yǎng)液的反應器中，同時排出發(fā)酵液，使培養(yǎng)環(huán)境不隨時間變化而改變，保持培養(yǎng)的穩(wěn)定狀態(tài)，并可以維持一個較長的時間。一、單級恒化器及其操作特征恒化器：指具有恒定化學環(huán)境的反應器。在培養(yǎng)過程中，可靈活的制造多種培養(yǎng)環(huán)境來研究微生物生長、發(fā)酵的動力學特征。物料衡算：對于菌體：積累的細胞=（進入–流出）的細胞+（生長-死亡）的細胞即：dx/dt=(u-D)x對于限制性底物：積累的底物=（進入-流出）的底物-（生長+形成產(chǎn)物+維持代謝）所消耗的底物即：ds/dt=D(s0-s)-(u/Yx/s+rp/Yp/s+ms)x對于產(chǎn)物：積累的產(chǎn)物=（生成-流出）的產(chǎn)物即：dp/dt=rp·x-D·p當培養(yǎng)處于穩(wěn)態(tài)時，反應器中的菌體、底物、產(chǎn)物的積累量為零，即：

dx/dt=ds/dt=dp/dt=0則單級恒化器在穩(wěn)態(tài)條件下的物料衡算方程為：菌體：D-u=0底物：D(s0-s)-(D/Yx/s+rp/Yp/s+ms)x=0產(chǎn)物：rp·x-D·p=0若在培養(yǎng)微生物菌體的特定連續(xù)培養(yǎng)過程中存在：1）培養(yǎng)過程無產(chǎn)物形成，或形成得很少，忽略不計；2）維持代謝所消耗的底物很少，忽略不計。則：D=u;x=Yx/s(s0-s)代入莫諾方程：s=Ks·u/um-u整理后得：x=Yx/s(

s0-Ks·D/um-D)若上式D→um,s→s0,x→0時臨界稀釋率：DcritDcrit=um·s0/Ks+s0通常：Dcrit=um說明：用單級恒化器連續(xù)培養(yǎng)菌體的穩(wěn)態(tài)操作有D＜Dcrit，而當D≥Dcrit時，反應器中菌體濃度終將全部被洗出。參見書P113的例6-2二、部分菌體再循環(huán)的單級恒化器指連續(xù)分離單級恒化器流出的培養(yǎng)液，然后將分離后的部分菌體再接入反應器中。優(yōu)點：提供了連續(xù)接種手段；增加了培養(yǎng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性；實現(xiàn)了在較高的稀釋率下，D＞Dcrit；大大提高了單位體積反應器的反應效率物料衡算：對于菌體：積累的細胞=（進入-流出）的細胞+由循環(huán)液流入的細胞即：dx/dt=ux-[1+δ(1-γ)]x對于限制性底物：積累的底物=（進入-流出）的底物-消耗的底物+由循環(huán)液進入的底物即：ds/dt=D(s0-s)-u·x/Yx/s當培養(yǎng)處于穩(wěn)態(tài)時，dx/dt=ds/dt=0，則：U=D[1+δ(1-γ)];x=Yx/SD/u(s0-s)引入循環(huán)濃縮因子R=1+δ(1-γ)，0＜R＜1針對莫諾方程：有x=1/R·Yx/s(s0-Ks·R·D/um-R·D)說明：在部分菌體再循環(huán)的單級恒化器中，穩(wěn)定狀態(tài)下的菌體濃度x比沒有菌體再循環(huán)的大一個1/R因子。根據(jù)臨界稀釋率Dcrit的定義，則再循環(huán)下的臨