動物基因工程課件

第十一章動物基因工程基因工程的概念：利用DNA體外重組或PCR擴(kuò)增技術(shù)從某種生物基因組中分離感興趣的基因，或是用人工合成的方法獲取基因，然后經(jīng)過一系列切割，加工修飾，連接反應(yīng)形成重組DNA分子，再將其轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞，以期獲得基因表達(dá)的過程.第十一章動物基因工程基因工程的概念：1基因工程(geneengineering)常和以下名稱混用遺傳工程(geneticengineering);基因克隆(genecloning);分子克隆(molecularcloning);基因操作(genemanipulation);重組DNA技術(shù)(recombinationDNAtechnique)克隆(clone):作名詞時(shí)指含有某目的DNA片段的重組DNA分子或含有該重組分子的無性繁殖系.作動詞時(shí)是指基因的分離與重組過程。基因工程(geneengineering)常和以下名稱混用2第一節(jié)基因工程的發(fā)展歷程1973Cohen第一例成功的克隆實(shí)驗(yàn)1978Genentech公司人胰島素世界上第一種基因工程蛋白藥物

1982第一個基因工程藥物--重組人胰島素在英、美獲準(zhǔn)使用

1985第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國轉(zhuǎn)基因魚

第一節(jié)基因工程的發(fā)展歷程1973Cohen第一例成功的克31993

基因工程西紅柿在美國上市1997

英國羅斯林研究所多莉羊1993基因工程西紅柿在美國上市4耐農(nóng)藥/抗蟲能力

(第一代)Bt抗蟲玉米傳統(tǒng)玉米簡介4

(InputTraits)Source:Monsanto耐農(nóng)藥/抗蟲能力(第一代)Bt抗蟲玉米傳統(tǒng)玉米簡介45黃金米可以防治維生素A缺乏癥成為健康食品改變營養(yǎng)組成

(第二代)5(OutputTraits)黃金米可以防治維生素A缺乏癥成為健康食品改變營養(yǎng)組成(第二6世界轉(zhuǎn)基因作物大田釋放情況

(1987.1-1998.4)轉(zhuǎn)基因作物特性批準(zhǔn)項(xiàng)數(shù)所占比例抗除草劑129729.6%抗蟲104623.8%提高產(chǎn)品質(zhì)量88620.2%抗病毒4369.9%改善農(nóng)學(xué)性狀2114.8%抗真菌病2084.7%其他3036.9%總計(jì)4387100%世界轉(zhuǎn)基因作物大田釋放情況

(1987.1-1998.4)轉(zhuǎn)7轉(zhuǎn)基因作物種植面積轉(zhuǎn)基因作物種植面積8[複製人!和我有什麼關(guān)係]陳文君著泛亞2001好好吃的樣子我也想吃!生產(chǎn)醫(yī)藥及工業(yè)用

(第三代)6(OutputTraits)[複製人!和我有什麼關(guān)係]陳文君著泛亞2001好好吃9胰島素分子結(jié)構(gòu)胰島素是治療糖尿病的特效藥，長期以來只能依靠從豬、牛等動物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素，其產(chǎn)量之低和價(jià)格之高可想而知。胰島素分子結(jié)構(gòu)胰島素是治療糖尿病的特效藥，長期以來只能依靠從10將合成的胰島素基因?qū)氪竽c桿菌，每2000L培養(yǎng)液就能產(chǎn)生100g胰島素！大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)不但解決了這種比黃金還貴的藥品產(chǎn)量問題，還使其價(jià)格降低了30%-50%!胰島素生產(chǎn)車間將合成的胰島素基因?qū)氪竽c桿菌，每2000L培養(yǎng)液就能產(chǎn)生111帶有人生長激素基因的轉(zhuǎn)基因小鼠正常小鼠1982年:“超級鼠”帶有人生長激素基因的正常小鼠1982年:“超級鼠”12干擾素治療病毒感染簡直是“萬能靈藥”！過去從人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍貴”程度自不用多說。干擾素生產(chǎn)車間干擾素分子結(jié)構(gòu)干擾素治療病毒感染簡直是“萬能靈藥”！過去從人血中提取，3013基因工程人干擾素α-2b（安達(dá)芬）是我國第一個全國產(chǎn)化基因工程人干擾素α-2b，具有抗病毒，抑制腫瘤細(xì)胞增生，調(diào)節(jié)人體免疫功能的作用，廣泛用于病毒性疾病治療和多種腫瘤的治療，是當(dāng)前國際公認(rèn)的病毒性疾病治療的首選藥物和腫瘤生物治療的主要藥物?；蚬こ倘烁蓴_素α-2b（安達(dá)芬）是我國第一個全國產(chǎn)化基因14人造血液、白細(xì)胞介素、乙肝疫苗等通過基因工程實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，均為解除人類的病苦，提高人類的健康水平發(fā)揮了重大的作用。人造血液及其生產(chǎn)人造血液、白細(xì)胞介素、乙肝疫苗等通過基因工程實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，15轉(zhuǎn)基因魚生長快、耐不良環(huán)境、肉質(zhì)好的轉(zhuǎn)基因魚(中國)轉(zhuǎn)基因魚生長快、耐不良環(huán)境、肉質(zhì)好的轉(zhuǎn)基因魚(中國)16轉(zhuǎn)基因牛乳汁中含有人生長激素的轉(zhuǎn)基因牛(阿根廷)轉(zhuǎn)基因牛乳汁中含有人生長激素的轉(zhuǎn)基因牛(阿根廷)17轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒18轉(zhuǎn)魚抗寒基因的番茄轉(zhuǎn)魚抗寒基因的番茄19轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的馬鈴薯轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的馬鈴薯20不會引起過敏的轉(zhuǎn)基因大豆不會引起過敏的轉(zhuǎn)基因大豆21Fourteenmonth-oldgeneticallyengineered(“biotech”)salmon(left)andnon-engineersalmon(right).Fourteenmonth-oldgenetically22世界上第一個….基因改造蕃茄1994年美國加州FlavrSavrTomato,CalgenePhotobyJackDykinga.SourcesARSPhotoUnit,2001,USDA.3世界上第一個….323SometimesBiotechnologyInvolvestheManipulationofNaturalBiologicalProcessesWithoutModifyingGenesDolly(left)wasaclonecreatedwithouttheneedforanygeneticmodifications.DollyandsurrogateMomSometimesBiotechnologyInvolv24TheBiotechnologyofReproductiveCloningTheBiotechnologyofReproduct25(Science(2002)295:1443)CopyCat–theFirstClonedPet(Science(2002)295:1443)Copy26SoulMates–FiveGeneticallyIdenticalPigletsSoulMates–FiveGenetically27USU’sContribution–AClonedMuleUSU’sContribution–ACloned28基因工程試劑的高回報(bào)堿性成纖維細(xì)胞生長因子231元/ug紅細(xì)胞生成素1072元/ug白細(xì)胞介素-2410元/ug巨細(xì)胞粒細(xì)胞集落刺激因子1960元/ug胰島素10.2元/mg基因工程試劑的高回報(bào)堿性成纖維細(xì)胞生長因子229第二節(jié)基因工程的一般原理第二節(jié)基因工程的一般原理30一、常用的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶（Ⅱ類）切割DNADNA連接酶生成3′-5′磷酸二酯鍵DNA聚合酶Ⅰ探針標(biāo)記、補(bǔ)平3′末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶3′末端多聚尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基一、常用的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶（Ⅱ類）切割DNADNA連接31二、基因工程的基本程序一.分—載體和目的基因的分離二.切—限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用三.接—載體與目的基因連接成重組體四.轉(zhuǎn)—基因序列轉(zhuǎn)入細(xì)胞五.篩—目的基因序列克隆的篩選和鑒定二、基因工程的基本程序一.分—載體和目的基因的分離32基因克隆示意圖基因克隆示意圖33一.分—載體和目的基因的分離（一）載體1.質(zhì)粒（plasmid)2.噬菌體（phage)3.動物病毒載體（virus)一.分—載體和目的基因的分離（一）載體34質(zhì)?！嬖谟诩?xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子理想的質(zhì)粒

1.拷貝數(shù)多;2.兩三個抗藥性基因terrampr

篩選標(biāo)志3.合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)（單一）質(zhì)?！嬖谟诩?xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子35第十一章動物基因工程課件36第十一章動物基因工程課件37（二）.目的基因的來源和分離

1.PCR

2.基因組文庫

3.cDNA文庫

4.人工化學(xué)合成（二）.目的基因的來源和分離1.PCR38二.切—限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用1.限制性內(nèi)切酶概念簡稱限制酶，是一類能識別雙鏈DNA分子中特定堿基序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。限制酶從原核生物中提取，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了600多種。二.切—限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用1.限制性內(nèi)切酶概念392.命名例：EcoRI，這是從大腸桿菌（Ecoli）R菌珠中分離出的一種限制性內(nèi)切酶EcoRI序號屬名種名株名2.命名例：EcoRI，這是從大腸桿菌（Ecoli）R403.作用限制性內(nèi)切酶是分析染色體結(jié)構(gòu)、制作DNA限制圖譜、進(jìn)行DNA序列測定和基因分離、基因體外重組等研究中不可缺少的工具，是對DNA分子進(jìn)行操作的手術(shù)刀。3.作用限制性內(nèi)切酶是分析染色體結(jié)構(gòu)、制作DNA限制圖譜、進(jìn)41Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的基本特征⑴在DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位切割，使DNA雙鏈斷裂；⑵識別序列一般為4~7個堿基對，這些堿基順序大都是沿中心軸回轉(zhuǎn)180°可以重合，也稱回文序列。⑶能產(chǎn)生兩種切割方式：錯位切割產(chǎn)生具有5’-或3’-突出的粘性末端；而沿對稱軸切割雙鏈DNA產(chǎn)生平頭末端，也稱鈍性末端Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的基本特征⑴在DNA分子雙鏈的特異性識別序列42三.接—載體與目的基因連接成重組體1.粘性末端連接2.平端連接三.接—載體與目的基因連接成重組體1.43常用的DNA限制性內(nèi)切酶的專一性酶辨認(rèn)的序列和切口說明‥‥AGCT‥‥‥‥TCGA‥‥‥‥GGATCC‥‥‥‥CCTAGG‥‥‥‥AGATCT‥‥‥‥TCTAGA‥‥‥‥GAATTC‥‥‥‥CTTAAG‥‥‥‥AAGCTT‥‥‥‥TTCGAA‥‥‥‥GTCGAC‥‥‥‥CAGCTG‥‥‥‥CCCGGG‥‥‥‥GGGCCC‥‥BamHIAluIBglIEcoRIHindⅢSalISmaI四核苷酸，平端切口六核苷酸，平端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口常用的DNA限制性內(nèi)切酶的專一性酶辨認(rèn)的序列和切口說明‥‥44第十一章動物基因工程課件45第十一章動物基因工程課件46第十一章動物基因工程課件47第十一章動物基因工程課件48四.轉(zhuǎn)—基因序列轉(zhuǎn)入細(xì)胞

1.轉(zhuǎn)化以質(zhì)粒作為載體構(gòu)建的重組DNA分子引入受體細(xì)胞的過程

2.轉(zhuǎn)染以噬菌體或或病毒為載體構(gòu)建的重組DNA分子引入受體細(xì)胞的過程四.轉(zhuǎn)—基因序列轉(zhuǎn)入細(xì)胞1.轉(zhuǎn)化49五.篩

—目的基因序列克隆的篩選和鑒定1.按重組載體的標(biāo)志進(jìn)行篩選2.核酸雜交法3.DNA限制性內(nèi)切酶圖譜分析4.PCR5.免疫學(xué)方法五.篩

—目的基因序列克隆的篩選和鑒定1.按重組載體的標(biāo)志501.據(jù)重組載體的表型進(jìn)行篩選可以利用載體質(zhì)粒對抗生素的抗藥性進(jìn)行篩選。如質(zhì)粒pBR332，由4362個核苷酸對構(gòu)成對四環(huán)素及氨芐青霉素均有耐藥性。1.據(jù)重組載體的表型進(jìn)行篩選可以利用載體質(zhì)粒對抗生素的抗512.DNA限制酶切圖譜分析提取重組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割在瓊脂糖凝膠電泳比較重組體與原來載體從DNA片段的大小與有無來區(qū)別是否已發(fā)生重組。2.DNA限制酶切圖譜分析提取重組DNA523.利用核酸雜交和放射自顯影進(jìn)行鑒定將菌落DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，另外用放射同位素，標(biāo)記目的基因，制成溶液，作為“探針”將菌落DNA與“探針”一起溫育，若菌落含有目的基因，就可把“探針”吸附住把已和探針溶液作用過的濾膜沖洗、烘干，與線底片夾在一起放陰暗處數(shù)天，經(jīng)顯影后，有目的基因的所在位置會出現(xiàn)黑點(diǎn)，從黑點(diǎn)位置與菌落DNA比較及鑒定之。3.利用核酸雜交和放射自顯影進(jìn)行鑒定將菌落DNA轉(zhuǎn)移到硝53克隆基因的表達(dá)1.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)2.真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)克隆基因的表達(dá)1.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)54第三節(jié)轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)

一、轉(zhuǎn)基因動物的概念

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞的一種技術(shù)。它是在DNA重組技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。1981年Gordon和Ruddle首次用顯微注射法(Microinjection)把外源基因?qū)胄∈笫芫训男酆?，并將注射后的受精卵植入假孕母鼠子宮，產(chǎn)生了的78只小鼠，其中有2只的所有細(xì)胞中(包括生殖細(xì)胞)都含有外源基因，但因缺乏啟動子而不能表達(dá)，他們把出生后帶外源基因的小鼠叫做轉(zhuǎn)基因小鼠(TransgenicMice)，自此以后，凡帶有外源基因的動物都叫做轉(zhuǎn)基因動物(Transgenicanimal)。第三節(jié)轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)一、轉(zhuǎn)基因動物的概念55二、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的一般步驟

(1)選擇能有效表達(dá)的蛋白質(zhì)；(2)克隆與分離編碼這些蛋白質(zhì)的基因；(3)選擇能與所需組織特異性表達(dá)方式相適應(yīng)的基因調(diào)節(jié)序列；(4)把調(diào)節(jié)序列與結(jié)構(gòu)基因重組拼接，并在培養(yǎng)細(xì)胞或小鼠中預(yù)先檢驗(yàn)其表達(dá)情況；(5)把拼接的基因注射到受精卵的細(xì)胞核中；(6)把注射后的受精卵移植到子宮，完成胚胎發(fā)(7)檢測幼畜是否整合外源基因、外源基因的表達(dá)情況以及外源基因在其后代中的傳遞情況。

二、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的一般步驟(1)選擇能有效表達(dá)的蛋白質(zhì)；56三、導(dǎo)入基因的方法

導(dǎo)入外源基因的方法有多種，一些方法已在上一節(jié)作過敘述，如：①反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染法；②磷酸鈣沉淀法；③脂質(zhì)體介導(dǎo)法；④血影細(xì)胞(Bloodshadowcell)介導(dǎo)法。在此再介紹一些方法，1）DNA微注射法；2）精子載體法；3)胚胎干細(xì)胞（ES）介導(dǎo)法；4)染色體片段注入法；5)電轉(zhuǎn)移法等。在轉(zhuǎn)基因動物中，DNA微注射法比較常用。

三、導(dǎo)入基因的方法導(dǎo)入外源基因的方法有多種，一些57四、基因的選擇與轉(zhuǎn)基因動物的研究現(xiàn)狀

(一)轉(zhuǎn)入基因的選擇

(二)轉(zhuǎn)基因動物的研究意義1．提高動物生長、生產(chǎn)性能的研究

2．改變奶蛋白成分和性質(zhì)的設(shè)想

3．利用家畜產(chǎn)品生產(chǎn)藥物蛋白的研究

四、基因的選擇與轉(zhuǎn)基因動物的研究現(xiàn)狀(一)轉(zhuǎn)入基因的選擇58第四節(jié)動物克隆技術(shù)

一、動物克隆的概念

所謂克隆(Cloning)就是無性繁殖，動物克隆(Animalcloning)就是不經(jīng)過受精過程而獲得動物新個體的方法。克隆動物(cloninganimal)就是指不經(jīng)過生殖細(xì)胞而直接由體細(xì)胞獲得新的動物個體。

第四節(jié)動物克隆技術(shù)一、動物克隆的概念59二、克隆動物的一般步驟

送入子宮，完成胚胎發(fā)育克隆的動物二、克隆動物的一般步驟送入子宮，完成胚胎發(fā)育克隆的動物60三、克隆動物的意義與前景

1．可以用于動物資源的種質(zhì)保存，可盡可能多地保存地球生物圈內(nèi)的多樣性；2．可以生產(chǎn)移植器官、利用動物作生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物和提供實(shí)驗(yàn)動物，造福人類。還可以對人類的某些頑癥實(shí)施“細(xì)胞治療”。3．可以克隆家畜和瀕臨滅絕的動物，如大熊貓等。4．利用哺乳動物體細(xì)胞克隆技術(shù)，可通過建立轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞系的方式，克隆轉(zhuǎn)基因動物。5．體細(xì)胞克隆技術(shù)可以直接把優(yōu)良物種特性傳遞下去，培育優(yōu)良物種。三、克隆動物的意義與前景1．可以用于動物資源的種質(zhì)保存，可61第十一章動物基因工程基因工程的概念：利用DNA體外重組或PCR擴(kuò)增技術(shù)從某種生物基因組中分離感興趣的基因，或是用人工合成的方法獲取基因，然后經(jīng)過一系列切割，加工修飾，連接反應(yīng)形成重組DNA分子，再將其轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞，以期獲得基因表達(dá)的過程.第十一章動物基因工程基因工程的概念：62基因工程(geneengineering)常和以下名稱混用遺傳工程(geneticengineering);基因克隆(genecloning);分子克隆(molecularcloning);基因操作(genemanipulation);重組DNA技術(shù)(recombinationDNAtechnique)克隆(clone):作名詞時(shí)指含有某目的DNA片段的重組DNA分子或含有該重組分子的無性繁殖系.作動詞時(shí)是指基因的分離與重組過程。基因工程(geneengineering)常和以下名稱混用63第一節(jié)基因工程的發(fā)展歷程1973Cohen第一例成功的克隆實(shí)驗(yàn)1978Genentech公司人胰島素世界上第一種基因工程蛋白藥物

1982第一個基因工程藥物--重組人胰島素在英、美獲準(zhǔn)使用

1985第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國轉(zhuǎn)基因魚

第一節(jié)基因工程的發(fā)展歷程1973Cohen第一例成功的克641993

基因工程西紅柿在美國上市1997

英國羅斯林研究所多莉羊1993基因工程西紅柿在美國上市65耐農(nóng)藥/抗蟲能力

(第一代)Bt抗蟲玉米傳統(tǒng)玉米簡介4

(InputTraits)Source:Monsanto耐農(nóng)藥/抗蟲能力(第一代)Bt抗蟲玉米傳統(tǒng)玉米簡介466黃金米可以防治維生素A缺乏癥成為健康食品改變營養(yǎng)組成

(第二代)5(OutputTraits)黃金米可以防治維生素A缺乏癥成為健康食品改變營養(yǎng)組成(第二67世界轉(zhuǎn)基因作物大田釋放情況

(1987.1-1998.4)轉(zhuǎn)基因作物特性批準(zhǔn)項(xiàng)數(shù)所占比例抗除草劑129729.6%抗蟲104623.8%提高產(chǎn)品質(zhì)量88620.2%抗病毒4369.9%改善農(nóng)學(xué)性狀2114.8%抗真菌病2084.7%其他3036.9%總計(jì)4387100%世界轉(zhuǎn)基因作物大田釋放情況

(1987.1-1998.4)轉(zhuǎn)68轉(zhuǎn)基因作物種植面積轉(zhuǎn)基因作物種植面積69[複製人!和我有什麼關(guān)係]陳文君著泛亞2001好好吃的樣子我也想吃!生產(chǎn)醫(yī)藥及工業(yè)用

(第三代)6(OutputTraits)[複製人!和我有什麼關(guān)係]陳文君著泛亞2001好好吃70胰島素分子結(jié)構(gòu)胰島素是治療糖尿病的特效藥，長期以來只能依靠從豬、牛等動物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素，其產(chǎn)量之低和價(jià)格之高可想而知。胰島素分子結(jié)構(gòu)胰島素是治療糖尿病的特效藥，長期以來只能依靠從71將合成的胰島素基因?qū)氪竽c桿菌，每2000L培養(yǎng)液就能產(chǎn)生100g胰島素！大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)不但解決了這種比黃金還貴的藥品產(chǎn)量問題，還使其價(jià)格降低了30%-50%!胰島素生產(chǎn)車間將合成的胰島素基因?qū)氪竽c桿菌，每2000L培養(yǎng)液就能產(chǎn)生172帶有人生長激素基因的轉(zhuǎn)基因小鼠正常小鼠1982年:“超級鼠”帶有人生長激素基因的正常小鼠1982年:“超級鼠”73干擾素治療病毒感染簡直是“萬能靈藥”！過去從人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍貴”程度自不用多說。干擾素生產(chǎn)車間干擾素分子結(jié)構(gòu)干擾素治療病毒感染簡直是“萬能靈藥”！過去從人血中提取，3074基因工程人干擾素α-2b（安達(dá)芬）是我國第一個全國產(chǎn)化基因工程人干擾素α-2b，具有抗病毒，抑制腫瘤細(xì)胞增生，調(diào)節(jié)人體免疫功能的作用，廣泛用于病毒性疾病治療和多種腫瘤的治療，是當(dāng)前國際公認(rèn)的病毒性疾病治療的首選藥物和腫瘤生物治療的主要藥物?；蚬こ倘烁蓴_素α-2b（安達(dá)芬）是我國第一個全國產(chǎn)化基因75人造血液、白細(xì)胞介素、乙肝疫苗等通過基因工程實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，均為解除人類的病苦，提高人類的健康水平發(fā)揮了重大的作用。人造血液及其生產(chǎn)人造血液、白細(xì)胞介素、乙肝疫苗等通過基因工程實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，76轉(zhuǎn)基因魚生長快、耐不良環(huán)境、肉質(zhì)好的轉(zhuǎn)基因魚(中國)轉(zhuǎn)基因魚生長快、耐不良環(huán)境、肉質(zhì)好的轉(zhuǎn)基因魚(中國)77轉(zhuǎn)基因牛乳汁中含有人生長激素的轉(zhuǎn)基因牛(阿根廷)轉(zhuǎn)基因牛乳汁中含有人生長激素的轉(zhuǎn)基因牛(阿根廷)78轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒79轉(zhuǎn)魚抗寒基因的番茄轉(zhuǎn)魚抗寒基因的番茄80轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的馬鈴薯轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的馬鈴薯81不會引起過敏的轉(zhuǎn)基因大豆不會引起過敏的轉(zhuǎn)基因大豆82Fourteenmonth-oldgeneticallyengineered(“biotech”)salmon(left)andnon-engineersalmon(right).Fourteenmonth-oldgenetically83世界上第一個….基因改造蕃茄1994年美國加州FlavrSavrTomato,CalgenePhotobyJackDykinga.SourcesARSPhotoUnit,2001,USDA.3世界上第一個….384SometimesBiotechnologyInvolvestheManipulationofNaturalBiologicalProcessesWithoutModifyingGenesDolly(left)wasaclonecreatedwithouttheneedforanygeneticmodifications.DollyandsurrogateMomSometimesBiotechnologyInvolv85TheBiotechnologyofReproductiveCloningTheBiotechnologyofReproduct86(Science(2002)295:1443)CopyCat–theFirstClonedPet(Science(2002)295:1443)Copy87SoulMates–FiveGeneticallyIdenticalPigletsSoulMates–FiveGenetically88USU’sContribution–AClonedMuleUSU’sContribution–ACloned89基因工程試劑的高回報(bào)堿性成纖維細(xì)胞生長因子231元/ug紅細(xì)胞生成素1072元/ug白細(xì)胞介素-2410元/ug巨細(xì)胞粒細(xì)胞集落刺激因子1960元/ug胰島素10.2元/mg基因工程試劑的高回報(bào)堿性成纖維細(xì)胞生長因子290第二節(jié)基因工程的一般原理第二節(jié)基因工程的一般原理91一、常用的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶（Ⅱ類）切割DNADNA連接酶生成3′-5′磷酸二酯鍵DNA聚合酶Ⅰ探針標(biāo)記、補(bǔ)平3′末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶3′末端多聚尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基一、常用的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶（Ⅱ類）切割DNADNA連接92二、基因工程的基本程序一.分—載體和目的基因的分離二.切—限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用三.接—載體與目的基因連接成重組體四.轉(zhuǎn)—基因序列轉(zhuǎn)入細(xì)胞五.篩—目的基因序列克隆的篩選和鑒定二、基因工程的基本程序一.分—載體和目的基因的分離93基因克隆示意圖基因克隆示意圖94一.分—載體和目的基因的分離（一）載體1.質(zhì)粒（plasmid)2.噬菌體（phage)3.動物病毒載體（virus)一.分—載體和目的基因的分離（一）載體95質(zhì)粒—存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子理想的質(zhì)粒

1.拷貝數(shù)多;2.兩三個抗藥性基因terrampr

篩選標(biāo)志3.合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)（單一）質(zhì)?！嬖谟诩?xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子96第十一章動物基因工程課件97第十一章動物基因工程課件98（二）.目的基因的來源和分離

1.PCR

2.基因組文庫

3.cDNA文庫

4.人工化學(xué)合成（二）.目的基因的來源和分離1.PCR99二.切—限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用1.限制性內(nèi)切酶概念簡稱限制酶，是一類能識別雙鏈DNA分子中特定堿基序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。限制酶從原核生物中提取，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了600多種。二.切—限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用1.限制性內(nèi)切酶概念1002.命名例：EcoRI，這是從大腸桿菌（Ecoli）R菌珠中分離出的一種限制性內(nèi)切酶EcoRI序號屬名種名株名2.命名例：EcoRI，這是從大腸桿菌（Ecoli）R1013.作用限制性內(nèi)切酶是分析染色體結(jié)構(gòu)、制作DNA限制圖譜、進(jìn)行DNA序列測定和基因分離、基因體外重組等研究中不可缺少的工具，是對DNA分子進(jìn)行操作的手術(shù)刀。3.作用限制性內(nèi)切酶是分析染色體結(jié)構(gòu)、制作DNA限制圖譜、進(jìn)102Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的基本特征⑴在DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位切割，使DNA雙鏈斷裂；⑵識別序列一般為4~7個堿基對，這些堿基順序大都是沿中心軸回轉(zhuǎn)180°可以重合，也稱回文序列。⑶能產(chǎn)生兩種切割方式：錯位切割產(chǎn)生具有5’-或3’-突出的粘性末端；而沿對稱軸切割雙鏈DNA產(chǎn)生平頭末端，也稱鈍性末端Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的基本特征⑴在DNA分子雙鏈的特異性識別序列103三.接—載體與目的基因連接成重組體1.粘性末端連接2.平端連接三.接—載體與目的基因連接成重組體1.104常用的DNA限制性內(nèi)切酶的專一性酶辨認(rèn)的序列和切口說明‥‥AGCT‥‥‥‥TCGA‥‥‥‥GGATCC‥‥‥‥CCTAGG‥‥‥‥AGATCT‥‥‥‥TCTAGA‥‥‥‥GAATTC‥‥‥‥CTTAAG‥‥‥‥AAGCTT‥‥‥‥TTCGAA‥‥‥‥GTCGAC‥‥‥‥CAGCTG‥‥‥‥CCCGGG‥‥‥‥GGGCCC‥‥BamHIAluIBglIEcoRIHindⅢSalISmaI四核苷酸，平端切口六核苷酸，平端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口常用的DNA限制性內(nèi)切酶的專一性酶辨認(rèn)的序列和切口說明‥‥105第十一章動物基因工程課件106第十一章動物基因工程課件107第十一章動物基因工程課件108第十一章動物基因工程課件109四.轉(zhuǎn)—基因序列轉(zhuǎn)入細(xì)胞

1.轉(zhuǎn)化以質(zhì)粒作為載體構(gòu)建的重組DNA分子引入受體細(xì)胞的過程

2.轉(zhuǎn)染以噬菌體或或病毒為載體構(gòu)建的重組DNA分子引入受體細(xì)胞的過程四.轉(zhuǎn)—基因序列轉(zhuǎn)入細(xì)胞1.轉(zhuǎn)化110五.篩

—目的基因序列克隆的篩選和鑒定1.按重組載體的標(biāo)志進(jìn)行篩選2.核酸雜交法3.DNA限制性內(nèi)切酶圖譜分析4.PCR5.免疫學(xué)方法五.篩

—目的基因序列克隆的篩選和鑒定1.按重組載體的標(biāo)志1111.據(jù)重組載體的表型進(jìn)行篩選可以利用載體質(zhì)粒對抗生素的抗藥性進(jìn)行篩選。如質(zhì)粒pBR332，由4362個核苷酸對構(gòu)成對四環(huán)素及氨芐青霉素均有耐藥性。1.據(jù)重組載體的表型進(jìn)行篩選可以利用載體質(zhì)粒對抗生素的抗1122.DNA限制酶切圖譜分析提取重組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割在瓊脂糖凝膠電泳比較重組體與原來載體從DNA片段的大小與有無來區(qū)別是否已發(fā)生重組。2.DNA限制酶切圖譜分析提取重組DNA1133.利用核酸雜交和放射自顯影進(jìn)行鑒定將菌落DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，另外用放射同位素，標(biāo)記目的基因，制成溶液，作為“探針”將菌落DNA與“探針”一起溫育，若菌落含有目的基因，就可把“探針”吸附住把已和探針溶液作用過的濾膜沖洗、烘干，與線底片夾在一起放陰暗處數(shù)天，經(jīng)顯影后，有目的基因的所在位置會出現(xiàn)黑點(diǎn)，從黑點(diǎn)位置與菌落DNA比較及鑒定之。3.利用核酸雜交和放射自顯影進(jìn)行鑒定將菌落DNA轉(zhuǎn)移到硝114克隆基因的表達(dá)1.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)2.真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)克隆基因的表達(dá)1.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)115第三節(jié)轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)

一、轉(zhuǎn)基因動物