植物基因工程課件

第六章植物基因工程第六章植物基因工程1第一節(jié)植物基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀第六章植物基因工程第一節(jié)植物基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀第六章植物基因工程2植物基因工程植物基因工程是以植物為受體的一種基因操作即以分子生物學(xué)為理論基礎(chǔ)，采用基因克隆、遺傳轉(zhuǎn)化（根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)法、基因槍法、原生質(zhì)體介導(dǎo)法等），以及細(xì)胞、組織培養(yǎng)技術(shù)將外源基因轉(zhuǎn)移并整合到受體植物的基因組中，并使其在后代植株中得以正確表達(dá)和穩(wěn)定遺傳，從而使受體獲得新性狀的技術(shù)體系。植物基因工程植物基因工程是以植物為受體的一種基因操作3轉(zhuǎn)基因植物的理論前景和意義通過將目的基因?qū)朕r(nóng)作物、園藝作物中，改變它們的遺傳特性，使植物免受病蟲的危害，或獲得抗除草劑的特性，或改變種子中淀粉、蛋白質(zhì)的含量和組成、或改變花的形狀和顏色，或改變植物的育性和不親合性以及改變植物的抗逆性等轉(zhuǎn)基因植物的理論前景和意義通過將目的基因?qū)朕r(nóng)作物、園藝作物4高等植物基因工程的發(fā)展歷程1983年美國和比利時(shí)科學(xué)家首次將外源基因?qū)霟煵莺秃}卜1994年世界上第一種耐儲(chǔ)藏的番茄在美國批準(zhǔn)上市1995年轉(zhuǎn)基因的抗蟲、抗除草劑的玉米和棉花在美國投入生產(chǎn)2000年美國轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積首次超過普通大豆迄今為止世界上共批準(zhǔn)了12種作物、6大類性狀的48個(gè)轉(zhuǎn)基因品種進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，其中包括水稻、玉米、馬鈴薯、小麥、黑麥、紅薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亞麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡蘿卜、黃瓜、蘆筍、苜蓿、草莓、木瓜、獼猴桃、越橘、茄子、梨、蘋果、葡萄等。高等植物基因工程的發(fā)展歷程1983年美國和比利時(shí)科學(xué)家5抗蟲轉(zhuǎn)基因植物抗蟲轉(zhuǎn)基因植物6抗病轉(zhuǎn)基因植物抗病轉(zhuǎn)基因植物7抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物8轉(zhuǎn)魚抗寒蛋白基因的番茄轉(zhuǎn)魚抗寒蛋白基因的番茄9轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒10利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)11提高觀賞價(jià)值提高觀賞價(jià)值12英國研究人員最近稱，新開發(fā)的紫色轉(zhuǎn)基因番茄中含有在深色漿果中常見的營養(yǎng)成分，并證明可以防止老鼠體內(nèi)的癌細(xì)胞蔓延。此項(xiàng)研究的重點(diǎn)是花青素，這種抗氧化劑存在于黑莓和黑醋栗等漿果中，被認(rèn)為具有降低癌癥、心臟病和某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病風(fēng)險(xiǎn)的作用。英國研究人員最近稱，新開發(fā)的紫色轉(zhuǎn)基因番茄中含有在深色漿果中13這種藍(lán)玫瑰是轉(zhuǎn)基因玫瑰，被植入三色紫羅蘭所含一種能刺激藍(lán)色素產(chǎn)生的基因，花瓣因而自然呈現(xiàn)藍(lán)色。藍(lán)玫瑰由日本三得利公司澳大利亞分支機(jī)構(gòu)研究培育。完成藍(lán)玫瑰在自然環(huán)境中的生長實(shí)驗(yàn)和研究后，三得利公司計(jì)劃明年秋季把藍(lán)玫瑰推向市場，預(yù)計(jì)市場規(guī)?？蛇_(dá)數(shù)百億日元。

這種藍(lán)玫瑰是轉(zhuǎn)基因玫瑰，被植入三色紫羅蘭所含一種能刺激藍(lán)色素14向小麥插入一種來自煙曲霉（Aspergillusfumigatus）的肌醇六磷酸酶基因，這種小麥的肌醇六磷酸酶最高可以在89攝氏度的時(shí)候保持穩(wěn)定。這種名為肌醇六磷酸酶（phytase，亦稱植酸酶）的酶可以幫助人體吸收鋅和鐵元素。向小麥插入一種來自煙曲霉（Aspergillusfumig15將細(xì)菌基因dhlA和dhlB插入轉(zhuǎn)基因煙草的基因組中，清除受污染土壤和地下水的鹵化有機(jī)污染物。將細(xì)菌基因dhlA和dhlB插入轉(zhuǎn)基因煙草的基因組中，清除受16轉(zhuǎn)基因植物可作為一種生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白和植物次生代謝產(chǎn)物，或生產(chǎn)某些有機(jī)化合物。轉(zhuǎn)基因植物為人們研究某一基因功能及其再生長發(fā)育中的作用提供了強(qiáng)有力的工具。轉(zhuǎn)基因植物可作為一種生物反應(yīng)器17第二節(jié)植物基因工程方法第六章植物基因工程第二節(jié)植物基因工程方法第六章植物基因工程18一原生質(zhì)體介導(dǎo)法概念：以原生質(zhì)體為受體，借助于特定的化學(xué)或物理手段將外源ＤＮＡ直接導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法。主要方法:1)PEG介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化2)脂質(zhì)體（liposome)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化3)電激法4)激光導(dǎo)入法5)顯微注射法一原生質(zhì)體介導(dǎo)法概念：191PEG介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化原理：利用化學(xué)試劑，如聚乙二醇（PEG）聚烯醇(細(xì)胞促融劑)等，誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNA分子，進(jìn)入原生質(zhì)體的外源DNA分子就有可能通過某種機(jī)制整合到基因組中，完成遺傳轉(zhuǎn)化過程。案例：轉(zhuǎn)基因煙草1PEG介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化原理：202脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化原理：利用脂類化學(xué)物質(zhì)包裹外源DNA成球體，通過植物原生質(zhì)體的吞噬或融合作用把包含外源DNA的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率高操作繁瑣技術(shù)性高2脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化原理：213電激法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化原理：利用高壓電脈沖作用，在原生質(zhì)體膜上“電激穿孔“，形成可逆的瞬間通道,從而促進(jìn)外源DNA進(jìn)入原生質(zhì)體。特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率高；操作簡便；容易造成原生質(zhì)體損傷。3電激法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化原理：22４顯微注射介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化原理：利用顯微注射儀將外源DNA直接注入受體的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移。優(yōu)點(diǎn)：方法簡單、轉(zhuǎn)化率高；純物理方法，適用于各種植物和材料，無局限性；對受體細(xì)胞無毒害，有利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長發(fā)育；培養(yǎng)過程無需特殊選擇系統(tǒng)。４顯微注射介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化原理：23５激光微束介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化原理：將激光引入光學(xué)顯微鏡聚焦成微米級的微束照射培養(yǎng)細(xì)胞，在細(xì)胞膜上形成能自我愈合的小孔，使加入細(xì)胞培養(yǎng)基里的外源DNA流入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便；工作效率高；無宿主限制，適應(yīng)于各種動(dòng)植物；對受體細(xì)胞生命活動(dòng)影響??；受體的類型廣泛；用于細(xì)胞器的基因轉(zhuǎn)化５激光微束介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化原理：24二基因槍法（微彈轟擊法）工作原理：將外源DNA包被在微小的金?；蜴u粒表面，然后在高壓的作用下將微粒高速射入受體細(xì)胞或組織，微粒上的外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后，整合到植物染色體上并得到表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)化。動(dòng)力類型：火藥爆炸力；高壓氣體；高壓放電二基因槍法（微彈轟擊法）工作原理：25操作步驟（1）制備DNA微彈；（2）準(zhǔn)備靶外植體材料；（3）DNA微彈轟擊；（4）培養(yǎng)轟擊后的外植體．操作步驟（1）制備DNA微彈；26轉(zhuǎn)化率影響因素 金屬微粒金粉顆粒較鎢粒性質(zhì)優(yōu)良,但是價(jià)格昂貴.DNA沉淀輔助劑這些化合物對DNA在微粒上的黏附有重要作用,但對植物受體細(xì)胞也產(chǎn)生一定的傷害.DNA純度及濃度微彈速度植物材料內(nèi)在因素轉(zhuǎn)化率影響因素 金屬微粒27三、根癌桿菌介導(dǎo)法根癌農(nóng)桿菌廣泛親染雙子葉植物和裸子植物。根據(jù)根癌農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物形成的根瘤中冠癭堿的不同可將根癌農(nóng)桿菌分為章魚堿型、胭脂堿型和農(nóng)桿堿型3種類型在根癌農(nóng)桿菌內(nèi)有一個(gè)大的致瘤質(zhì)粒，簡稱Ti質(zhì)粒。三、根癌桿菌介導(dǎo)法根癌農(nóng)桿菌廣泛親染雙子葉植物和裸子植物。28Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能Ti質(zhì)粒的圖譜整個(gè)質(zhì)粒160-240kb其中T-DNA12-24kbtms的編碼產(chǎn)物負(fù)責(zé)：合成吲哚乙酸t(yī)mr的編碼產(chǎn)物負(fù)責(zé)：合成植物分裂素tmt的編碼產(chǎn)物負(fù)責(zé)：合成氨基酸衍生物冠癭堿Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能Ti質(zhì)粒的圖譜整個(gè)質(zhì)粒160-29Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能Ti質(zhì)粒致瘤的分子機(jī)制損傷的植物根部會(huì)分泌出乙酰丁香酸和羥基乙酰丁香酸，它們能誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒上的vir基因以及根瘤菌染色體上的一個(gè)操縱子表達(dá)。vir基因產(chǎn)物將Ti質(zhì)粒上的T-DNA單鏈切下，而根瘤菌染色體上的操縱子表達(dá)產(chǎn)物則與單鏈T-DNA結(jié)合形成復(fù)合物，后者轉(zhuǎn)化植物根部細(xì)胞。Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能Ti質(zhì)粒致瘤的分子機(jī)制損傷的植物根部30Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能T-DNA的染色體整合機(jī)制Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能T-DNA的染色體整合機(jī)制31T-DNA的染色體整合機(jī)制Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能T-DNA的染色體整合機(jī)制Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能32Ti質(zhì)粒是植物基因工程的一種天然載體，但野生型Ti質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體存在著學(xué)多障礙：（1）質(zhì)粒過大，造作困難（2）大型的Ti質(zhì)粒有多個(gè)酶切位點(diǎn)（3）植物激素類的影響（4）Ti質(zhì)粒中存在不起作用的序列（5）Ti質(zhì)粒的局限性1Ti質(zhì)粒的改造策略Ti質(zhì)粒是植物基因工程的一種天然載體，但野生型Ti質(zhì)粒直接33Ti質(zhì)粒的改造除去T-DNA上的生長素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因?yàn)榇罅康纳L素和分裂素會(huì)抑止細(xì)胞再生長為整株植物；除去T-DNA上的有機(jī)堿生物合成基因（tmt）；因?yàn)橛袡C(jī)堿的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影響植物細(xì)胞的生長；安裝大腸桿菌復(fù)制子，使其能在大腸桿菌中復(fù)制，以利于克隆操作；安裝植物細(xì)胞的篩選標(biāo)記，如neor基因，使用植物基因的啟動(dòng)子和polyA信號序列；安裝多聚人工接頭以利于外源基因的克隆。除去Ti質(zhì)粒上的其它非必需序列，最大限度地縮短載體的長度；Ti質(zhì)粒的改造除去T-DNA上的生長素（tms）和分裂素（34共整合轉(zhuǎn)化程序共整合轉(zhuǎn)化程序35二元整合轉(zhuǎn)化程序?qū)⑼庠椿蚩寺≡诖竽c桿菌-農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒的T-DNA區(qū)內(nèi)；重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌株，該菌株攜帶只含vir區(qū)不含T-DNA區(qū)的Ti輔助質(zhì)粒；以上述重組農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞。二元整合轉(zhuǎn)化程序?qū)⑼庠椿蚩寺≡诖竽c桿菌-農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒的T362根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化的分子機(jī)理6個(gè)步驟：1）農(nóng)桿菌對受體的影響（2）農(nóng)桿菌附著到植物受體細(xì)胞（3）誘導(dǎo)啟動(dòng)毒性區(qū)基因表達(dá)（4）類似接合孔復(fù)合體的合成和裝配（5）T-DNA的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)（6）T-DNA的整合2根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化的分子機(jī)理373.T-DNA轉(zhuǎn)移的影響因素（1）農(nóng)桿菌菌株（2）農(nóng)桿菌菌株高侵染活力的生長時(shí)期（3）基因活化的誘導(dǎo)物（4）外植體的類型和生理狀態(tài)（5）外植體的預(yù)培養(yǎng)（6）外植體的接種及共培養(yǎng)3.T-DNA轉(zhuǎn)移的影響因素38基因槍法與根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)發(fā)的比較(1)基因槍法——多拷貝整合概率高，外源基因默表達(dá)農(nóng)桿菌介導(dǎo)——低拷貝整合（多為單拷貝整合）轉(zhuǎn)化效率較高。(2)基因槍法——純物理轉(zhuǎn)化，不存在物種的限制。農(nóng)桿菌介導(dǎo)——存在宿主范圍的局限性。(3)基因槍法適于以細(xì)胞器為轉(zhuǎn)化目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因研究?；驑尫ㄅc根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)發(fā)的比較(1)基因槍法——多拷39第三節(jié)轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的篩選第六章植物基因工程第三節(jié)轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的篩選第六章植物基因工程40當(dāng)采用某種轉(zhuǎn)基因方法處理外植體后，通常外植體中僅僅只有幾個(gè)少數(shù)細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化只有采取有效的轉(zhuǎn)化方法，才能提高準(zhǔn)確地選擇到轉(zhuǎn)化細(xì)胞。一般情況下，轉(zhuǎn)化載體上除了帶有目的基因外，大多還攜帶選擇基因，以供轉(zhuǎn)化細(xì)胞篩選使用。當(dāng)采用某種轉(zhuǎn)基因方法處理外植體后，通常外植體中僅僅只有幾個(gè)少41轉(zhuǎn)化篩選細(xì)胞的方法主要有兩種一是根據(jù)選擇基因的特點(diǎn)在篩選選擇培養(yǎng)基中加入能抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長的有毒物質(zhì)如抗生素、除草劑等），選擇基因通常為一種解毒基因，可以解除培養(yǎng)基中有害物質(zhì)對細(xì)胞生長的抑制作用，這樣只有轉(zhuǎn)化細(xì)胞才能生長繁殖；另一種方式是，受體細(xì)胞為營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞，在選擇性培養(yǎng)基中不能生殖，而選擇基因可以補(bǔ)償這種缺陷，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上正常生長。轉(zhuǎn)化篩選細(xì)胞的方法主要有兩種42一、植物基因工程中的選擇基因植物基因工程中的基因主要是一類編碼可使抗生素或除草劑失活的蛋白酶基因最常用的有新霉素抗性基因（neor）慶大霉素抗性基因（gentr）潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HTP）基因（hpt）以及膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）等一、植物基因工程中的選擇基因植物基因工程中的基因主要是一類編431、新霉素抗性基因（neor）新霉素抗性基因是從大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn5中分離的其對應(yīng)失活的選擇試劑為卡那霉素、新霉素和G418卡那霉素、新霉素可通過與核糖體小亞基結(jié)合抑制蛋白質(zhì)的合成，G418可通過抑制80S核糖體的功能而阻斷真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成新霉素抗性基因可使選擇試劑磷酸化而失效。1、新霉素抗性基因（neor）新霉素抗性基因是從大腸桿菌轉(zhuǎn)座442.慶大霉素抗性基因（gentr）該基因編碼一種乙酰轉(zhuǎn)移酶，屬抗生素標(biāo)記基因它通過對慶大霉素的乙?；蛊涫Щ?。該選擇系統(tǒng)目前也有一定的應(yīng)用，例如矮牛、煙草和番茄。2.慶大霉素抗性基因（gentr）該基因編碼一種乙酰轉(zhuǎn)移酶，453.潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HTP）基因（hpt）潮霉素是一種很強(qiáng)的細(xì)胞抑制劑，對許多植物都有很強(qiáng)的毒性。潮霉素林酸轉(zhuǎn)移酶可通過對潮霉素磷酸化而使其失活。3.潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HTP）基因（hpt）潮霉素是一種很強(qiáng)464.膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）膦絲菌素可抑制谷氨酰胺合成酶的活性，從而導(dǎo)致非轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生氨的致死性累積。膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）是從吸水鏈霉菌中克隆的一種基因4.膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）膦絲菌素可抑制谷氨酰胺合47二、報(bào)告基因報(bào)告基因是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測定、常用于判斷外源基因是夠成功地導(dǎo)入體細(xì)胞，是否啟動(dòng)表達(dá)的一類特殊用途的基因。它應(yīng)該不依賴于外界選擇壓力的存在，這一點(diǎn)也是它與選擇基因的區(qū)別之處。二、報(bào)告基因報(bào)告基因是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測定、常用于判斷48理想報(bào)告基因的基本要求：1、受體細(xì)胞不粗在相應(yīng)的內(nèi)源等位基因的活性。2、它的產(chǎn)物是唯一的，且不會(huì)損害受體細(xì)胞。3、具有快速、廉價(jià)、靈敏、定量和可重復(fù)性的檢測特性。理想報(bào)告基因的基本要求：49目前最常用的報(bào)告基因有：?-葡萄糖苷酸酶基因（gus）氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因3.熒光素酶基因目前最常用的報(bào)告基因有：50?-葡萄糖苷酸酶基因（gus）gus基因編碼?-葡萄糖苷酸酶存在于某些細(xì)菌體內(nèi)，該酶是一種水解酶，能催化許多?-葡萄糖苷酸類物質(zhì)的水解絕大多數(shù)的植物細(xì)胞內(nèi)不存在內(nèi)源的GUS活性，許多細(xì)菌及真菌也缺乏內(nèi)源GUS活性因而gus基因被廣泛應(yīng)用作轉(zhuǎn)基因植物、細(xì)菌和真菌的報(bào)告基因尤其是在研究外源基因瞬時(shí)表達(dá)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，gus基因應(yīng)用最多。?-葡萄糖苷酸酶基因（gus）gus基因編碼?-葡萄糖51氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因該基因來自大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn9它能夠催化乙?；鶊F(tuán)從乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移到氯霉素分子上，導(dǎo)致氯霉素分子發(fā)生乙?；饔?，從而使其失去活性。真核細(xì)胞中不含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，無該酶的內(nèi)源活性因而該基因可作為真核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的選擇基因及報(bào)告基因。氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因該基因來自大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn9523.熒光素酶基因該基因有很多種，它可以催化熒光素發(fā)出熒光熒光素是熒光素酶催化的底物總稱，不同熒光素的化學(xué)結(jié)構(gòu)有一定差異甚至完全不同。熒光素酶基因的活性檢測非常簡單直接將被檢的材料進(jìn)入加有熒光素和ATP的緩沖液中，置于暗室用肉眼直接觀察熒光，或覆蓋X-光膠片曝光，也也用熒光光度計(jì)定量檢測.3.熒光素酶基因該基因有很多種，它可以催化熒光素發(fā)出熒光53第四節(jié)轉(zhuǎn)化體的鑒定與證實(shí)第六章植物基因工程第四節(jié)轉(zhuǎn)化體的鑒定與證實(shí)第六章植物基因工程54轉(zhuǎn)化體的鑒定和證實(shí)的必要性為了驗(yàn)證外源基因整合到染色體.我們采用PCR技術(shù)Southern雜交技術(shù)為了驗(yàn)證外源基因是否表達(dá).我們采用RT-PCR技術(shù)Northern雜交技術(shù).Western雜交技術(shù)轉(zhuǎn)化體的鑒定和證實(shí)的必要性為了驗(yàn)證外源基因整合到染色體.55PCR檢測外源基因的整合通過設(shè)計(jì)外源基因兩端的特異引物采用PCR基因可以使外源基因得到大量擴(kuò)增然后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測特意擴(kuò)增帶的有無，從而判斷外源基因是否整合到受體植物的基因組。優(yōu)點(diǎn):由于對模板DNA的要求少，適合與轉(zhuǎn)基因體的早期檢測。缺點(diǎn):容易受到外界因素的干擾。PCR檢測外源基因的整合通過設(shè)計(jì)外源基因兩端的特異引物56Southern雜交檢測外源基因的整合原理:來源不同但具有互補(bǔ)序列的兩條多核苷酸鏈通過Waston-Crick堿基配對原則形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu).其中一條被標(biāo)記成為探針,探針與互補(bǔ)的核苷酸序列雜交,通過放射自顯影技術(shù)可以被檢測出來.雜交方式:Southern斑點(diǎn)雜交Southern印記雜交(最常用)Southern原位雜交Southern雜交檢測外源基因的整合原理:來源不同但具有互57RT-PCR檢測外源基因的表達(dá)適用范圍:外源基因在受體細(xì)胞是否轉(zhuǎn)錄的初步檢測.原理:以轉(zhuǎn)基因個(gè)體總RNA或mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,然后PCR擴(kuò)增,如果可以獲得特意的cRNA擴(kuò)增條帶,則表明外源基因?qū)崿F(xiàn)了轉(zhuǎn)錄.優(yōu)點(diǎn):簡單、快速，對mRNA抽提的數(shù)量和質(zhì)量都要求不高.RT-PCR檢測外源基因的表達(dá)適用范圍:外源基因在受體細(xì)胞是58Northern雜交檢測外源基因的表達(dá)與Southern的不同是:固體膜上轉(zhuǎn)移固定的是總RNA或mRNA.探針與膜上RNA形成RNA-DNA雜交雙鏈.通過放射自顯影的強(qiáng)度可以判斷外源基因的表達(dá)水平.分類:斑點(diǎn)雜交(假陽性率高.不常用)印跡雜交(比較常用)Northern雜交檢測外源基因的表達(dá)與Southern的59Western雜交檢測外源基因表達(dá)的產(chǎn)物適用范圍:檢測外源基因在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá).原理從轉(zhuǎn)基因材料中提取總蛋白或者目的蛋白，經(jīng)SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳把蛋白質(zhì)按分子大小分離，在轉(zhuǎn)移到固體膜上，然后加入特異抗體。膜上的目的蛋白與一抗結(jié)合，再加入帶標(biāo)記的二抗，最后通過二抗上的標(biāo)記物的性質(zhì)進(jìn)行檢測。Western雜交檢測外源基因表達(dá)的產(chǎn)物適用范圍:檢測外源基60第五節(jié)植物基因工程研究的

應(yīng)用和展望第六章植物基因工程第五節(jié)植物基因工程研究的

應(yīng)用和展望第六章植物基因工程61一抗性基因工程二植物品質(zhì)改良基因工程三植物雜種優(yōu)勢的利用四植物代謝工程一抗性基因工程62一抗性基因工程研究最早、技術(shù)最為成熟、應(yīng)用規(guī)模最大的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)1.抗蟲基因工程2.抗除草劑基因工程3.抗病基因工程4.抗逆基因工程一抗性基因工程研究最早、技術(shù)最為成熟、應(yīng)用規(guī)模最大的植物63二植物品質(zhì)改良基因工程1蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪品質(zhì)改良改良途徑⑴將編碼廣泛氨基酸組成或高含硫氨基酸的種子儲(chǔ)藏蛋白基因?qū)胫参铫茖⒛承┑鞍踪|(zhì)亞基基因?qū)胫参铫菍⑴c淀粉合成有關(guān)的基因?qū)胫参铫葘⑴c脂類合成有關(guān)的基因?qū)胫参?/p>

二植物品質(zhì)改良基因工程1蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪642果品的成熟品質(zhì)改良果品的貨架存放期直接影響商業(yè)價(jià)值,人們可以通過這個(gè)技術(shù)來改變果品成熟后的品質(zhì).3觀賞園藝植物的品質(zhì)改良2果品的成熟品質(zhì)改良65三植物雜種優(yōu)勢的利用關(guān)鍵選育穩(wěn)定遺傳的雄性不育系及其保持系和恢復(fù)系傳統(tǒng)育種在自然群體中鑒定基因工程方法采用特異性啟動(dòng)子與RNA酶基因構(gòu)建嵌合基因三植物雜種優(yōu)勢的利用關(guān)鍵66四植物代謝工程植物代謝工程的研究發(fā)展方向?yàn)檎陂_展的第二代植物基因工程。其中心是植物代謝工程重點(diǎn)在于改良植物品質(zhì)，增加營養(yǎng)，提高食物的醫(yī)療保健功能，或用做工業(yè)原料，增加農(nóng)副產(chǎn)品的附加值。四植物代謝工程植物代謝工程的研究發(fā)展方向?yàn)檎陂_展67重點(diǎn)植物基因工程的概念和發(fā)展現(xiàn)狀植物基因工程的方法重點(diǎn)植物基因工程的概念和發(fā)展現(xiàn)狀68第6章植物基因工程課件69高等植物的基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因的四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)外源基因的乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng)外源基因的地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)外源基因的類固醇誘導(dǎo)系統(tǒng)高等植物的基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因的四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)外源基因的乙醇70外源基因的四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)Tc-on型四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)TetR外源基因的四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)Tc-on型四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)TetR71外源基因的四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)Tc-on型四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)外源基因的四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)Tc-on型四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)72外源基因的四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)Tc-off型四環(huán)素阻遏系統(tǒng)CaMV35SPPlantnosttTA融合蛋白tetRtTA激活因子表達(dá)盒CaMV35SPPlantnost熒光蛋白編碼基因GFP四環(huán)素阻遏型報(bào)告基因表達(dá)盒tetVP16外源基因的四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)Tc-off型四環(huán)素阻遏系統(tǒng)CaMV73外源基因的四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)Tc-off型四環(huán)素阻遏系統(tǒng)CaMV35SPPlantnost熒光蛋白編碼基因GFPtetCaMV35SPPlantnost熒光蛋白編碼基因GFPtet四環(huán)素外源基因的四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)Tc-off型四環(huán)素阻遏系統(tǒng)CaMV74外源基因的乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng)CaMV35SPPlantnostAlcR巢曲霉菌alcR轉(zhuǎn)錄激活因子表達(dá)盒CaMV35SPPlantnost氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因CAT乙醇誘導(dǎo)型報(bào)告基因表達(dá)盒alcA啟動(dòng)子控制區(qū)alcA巢曲霉菌乙醇降解酶編碼基因

外源基因的乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng)CaMV35SPPlantnos75外源基因的乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng)CaMV35SPPlantnostAlcR巢曲霉菌alcR轉(zhuǎn)錄激活因子表達(dá)盒CaMV35SPPlantnost氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因CAT乙醇誘導(dǎo)型報(bào)告基因表達(dá)盒乙醇氯霉素抗性外源基因的乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng)CaMV35SPPlantnos76外源基因的地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)CaMV35SPPlantnosttTA融合蛋白YeastGal4tTA激活因子表達(dá)盒PlantPPlantnost熒光蛋白編碼基因GFP地塞米松誘導(dǎo)型報(bào)告基因表達(dá)盒Gal4結(jié)合區(qū)VP16地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)RatGR酵母轉(zhuǎn)錄因子Gal4大鼠激素受體蛋白單純皰疹病毒轉(zhuǎn)錄激活因子外源基因的地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)CaMV35SPPlantn77外源基因的地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)CaMV35SPPlantnosttTA融合蛋白YeastGal4VP16地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)RatGRPlantPPlantnost熒光蛋白編碼基因GFPGal4結(jié)合區(qū)地塞米松外源基因的地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)CaMV35SPPlantn78外源基因的地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)地塞米松誘導(dǎo)型四環(huán)素抑制型系統(tǒng)外源基因的地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)地塞米松誘導(dǎo)型四環(huán)素抑制型系統(tǒng)79外源基因的類固醇誘導(dǎo)系統(tǒng)雌激素誘導(dǎo)型的外源基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因的類固醇誘導(dǎo)系統(tǒng)雌激素誘導(dǎo)型的外源基因表達(dá)系統(tǒng)80外源基因的類固醇誘導(dǎo)系統(tǒng)蛻皮激素誘導(dǎo)型的外源基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因的類固醇誘導(dǎo)系統(tǒng)蛻皮激素誘導(dǎo)型的外源基因表達(dá)系統(tǒng)81第六章植物基因工程第六章植物基因工程82第一節(jié)植物基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀第六章植物基因工程第一節(jié)植物基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀第六章植物基因工程83植物基因工程植物基因工程是以植物為受體的一種基因操作即以分子生物學(xué)為理論基礎(chǔ)，采用基因克隆、遺傳轉(zhuǎn)化（根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)法、基因槍法、原生質(zhì)體介導(dǎo)法等），以及細(xì)胞、組織培養(yǎng)技術(shù)將外源基因轉(zhuǎn)移并整合到受體植物的基因組中，并使其在后代植株中得以正確表達(dá)和穩(wěn)定遺傳，從而使受體獲得新性狀的技術(shù)體系。植物基因工程植物基因工程是以植物為受體的一種基因操作84轉(zhuǎn)基因植物的理論前景和意義通過將目的基因?qū)朕r(nóng)作物、園藝作物中，改變它們的遺傳特性，使植物免受病蟲的危害，或獲得抗除草劑的特性，或改變種子中淀粉、蛋白質(zhì)的含量和組成、或改變花的形狀和顏色，或改變植物的育性和不親合性以及改變植物的抗逆性等轉(zhuǎn)基因植物的理論前景和意義通過將目的基因?qū)朕r(nóng)作物、園藝作物85高等植物基因工程的發(fā)展歷程1983年美國和比利時(shí)科學(xué)家首次將外源基因?qū)霟煵莺秃}卜1994年世界上第一種耐儲(chǔ)藏的番茄在美國批準(zhǔn)上市1995年轉(zhuǎn)基因的抗蟲、抗除草劑的玉米和棉花在美國投入生產(chǎn)2000年美國轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積首次超過普通大豆迄今為止世界上共批準(zhǔn)了12種作物、6大類性狀的48個(gè)轉(zhuǎn)基因品種進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，其中包括水稻、玉米、馬鈴薯、小麥、黑麥、紅薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亞麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡蘿卜、黃瓜、蘆筍、苜蓿、草莓、木瓜、獼猴桃、越橘、茄子、梨、蘋果、葡萄等。高等植物基因工程的發(fā)展歷程1983年美國和比利時(shí)科學(xué)家86抗蟲轉(zhuǎn)基因植物抗蟲轉(zhuǎn)基因植物87抗病轉(zhuǎn)基因植物抗病轉(zhuǎn)基因植物88抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物89轉(zhuǎn)魚抗寒蛋白基因的番茄轉(zhuǎn)魚抗寒蛋白基因的番茄90轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒91利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)92提高觀賞價(jià)值提高觀賞價(jià)值93英國研究人員最近稱，新開發(fā)的紫色轉(zhuǎn)基因番茄中含有在深色漿果中常見的營養(yǎng)成分，并證明可以防止老鼠體內(nèi)的癌細(xì)胞蔓延。此項(xiàng)研究的重點(diǎn)是花青素，這種抗氧化劑存在于黑莓和黑醋栗等漿果中，被認(rèn)為具有降低癌癥、心臟病和某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病風(fēng)險(xiǎn)的作用。英國研究人員最近稱，新開發(fā)的紫色轉(zhuǎn)基因番茄中含有在深色漿果中94這種藍(lán)玫瑰是轉(zhuǎn)基因玫瑰，被植入三色紫羅蘭所含一種能刺激藍(lán)色素產(chǎn)生的基因，花瓣因而自然呈現(xiàn)藍(lán)色。藍(lán)玫瑰由日本三得利公司澳大利亞分支機(jī)構(gòu)研究培育。完成藍(lán)玫瑰在自然環(huán)境中的生長實(shí)驗(yàn)和研究后，三得利公司計(jì)劃明年秋季把藍(lán)玫瑰推向市場，預(yù)計(jì)市場規(guī)?？蛇_(dá)數(shù)百億日元。

這種藍(lán)玫瑰是轉(zhuǎn)基因玫瑰，被植入三色紫羅蘭所含一種能刺激藍(lán)色素95向小麥插入一種來自煙曲霉（Aspergillusfumigatus）的肌醇六磷酸酶基因，這種小麥的肌醇六磷酸酶最高可以在89攝氏度的時(shí)候保持穩(wěn)定。這種名為肌醇六磷酸酶（phytase，亦稱植酸酶）的酶可以幫助人體吸收鋅和鐵元素。向小麥插入一種來自煙曲霉（Aspergillusfumig96將細(xì)菌基因dhlA和dhlB插入轉(zhuǎn)基因煙草的基因組中，清除受污染土壤和地下水的鹵化有機(jī)污染物。將細(xì)菌基因dhlA和dhlB插入轉(zhuǎn)基因煙草的基因組中，清除受97轉(zhuǎn)基因植物可作為一種生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白和植物次生代謝產(chǎn)物，或生產(chǎn)某些有機(jī)化合物。轉(zhuǎn)基因植物為人們研究某一基因功能及其再生長發(fā)育中的作用提供了強(qiáng)有力的工具。轉(zhuǎn)基因植物可作為一種生物反應(yīng)器98第二節(jié)植物基因工程方法第六章植物基因工程第二節(jié)植物基因工程方法第六章植物基因工程99一原生質(zhì)體介導(dǎo)法概念：以原生質(zhì)體為受體，借助于特定的化學(xué)或物理手段將外源ＤＮＡ直接導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法。主要方法:1)PEG介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化2)脂質(zhì)體（liposome)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化3)電激法4)激光導(dǎo)入法5)顯微注射法一原生質(zhì)體介導(dǎo)法概念：1001PEG介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化原理：利用化學(xué)試劑，如聚乙二醇（PEG）聚烯醇(細(xì)胞促融劑)等，誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNA分子，進(jìn)入原生質(zhì)體的外源DNA分子就有可能通過某種機(jī)制整合到基因組中，完成遺傳轉(zhuǎn)化過程。案例：轉(zhuǎn)基因煙草1PEG介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化原理：1012脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化原理：利用脂類化學(xué)物質(zhì)包裹外源DNA成球體，通過植物原生質(zhì)體的吞噬或融合作用把包含外源DNA的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率高操作繁瑣技術(shù)性高2脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化原理：1023電激法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化原理：利用高壓電脈沖作用，在原生質(zhì)體膜上“電激穿孔“，形成可逆的瞬間通道,從而促進(jìn)外源DNA進(jìn)入原生質(zhì)體。特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率高；操作簡便；容易造成原生質(zhì)體損傷。3電激法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化原理：103４顯微注射介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化原理：利用顯微注射儀將外源DNA直接注入受體的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移。優(yōu)點(diǎn)：方法簡單、轉(zhuǎn)化率高；純物理方法，適用于各種植物和材料，無局限性；對受體細(xì)胞無毒害，有利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長發(fā)育；培養(yǎng)過程無需特殊選擇系統(tǒng)。４顯微注射介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化原理：104５激光微束介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化原理：將激光引入光學(xué)顯微鏡聚焦成微米級的微束照射培養(yǎng)細(xì)胞，在細(xì)胞膜上形成能自我愈合的小孔，使加入細(xì)胞培養(yǎng)基里的外源DNA流入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便；工作效率高；無宿主限制，適應(yīng)于各種動(dòng)植物；對受體細(xì)胞生命活動(dòng)影響?。皇荏w的類型廣泛；用于細(xì)胞器的基因轉(zhuǎn)化５激光微束介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化原理：105二基因槍法（微彈轟擊法）工作原理：將外源DNA包被在微小的金粒或鎢粒表面，然后在高壓的作用下將微粒高速射入受體細(xì)胞或組織，微粒上的外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后，整合到植物染色體上并得到表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)化。動(dòng)力類型：火藥爆炸力；高壓氣體；高壓放電二基因槍法（微彈轟擊法）工作原理：106操作步驟（1）制備DNA微彈；（2）準(zhǔn)備靶外植體材料；（3）DNA微彈轟擊；（4）培養(yǎng)轟擊后的外植體．操作步驟（1）制備DNA微彈；107轉(zhuǎn)化率影響因素 金屬微粒金粉顆粒較鎢粒性質(zhì)優(yōu)良,但是價(jià)格昂貴.DNA沉淀輔助劑這些化合物對DNA在微粒上的黏附有重要作用,但對植物受體細(xì)胞也產(chǎn)生一定的傷害.DNA純度及濃度微彈速度植物材料內(nèi)在因素轉(zhuǎn)化率影響因素 金屬微粒108三、根癌桿菌介導(dǎo)法根癌農(nóng)桿菌廣泛親染雙子葉植物和裸子植物。根據(jù)根癌農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物形成的根瘤中冠癭堿的不同可將根癌農(nóng)桿菌分為章魚堿型、胭脂堿型和農(nóng)桿堿型3種類型在根癌農(nóng)桿菌內(nèi)有一個(gè)大的致瘤質(zhì)粒，簡稱Ti質(zhì)粒。三、根癌桿菌介導(dǎo)法根癌農(nóng)桿菌廣泛親染雙子葉植物和裸子植物。109Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能Ti質(zhì)粒的圖譜整個(gè)質(zhì)粒160-240kb其中T-DNA12-24kbtms的編碼產(chǎn)物負(fù)責(zé)：合成吲哚乙酸t(yī)mr的編碼產(chǎn)物負(fù)責(zé)：合成植物分裂素tmt的編碼產(chǎn)物負(fù)責(zé)：合成氨基酸衍生物冠癭堿Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能Ti質(zhì)粒的圖譜整個(gè)質(zhì)粒160-110Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能Ti質(zhì)粒致瘤的分子機(jī)制損傷的植物根部會(huì)分泌出乙酰丁香酸和羥基乙酰丁香酸，它們能誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒上的vir基因以及根瘤菌染色體上的一個(gè)操縱子表達(dá)。vir基因產(chǎn)物將Ti質(zhì)粒上的T-DNA單鏈切下，而根瘤菌染色體上的操縱子表達(dá)產(chǎn)物則與單鏈T-DNA結(jié)合形成復(fù)合物，后者轉(zhuǎn)化植物根部細(xì)胞。Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能Ti質(zhì)粒致瘤的分子機(jī)制損傷的植物根部111Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能T-DNA的染色體整合機(jī)制Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能T-DNA的染色體整合機(jī)制112T-DNA的染色體整合機(jī)制Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能T-DNA的染色體整合機(jī)制Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能113Ti質(zhì)粒是植物基因工程的一種天然載體，但野生型Ti質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體存在著學(xué)多障礙：（1）質(zhì)粒過大，造作困難（2）大型的Ti質(zhì)粒有多個(gè)酶切位點(diǎn)（3）植物激素類的影響（4）Ti質(zhì)粒中存在不起作用的序列（5）Ti質(zhì)粒的局限性1Ti質(zhì)粒的改造策略Ti質(zhì)粒是植物基因工程的一種天然載體，但野生型Ti質(zhì)粒直接114Ti質(zhì)粒的改造除去T-DNA上的生長素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因?yàn)榇罅康纳L素和分裂素會(huì)抑止細(xì)胞再生長為整株植物；除去T-DNA上的有機(jī)堿生物合成基因（tmt）；因?yàn)橛袡C(jī)堿的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影響植物細(xì)胞的生長；安裝大腸桿菌復(fù)制子，使其能在大腸桿菌中復(fù)制，以利于克隆操作；安裝植物細(xì)胞的篩選標(biāo)記，如neor基因，使用植物基因的啟動(dòng)子和polyA信號序列；安裝多聚人工接頭以利于外源基因的克隆。除去Ti質(zhì)粒上的其它非必需序列，最大限度地縮短載體的長度；Ti質(zhì)粒的改造除去T-DNA上的生長素（tms）和分裂素（115共整合轉(zhuǎn)化程序共整合轉(zhuǎn)化程序116二元整合轉(zhuǎn)化程序?qū)⑼庠椿蚩寺≡诖竽c桿菌-農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒的T-DNA區(qū)內(nèi)；重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌株，該菌株攜帶只含vir區(qū)不含T-DNA區(qū)的Ti輔助質(zhì)粒；以上述重組農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞。二元整合轉(zhuǎn)化程序?qū)⑼庠椿蚩寺≡诖竽c桿菌-農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒的T1172根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化的分子機(jī)理6個(gè)步驟：1）農(nóng)桿菌對受體的影響（2）農(nóng)桿菌附著到植物受體細(xì)胞（3）誘導(dǎo)啟動(dòng)毒性區(qū)基因表達(dá)（4）類似接合孔復(fù)合體的合成和裝配（5）T-DNA的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)（6）T-DNA的整合2根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化的分子機(jī)理1183.T-DNA轉(zhuǎn)移的影響因素（1）農(nóng)桿菌菌株（2）農(nóng)桿菌菌株高侵染活力的生長時(shí)期（3）基因活化的誘導(dǎo)物（4）外植體的類型和生理狀態(tài)（5）外植體的預(yù)培養(yǎng)（6）外植體的接種及共培養(yǎng)3.T-DNA轉(zhuǎn)移的影響因素119基因槍法與根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)發(fā)的比較(1)基因槍法——多拷貝整合概率高，外源基因默表達(dá)農(nóng)桿菌介導(dǎo)——低拷貝整合（多為單拷貝整合）轉(zhuǎn)化效率較高。(2)基因槍法——純物理轉(zhuǎn)化，不存在物種的限制。農(nóng)桿菌介導(dǎo)——存在宿主范圍的局限性。(3)基因槍法適于以細(xì)胞器為轉(zhuǎn)化目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因研究?；驑尫ㄅc根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)發(fā)的比較(1)基因槍法——多拷120第三節(jié)轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的篩選第六章植物基因工程第三節(jié)轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的篩選第六章植物基因工程121當(dāng)采用某種轉(zhuǎn)基因方法處理外植體后，通常外植體中僅僅只有幾個(gè)少數(shù)細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化只有采取有效的轉(zhuǎn)化方法，才能提高準(zhǔn)確地選擇到轉(zhuǎn)化細(xì)胞。一般情況下，轉(zhuǎn)化載體上除了帶有目的基因外，大多還攜帶選擇基因，以供轉(zhuǎn)化細(xì)胞篩選使用。當(dāng)采用某種轉(zhuǎn)基因方法處理外植體后，通常外植體中僅僅只有幾個(gè)少122轉(zhuǎn)化篩選細(xì)胞的方法主要有兩種一是根據(jù)選擇基因的特點(diǎn)在篩選選擇培養(yǎng)基中加入能抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長的有毒物質(zhì)如抗生素、除草劑等），選擇基因通常為一種解毒基因，可以解除培養(yǎng)基中有害物質(zhì)對細(xì)胞生長的抑制作用，這樣只有轉(zhuǎn)化細(xì)胞才能生長繁殖；另一種方式是，受體細(xì)胞為營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞，在選擇性培養(yǎng)基中不能生殖，而選擇基因可以補(bǔ)償這種缺陷，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上正常生長。轉(zhuǎn)化篩選細(xì)胞的方法主要有兩種123一、植物基因工程中的選擇基因植物基因工程中的基因主要是一類編碼可使抗生素或除草劑失活的蛋白酶基因最常用的有新霉素抗性基因（neor）慶大霉素抗性基因（gentr）潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HTP）基因（hpt）以及膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）等一、植物基因工程中的選擇基因植物基因工程中的基因主要是一類編1241、新霉素抗性基因（neor）新霉素抗性基因是從大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn5中分離的其對應(yīng)失活的選擇試劑為卡那霉素、新霉素和G418卡那霉素、新霉素可通過與核糖體小亞基結(jié)合抑制蛋白質(zhì)的合成，G418可通過抑制80S核糖體的功能而阻斷真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成新霉素抗性基因可使選擇試劑磷酸化而失效。1、新霉素抗性基因（neor）新霉素抗性基因是從大腸桿菌轉(zhuǎn)座1252.慶大霉素抗性基因（gentr）該基因編碼一種乙酰轉(zhuǎn)移酶，屬抗生素標(biāo)記基因它通過對慶大霉素的乙酰化而使其失活。該選擇系統(tǒng)目前也有一定的應(yīng)用，例如矮牛、煙草和番茄。2.慶大霉素抗性基因（gentr）該基因編碼一種乙酰轉(zhuǎn)移酶，1263.潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HTP）基因（hpt）潮霉素是一種很強(qiáng)的細(xì)胞抑制劑，對許多植物都有很強(qiáng)的毒性。潮霉素林酸轉(zhuǎn)移酶可通過對潮霉素磷酸化而使其失活。3.潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HTP）基因（hpt）潮霉素是一種很強(qiáng)1274.膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）膦絲菌素可抑制谷氨酰胺合成酶的活性，從而導(dǎo)致非轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生氨的致死性累積。膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）是從吸水鏈霉菌中克隆的一種基因4.膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）膦絲菌素可抑制谷氨酰胺合128二、報(bào)告基因報(bào)告基因是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測定、常用于判斷外源基因是夠成功地導(dǎo)入體細(xì)胞，是否啟動(dòng)表達(dá)的一類特殊用途的基因。它應(yīng)該不依賴于外界選擇壓力的存在，這一點(diǎn)也是它與選擇基因的區(qū)別之處。二、報(bào)告基因報(bào)告基因是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測定、常用于判斷129理想報(bào)告基因的基本要求：1、受體細(xì)胞不粗在相應(yīng)的內(nèi)源等位基因的活性。2、它的產(chǎn)物是唯一的，且不會(huì)損害受體細(xì)胞。3、具有快速、廉價(jià)、靈敏、定量和可重復(fù)性的檢測特性。理想報(bào)告基因的基本要求：130目前最常用的報(bào)告基因有：?-葡萄糖苷酸酶基因（gus）氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因3.熒光素酶基因目前最常用的報(bào)告基因有：131?-葡萄糖苷酸酶基因（gus）gus基因編碼?-葡萄糖苷酸酶存在于某些細(xì)菌體內(nèi)，該酶是一種水解酶，能催化許多?-葡萄糖苷酸類物質(zhì)的水解絕大多數(shù)的植物細(xì)胞內(nèi)不存在內(nèi)源的GUS活性，許多細(xì)菌及真菌也缺乏內(nèi)源GUS活性因而gus基因被廣泛應(yīng)用作轉(zhuǎn)基因植物、細(xì)菌和真菌的報(bào)告基因尤其是在研究外源基因瞬時(shí)表達(dá)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，gus基因應(yīng)用最多。?-葡萄糖苷酸酶基因（gus）gus基因編碼?-葡萄糖132氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因該基因來自大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn9它能夠催化乙?；鶊F(tuán)從乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移到氯霉素分子上，導(dǎo)致氯霉素分子發(fā)生乙?；饔茫瑥亩蛊涫セ钚?。真核細(xì)胞中不含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，無該酶的內(nèi)源活性因而該基因可作為真核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的選擇基因及報(bào)告基因。氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因該基因來自大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn91333.熒光素酶基因該基因有很多種，它可以催化熒光素發(fā)出熒光熒光素是熒光素酶催化的底物總稱，不同熒光素的化學(xué)結(jié)構(gòu)有一定差異甚至完全不同。熒光素酶基因的活性檢測非常簡單直接將被檢的材料進(jìn)入加有熒光素和ATP的緩沖液中，置于暗室用肉眼直接觀察熒光，或覆蓋X-光膠片曝光，也也用熒光光度計(jì)定量檢測.3.熒光素酶基因該基因有很多種，它可以催化熒光素發(fā)出熒光134第四節(jié)轉(zhuǎn)化體的鑒定與證實(shí)第六章植物基因工程第四節(jié)轉(zhuǎn)化體的鑒定與證實(shí)第六章植物基因工程135轉(zhuǎn)化體的鑒定和證實(shí)的必要性為了驗(yàn)證外源基因整合到染色體.我們采用PCR技術(shù)Southern雜交技術(shù)為了驗(yàn)證外源基因是否表達(dá).我們采用RT-PCR技術(shù)Northern雜交技術(shù).Western雜交技術(shù)轉(zhuǎn)化體的鑒定和證實(shí)的必要性為了驗(yàn)證外源基因整合到染色體.136PCR檢測外源基因的整合通過設(shè)計(jì)外源基因兩端的特異引物采用PCR基因可以使外源基因得到大量擴(kuò)增然后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測特意擴(kuò)增帶的有無，從而判斷外源基因是否整合到受體植物的基因組。優(yōu)點(diǎn):由于對模板DNA的要求少，適合與轉(zhuǎn)基因體的早期檢測。缺點(diǎn):容易受到外界因素的干擾。PCR檢測外源基因的整合通過設(shè)計(jì)外源基因兩端的特異引物137Southern雜交檢測外源基因的整合原理:來源不同但具有互補(bǔ)序列的兩條多核苷酸鏈通過Waston-Crick堿基配對原則形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu).其中一條被標(biāo)記成為探針,探針與互補(bǔ)的核苷酸序列雜交,通過放射自顯影技術(shù)可以被檢測出來.雜交方式:Southern斑點(diǎn)雜交Southern印記雜交(最常用)Southern原位雜交Southern雜交檢測外源基因的整合原理:來源不同但具有互138RT-PCR檢測外源基因的表達(dá)適用范圍:外源基因在受體細(xì)胞是否轉(zhuǎn)錄的初步檢測.原理:以轉(zhuǎn)基因個(gè)體總RNA或mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,然后PCR擴(kuò)增,如果可以獲得特意的cRNA擴(kuò)增條帶,則表明外源基因?qū)崿F(xiàn)了轉(zhuǎn)錄.優(yōu)點(diǎn):簡單、快速，對mRNA抽提的數(shù)量和質(zhì)量都要求不高.RT-PCR檢測外源基因的表達(dá)適用范圍:外源基因在受體細(xì)胞是139Northern雜交檢測外源基因的表達(dá)與Southern的不同是:固體膜上轉(zhuǎn)移固定的是總RNA或mRNA.探針與膜上RNA形成RNA-DNA雜交雙鏈.通過放射自顯影的強(qiáng)度可以判斷外源基因的表達(dá)水平.分類:斑點(diǎn)雜交(假陽性率高.不常用)印跡雜交(比較常用)Northern雜交檢測外源基因的表達(dá)與Southern的140Western雜交檢測外源基因表達(dá)的產(chǎn)物適用范圍:檢測外源基因在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá).原理從轉(zhuǎn)基因材料中提取總蛋白或者目的蛋白，經(jīng)SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳把蛋白質(zhì)按分子大小分離，在轉(zhuǎn)移到固體膜上，然后加入特異抗體。膜上的目的蛋白與一抗結(jié)合，再加入帶標(biāo)記的二抗，最后通過二抗上的標(biāo)記物的性質(zhì)進(jìn)行檢測。Western雜交檢測外源基因表達(dá)的產(chǎn)物適用范圍:檢測外源基141第五節(jié)植物基因工程研究的

應(yīng)用和展望第六章植物基因工程第五節(jié)植物基因工程研究的

應(yīng)用和展望第六章植物基因工程142一抗性基因工程二植物品質(zhì)改良基因工程三植物雜種優(yōu)勢的利用四植物代謝工程一抗性基因工程143一抗性基因工程研究最早、技術(shù)最為成熟、應(yīng)用規(guī)模最大的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)1.抗蟲基因工程2.抗除草劑基因工程3.抗病基因工程4.抗逆基因工程一抗性基因工程研究最早、技術(shù)最為成熟、應(yīng)用規(guī)模最大的植物144二植物品質(zhì)改良基因工程1蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪品質(zhì)改良改良途徑⑴