微生物作業(yè)指導(dǎo)書(shū)

微生物作業(yè)指導(dǎo)書(shū)微生物作業(yè)指導(dǎo)書(shū)微生物作業(yè)指導(dǎo)書(shū)xxx公司微生物作業(yè)指導(dǎo)書(shū)文件編號(hào)：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計(jì)，管理制度XHRXHR/JCZL-02-011-2014西安宏興乳業(yè)有限公司 微生物檢驗(yàn)作業(yè)指導(dǎo)書(shū)編制：審核：批準(zhǔn)：受控狀態(tài)：發(fā)放號(hào)：20142014-02-28實(shí)施西安宏興乳業(yè)有限公西安宏興乳業(yè)有限公司發(fā)布2014-02-25發(fā)布2014-02-25發(fā)布 目錄目錄目錄·························································1§1菌落總數(shù)···················································2§2大腸菌群的測(cè)定·············································7§3沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)··············································10§4金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)········································15§5阪崎腸桿菌的檢驗(yàn)··········································18 西安宏興乳業(yè)有限公司菌落總數(shù)測(cè)定菌落總數(shù)測(cè)定1.術(shù)語(yǔ)和定義菌落總數(shù)(aerobicplatecount)食品檢樣經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等）培養(yǎng)后，所得每g（mL）檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。2.設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：2.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。2.2冰箱：2℃～5℃。2.3烘箱。2.4天平：感量為0.1g。2.5均質(zhì)器。2.6無(wú)菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。2.7無(wú)菌錐形瓶：容量250mL、500mL。2.8無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。2.9菌落計(jì)數(shù)器。2.10試管，18*180，20*200。3.培養(yǎng)基和試劑3.1平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基。3.2無(wú)菌生理鹽水，0.85%。4.檢驗(yàn)程序菌落總數(shù)的檢驗(yàn)程序見(jiàn)下圖：↓↓↓↓↓5.操作步驟5.1.樣品的稀釋5.1.1固體和半固體樣品：稱(chēng)取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或放入盛有225mL稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min，制成1:10的樣品勻液。5.1.2液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。5.1.3用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。5.1.4按以上操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無(wú)菌吸管或吸頭。5.1.5根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，吸取1mL樣品勻液于無(wú)菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取1mL空品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，吸取1mL樣品勻液于無(wú)菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。5.1.6及時(shí)將15mL～20mL冷卻至46℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。5.2培養(yǎng)5.2.1待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36±1℃℃培養(yǎng)48h±2h。5.2.2如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4mL），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按5.2.1條件進(jìn)行培養(yǎng)。5.3菌落計(jì)數(shù)可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-formingunits，CFU）表示。5.3.1選取菌落數(shù)在30CFU～300CFU之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。5.3.2其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。5.3.3當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無(wú)明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。6.結(jié)果與報(bào)告6.1菌落總數(shù)的計(jì)算方法6.1.1若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。6.1.2若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按公式（1）計(jì)算：N=(1)式中：式中：N——樣品中菌落數(shù)；∑C——平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；n2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；d——稀釋因子（第一稀釋度）。示例：稀釋度1:100（第一稀釋度）1:1000（第二稀釋度）菌落數(shù)（CFU）232，24433，35N==24727上述數(shù)據(jù)按7.2.2數(shù)字修約后，表示為25000或2.5×104。6.1.3若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。6.1.4若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。6.1.5若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。6.1.6若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30CFU～300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU時(shí)，則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。6.2菌落總數(shù)的報(bào)告6.2.1菌落數(shù)小于100CFU時(shí)，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報(bào)告。6.2.2菌落數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約。后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來(lái)表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。6.2.3若所有平板上為蔓延菌落而無(wú)法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。6.2.4若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng)，則此次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。6.2.5稱(chēng)重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告。6.2.5稱(chēng)重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告。7.備注本方法參考國(guó)標(biāo)GB4789.2-2010。大腸菌群的測(cè)定（平板計(jì)數(shù)法）1.術(shù)語(yǔ)和定義大腸菌群的測(cè)定（平板計(jì)數(shù)法）1.術(shù)語(yǔ)和定義1.1大腸菌群coliforms在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。1.2最可能數(shù)mostprobablenumber，MPN基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法。2.設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：2.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。2.2冰箱：2℃～5℃。2.3烘箱。2.4天平：感量0.1g。2.5均質(zhì)器。2.6無(wú)菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。2.7無(wú)菌錐形瓶：容量500mL。2.8無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。2.9菌落計(jì)數(shù)器。3.培養(yǎng)基和試劑3.1結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VioletRedBileAgar，VRBA）。3.2煌綠乳糖膽鹽（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉湯。3.3無(wú)菌生理鹽水,0.85%。4.檢驗(yàn)程序大腸菌群平板計(jì)數(shù)法的檢驗(yàn)程序見(jiàn)下圖:↓36℃±1℃↓18-24h↓36℃±1℃↓24-48h5.操作步驟5.1樣品的稀釋5.1.1固體和半固體樣品：稱(chēng)取25g樣品,放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min，制成1:10的樣品勻液。5.1.2液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。5.1.3用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL生理鹽水的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無(wú)菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。5.1.4根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無(wú)菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過(guò)程不得超過(guò)15min。5.2平板計(jì)數(shù)5.2.1選取2個(gè)～3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度,每個(gè)稀釋度接種2個(gè)無(wú)菌平皿，每皿1mL。同時(shí)取1mL生理鹽水加入無(wú)菌平皿作空白對(duì)照。5.2.2及時(shí)將15mL～20mL冷至46同時(shí)取1mL生理鹽水加入無(wú)菌平皿作空白對(duì)照。5.2.2及時(shí)將15mL～20mL冷至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。5.3平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15CFU～150CFU之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周?chē)屑t色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。5.4證實(shí)試驗(yàn)從VRBA平板上挑取10個(gè)不同類(lèi)型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。5.5大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的試管比例乘以8.3中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g（mL）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽(yáng)性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。6.備注本方法參考國(guó)標(biāo)GB4789.3-2010。沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)1.設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：1.1冰箱：2℃～5℃。1.2恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃，42℃±1℃。1.3均質(zhì)器。1.4振蕩器。1.5電子天平：感量0.1g。1.6無(wú)菌錐形瓶:容量500mL，250mL。1.7無(wú)菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。1.8無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。1.9無(wú)菌試管：3mm×50mm、10mm×75mm。1.10全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。2.培養(yǎng)基和試劑2.1緩沖蛋白胨水（BPW）。2.2四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液。2.3亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液。2.4亞硫酸鉍（BS）瓊脂。2.5HE瓊脂。2.6木糖賴(lài)氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂。2.7沙門(mén)氏菌屬顯色培養(yǎng)基。2.8三糖鐵（TSI）瓊脂。2.9賴(lài)氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基。2.10生化鑒定試劑盒。3.培養(yǎng)基和試劑3.1緩沖蛋白胨水（bufferpeptonewater，BPW）：制法：稱(chēng)取20g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)PH至7.2±0.2，121℃高壓滅菌15min后取出。3.2四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液：制法：稱(chēng)取93.5g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)PH至7.2±0.2，121℃高壓滅菌20min后取出。臨用前按每100mL加入P-72碘液一支和P-730.1%煌綠一支，混勻后分裝。3.3亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液：制法：稱(chēng)取23g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)PH至7.0±0.2，加熱煮沸滅菌，不要過(guò)度加熱，定量分裝備用。3.4亞硫酸鉍（BS）瓊脂：制法：稱(chēng)取49.6g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)PH至7.5±0.1，加熱煮沸至完全溶解，冷卻至55℃左右，搖勻，傾注平板備用。臨用前一天配制。3.5HE瓊脂：制法：稱(chēng)取75.5g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)PH至7.5±0.2，加熱煮沸至完全溶解，冷卻至55℃左右，傾注平板備用。3.6木糖賴(lài)氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂：制法：稱(chēng)取58.9g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)PH至7.4±0.2，加熱煮沸至完全溶解，冷卻至55℃左右，傾注平板備用。不要過(guò)度加熱.3.7沙門(mén)氏菌屬顯色培養(yǎng)基：制法：稱(chēng)取34.9g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)PH至7.6±0.2，加熱煮沸滅菌，冷卻至55℃左右，搖勻后鋪制成平板備用。3.8三糖鐵（TSI）瓊脂：制法：稱(chēng)取63.4g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)PH至7.4±0.2，分裝（每4mL左右為一管），115℃高壓滅菌15min后取出，制成高層斜面?zhèn)溆谩?.9賴(lài)氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基：制法：稱(chēng)取1.9g于100mL蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)PH至6.8±0.2，分裝（每個(gè)小離心管裝0.5mL），115℃高壓滅菌10min后備用。3.10細(xì)菌微量生化鑒定管：3.10.1M007-氨基酸脫羧酶對(duì)照3.10.2M002-色氨酸肉湯3.10.3M036-尿素酶3.10.4M151-氰化鉀培養(yǎng)基3.10.5M152-氰化鉀培養(yǎng)基對(duì)照3.10.5M152-氰化鉀培養(yǎng)基對(duì)照3.10.6M016-β-半乳糖苷（ONPG）3.11沙門(mén)氏菌屬診斷血清A-F4操作步驟4.1前增菌4.1.1固體和液體：稱(chēng)取25g（mL）樣品放入盛有225mLBPW的均質(zhì)袋中，用手緩緩地?fù)u動(dòng)至充分溶解，于36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。4.1.2物體表面：將檢樣混勻后，于36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。4.2增菌輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)的樣品混合物，移取1mL，轉(zhuǎn)種于10mLTTB內(nèi)，于42℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。同時(shí)，另取1mL，轉(zhuǎn)種于10mLSC內(nèi)，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。4.3分離分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個(gè)BS瓊脂平板和一個(gè)XLD瓊脂平板（或HE瓊脂平板或沙門(mén)氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）。于36℃±1℃分別培養(yǎng)18h～24h（XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、沙門(mén)氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）或40h～48h（BS瓊脂平板），觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落,各個(gè)平板上的菌落特征見(jiàn)表1。表1沙門(mén)氏菌屬在不同命選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板沙門(mén)氏菌BS瓊脂菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周?chē)囵B(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周?chē)囵B(yǎng)基不變。HE瓊脂藍(lán)綠色或藍(lán)色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色；有些菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色。XLD瓊脂菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心。沙門(mén)氏菌屬顯色培養(yǎng)基菌落呈紫紅色或紫色。4.4生化鑒定4.4.1自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個(gè)以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌,直接接種賴(lài)氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基驗(yàn)培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基。同時(shí)，挑取可疑菌落接種于色氨酸（供做靛基質(zhì)試驗(yàn)）、尿素瓊脂、氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基、氰化鉀培養(yǎng)基對(duì)照和ONPG。于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48h，按表2、3判定結(jié)果。表2結(jié)果判定表試驗(yàn)項(xiàng)目陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果說(shuō)明三糖鐵黃色或紅色有黑色物質(zhì)產(chǎn)生穿刺不可穿透瓊脂至管底部。賴(lài)氨酸脫羧酶對(duì)照黃色對(duì)照黃色接種完可疑菌落后滴加3-4滴滅菌液體石蠟覆蓋液面。試驗(yàn)黃色試驗(yàn)紫色色氨酸黃色玫瑰紅色培養(yǎng)后滴加2-3滴靛基質(zhì)試劑，即刻觀察結(jié)果。尿素酶黃色或橙色玫瑰紅色或紅色氰化鉀對(duì)照生長(zhǎng)對(duì)照生長(zhǎng)接種完可疑菌落后滴加3-4滴滅菌液體石蠟覆蓋液面。試驗(yàn)不生長(zhǎng)試驗(yàn)生長(zhǎng)ONPG不變色黃色培養(yǎng)1-3h觀察結(jié)果，如為陰性繼續(xù)培養(yǎng)至24h.表3沙門(mén)氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒定表反應(yīng)序號(hào)硫化氫靛基質(zhì)pH7.2尿素氰化鉀賴(lài)氨酸脫羧酶A1+———+A2++——+A3————＋/－注：＋陽(yáng)性；－陰性；＋/－陽(yáng)性或陰性4.4.2.1反應(yīng)序號(hào)A1：典型反應(yīng)判定為沙門(mén)氏菌屬。如尿素、KCN和賴(lài)氨酸脫羧酶3項(xiàng)中有1項(xiàng)異常，按表4可判定為沙門(mén)氏菌。如有2項(xiàng)異常為非沙門(mén)氏菌。表4沙門(mén)氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒定表pH7.2尿素氰化鉀賴(lài)氨酸脫羧酶判定結(jié)果———甲型副傷寒沙門(mén)氏菌（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）—++沙門(mén)氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性）+—+沙門(mén)氏菌個(gè)別變體（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）注：＋表示陽(yáng)性；＋表示陰性4.4.2.24.4.2.2反應(yīng)序號(hào)A2：補(bǔ)做甘露醇和山梨醇試驗(yàn)，沙門(mén)氏菌靛基質(zhì)陽(yáng)性變體兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，但需要結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行判定。4.4.2.3反應(yīng)序號(hào)A3：ONPG陰性為沙門(mén)氏菌，同時(shí)賴(lài)氨酸脫羧酶陽(yáng)性；甲型副傷寒沙門(mén)氏菌為賴(lài)氨酸脫羧酶陰性。4.5血清學(xué)鑒定在清潔玻片上滴1滴血清，然后挑取1環(huán)待測(cè)菌與血清混勻，輕輕搖動(dòng)玻片，1分鐘內(nèi)肉眼判斷結(jié)果，試驗(yàn)應(yīng)以生理鹽水溶液作為陰性對(duì)照。于1分鐘內(nèi)呈明顯凝集者為陽(yáng)性，呈渾濁者為陰性。結(jié)果與報(bào)告綜合以上生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定的結(jié)果，報(bào)告25g（mL）樣品中檢出或未檢出沙門(mén)氏菌。注意事項(xiàng)6.1一般干粉培養(yǎng)基應(yīng)密封保存于陰涼干燥處，沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基制備好的平板于2～8℃避光保存，其他配制好的藥品無(wú)特殊要求可直接保存于冰箱中。6.2TTB增菌液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，不宜久置。沙門(mén)氏菌屬顯色培養(yǎng)基、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、HE瓊脂、木糖賴(lài)氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液均勿需高壓滅菌。6.3劃線接種時(shí)應(yīng)采用三區(qū)法劃線，并且接種針和接種環(huán)都必須滅菌徹底（連續(xù)灼燒三次）。前增菌以后的工作需在生物安全中進(jìn)行。6.4在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中若有菌液不慎灑出先用75%酒精棉球擦拭干凈，實(shí)驗(yàn)完后用3%甲酚皂溶液擦拭消毒。并應(yīng)定期對(duì)無(wú)菌室進(jìn)行清洗消毒。6.5所有安瓿瓶無(wú)需加蓋。對(duì)賴(lài)氨酸脫羧酶培養(yǎng)基、賴(lài)氨酸脫羧酶對(duì)照培養(yǎng)基、氰化鉀培養(yǎng)基和氰化鉀對(duì)照培養(yǎng)基在接種完菌落后需加液體石蠟2-3滴封口。6.6已經(jīng)開(kāi)袋的均質(zhì)袋應(yīng)保存于無(wú)菌室內(nèi)，并盡快使用，避免污染。6.7將已挑取菌落平板保存于2～5℃的冰箱內(nèi)，至少保留24h以備必要時(shí)復(fù)查。6.8廢棄的培養(yǎng)液和培養(yǎng)基需經(jīng)高壓滅菌鍋121℃滅菌30min后再?gòu)U棄或清洗。7.備注本方法參考國(guó)標(biāo)GB4789.4-2010。金黃色葡萄球菌的測(cè)定金黃色葡萄球菌的測(cè)定1設(shè)備和材料：除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：1.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。1.2冰箱：2℃～5℃。1.3恒溫水浴鍋：37℃～65℃。1.4天平：感量0.1g。1.5無(wú)菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）。1.6無(wú)菌均質(zhì)袋：尺寸180×320×0.091.7無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。1.8精密pH試紙。2培養(yǎng)基和試劑：下面所用培養(yǎng)基，如需調(diào)整pH值，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調(diào)2.17.5%氯化鈉肉湯：制法：稱(chēng)取7.5%氯化鈉肉湯90g于1L蒸餾水中，調(diào)pH值為7.4±0.2，121℃高壓滅菌15min后，冷卻后放入冰箱備用。2.2血瓊脂平板2.3Baird-Parker瓊脂平板：制法：稱(chēng)取63.0g于1L蒸餾水中，加熱煮佛至完全溶解，調(diào)pH值為7.0±0.2，121℃高壓滅菌15min后，冷至50℃時(shí)，每95ml加入1支亞碲酸鉀卵黃增菌液，混勻后傾注平板后放入冰箱備用。2.4腦心浸出液肉湯（BHI）：制法：稱(chēng)取24.5g于1L蒸餾水中，加熱煮佛至完全溶解，調(diào)pH值為7.4±0.2，分裝試管，每管5ml，121℃高壓滅菌15min備用。2.5CM304凍干兔血漿：用途：用于金黃色葡萄球菌的血漿凝固酶試驗(yàn)。用法：每支安瓿瓶中加入0.5ml滅菌生理鹽水，至完全溶解；然后，挑取可疑菌落溶入混勻或（加入0.3ml菌懸液混勻后），置36℃±1℃培養(yǎng)，在6h內(nèi)定時(shí)觀察結(jié)果。2.6革蘭氏染色液2.7無(wú)菌生理鹽水：。制法：稱(chēng)取8.5制法：稱(chēng)取8.5g氯化鈉溶于1000ml蒸餾水中，121℃高壓滅菌30min。3操作步驟3.1樣品的處理：3.1.1樣品：稱(chēng)取25g樣品置盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯的無(wú)菌均質(zhì)袋內(nèi)，混合均勻。3.2增菌和分離培養(yǎng)：3.2.1將上述樣品勻液于36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18h—24h。3.2.2將上述培養(yǎng)物，在生物安全柜內(nèi)分別用三區(qū)法劃線接種到Baird-Parker平板和血平板上，血平板36℃±1℃培養(yǎng)18h—24h，Baird-Parker平板36℃±1℃培養(yǎng)18h—24h或45h—48h。（使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25℃～50℃的培養(yǎng)箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。）3.3菌落形態(tài)：金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直徑為2mm—3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周?chē)鸀橐换鞚釒В谄渫鈱佑幸煌该魅?。用接種針接觸菌落有似奶油至樹(shù)膠樣的硬度，偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類(lèi)似菌落；但無(wú)混濁帶及透明圈。長(zhǎng)期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤(rùn)、金黃色（有時(shí)為白色），菌落周?chē)梢?jiàn)完全透明溶血圈。挑去上述菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。4鑒定：4.1染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌，排列呈葡萄球狀，無(wú)芽胞，無(wú)莢膜，直徑約為0.5m～1m。4.1.1染色流程：初染→媒染→脫色→復(fù)染→鏡檢。①取一干凈的載玻片，滴一滴蒸餾水，再向蒸餾水中挑取一環(huán)可疑菌落，涂抹均勻，將涂片面朝上在酒精燈上方稍微加熱，使其干燥；②初染：用結(jié)晶紫染色1min—2min后用蒸餾水沖洗至洗出液為無(wú)色再將涂片面朝上在酒精燈上方稍微加熱，使其干燥；③媒染：用碘液媒染約1min后用蒸餾水洗干凈再將涂片面朝上在酒精燈上方稍微加熱，使其干燥；④脫色：用95％乙醇脫色20s—30s后用蒸餾水洗干凈再將涂片面朝上在酒精燈上方稍微加熱，使其干燥；⑤⑤復(fù)染：用沙黃復(fù)染約2min左右后用蒸餾水洗干凈再將涂片面朝上在酒精燈上方稍微加熱，使其干燥；⑥鏡檢：最后在顯微鏡下用油鏡觀察，判斷菌體染色反應(yīng)性。4.2血漿凝固酶試驗(yàn)：挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1個(gè)或以上接種到5mLBHI中，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。取凍干兔血漿1支加入0.5mL滅菌生理鹽水，充分溶解，再加入BHI培養(yǎng)物0.2mL～0.3mL搖勻，置36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽(yáng)性結(jié)果。5結(jié)果與報(bào)告：5.1結(jié)果判定：符合4.3，5.1和5.2，可判定為金黃色葡萄球菌。5.2結(jié)果報(bào)告：在25g（mL）樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。6注意事項(xiàng)：6.1一般干粉培養(yǎng)基應(yīng)密封保存于陰涼干燥處，Baird-Parker傾到好的平板應(yīng)在48h內(nèi)使用。其他配制好的藥品無(wú)特殊要求可直接保存于冰箱中。6.2買(mǎi)來(lái)的血平板需放到冰箱中2℃—8℃避光冷藏存放。6.3劃線接種時(shí)，接種環(huán)燒紅為滅菌徹底。前增菌以后的工作需在生物安全柜中進(jìn)行。6.4在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中若有菌液不慎灑出先用75%酒精棉球擦拭干凈，實(shí)驗(yàn)完后用3%甲酚皂溶液擦拭消毒。并應(yīng)定期對(duì)無(wú)菌室進(jìn)行清洗消毒。6.5已經(jīng)開(kāi)袋的均質(zhì)袋應(yīng)保存于無(wú)菌室內(nèi)，并盡快使用，避免污染。6.6將已挑取菌落平板保存于2～5℃的冰箱內(nèi)，至少保留24h以備必要時(shí)復(fù)查。6.6廢棄的培養(yǎng)液和培養(yǎng)基需經(jīng)高壓滅菌鍋121℃滅菌30min后再?gòu)U棄或清洗。6.7脫色是革蘭染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，以免脫色不完全造成假陽(yáng)性；脫色過(guò)度，陽(yáng)性菌被誤染成陰性菌，脫色時(shí)間一般為20s—30s。7.備注本方法參考國(guó)標(biāo)GB4789.10-2010。阪崎腸桿菌的測(cè)定阪崎腸桿菌的測(cè)定1設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：1.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃，44℃±0.5℃，25℃±1℃，30℃±1℃。1.2冰箱：2℃～5℃。1.3恒溫水浴箱：44℃±0.5℃。1.4天平：感量0.1g。1.5無(wú)菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。1.6無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。1.7無(wú)菌錐形瓶：容量100mL、1000mL。1.8無(wú)菌均質(zhì)袋：尺寸180×320×0.091.9精密pH試紙。1.10接種環(huán)。1.11礦物油（液體石蠟）。1.12無(wú)菌吸管。1.13氧化酶測(cè)定試劑盒。1.14API20E試條。2培養(yǎng)基和試劑2.1緩沖蛋白胨水（bufferpeptonewater，BPW）：制法：稱(chēng)取20g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)PH至7.2±0.2，121℃高壓滅菌15min后取出。2.2改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)古霉素（modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycinmedium，mLST-Vm）：制法：稱(chēng)取64.6g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)PH至6.8±0.2，121℃高壓滅菌15min后取出。臨用前每100mL基礎(chǔ)無(wú)菌加入P-08B萬(wàn)古霉素1支，共配制3個(gè)100mL。2.3阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基：制法：稱(chēng)取45.33g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)PH至7.3±0.2（25℃），121℃高壓滅菌3min后取出，冷卻至50℃鋪制平板備用。2.42.4胰蛋白胨大豆瓊脂（trypticasesoyagar，TSA）：制法：稱(chēng)取38g于1L蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)PH至7.3±0.2，121℃高壓滅菌15min后取出，冷卻至50℃鋪制平板備用。2.5API20E試條2.60.85%氯化鈉培養(yǎng)基：制法：稱(chēng)取8.5g于1L蒸餾水中，121℃高壓滅菌30min.2.7無(wú)菌蒸餾水3操作步驟3.1前增菌3.1.1固體和液體：取三個(gè)檢樣各100g（mL）加入已預(yù)熱至44℃裝有900mL緩沖蛋白胨水的均質(zhì)袋中，用手緩緩地?fù)u動(dòng)至充分溶解，36℃±1℃培養(yǎng)18h±2h。3.1.2物體表面：將檢樣混勻后，于36℃±1℃培養(yǎng)18h±2h。3.2增菌3.2.1固體和液體：移取10mL轉(zhuǎn)種于100mLmLST-Vm肉湯，44℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。3.2.2物體表面：移取1mL轉(zhuǎn)種于10mLmLST-Vm肉湯，44℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。3.3分離3.3.1輕輕混勻mLST-Vm肉湯培養(yǎng)物，各取增菌培養(yǎng)物1環(huán)，分別劃線接種于兩個(gè)阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板，36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。3.3.2挑取1個(gè)～5個(gè)可疑菌落（藍(lán)綠色），劃線接種于TSA平板上。25℃±1℃培養(yǎng)18-24h用于氧化酶試驗(yàn)的測(cè)定，培養(yǎng)48h±4h用于生化鑒定中其他試驗(yàn)的測(cè)定。3.4鑒定3.4.1氧化酶試驗(yàn)（OX）：拿住安瓿瓶中間，輕按將安瓿瓶壓破，準(zhǔn)確加1滴試劑到空白紙片上（如稱(chēng)量紙），用無(wú)菌塑料吸管挑取TSA平板上黃色可疑菌落與紙片的試劑中，觀察結(jié)果，結(jié)果根據(jù)以下結(jié)果判讀表判讀。3.4.2API20E試條的接種：自TSA平板上直接挑取黃色可疑菌落與5mL0.85%氯化鈉培養(yǎng)基中制成菌懸液備用。在API20E培養(yǎng)盤(pán)中加入約5mL無(wú)菌蒸餾水與盤(pán)的蜂窩小凹中，造造成一個(gè)濕室。將試條置于盤(pán)中用無(wú)菌吸管加入菌懸液，其中：CIT、VP和GEL小管菌液需充滿(mǎn)管部和杯部，其它管僅充滿(mǎn)管部；在試驗(yàn)ADH、LDC、ODC、H2S、URE小杯內(nèi)加入礦物油以形成厭氧環(huán)境。蓋上培養(yǎng)盒，于36℃±2℃孵育18