臨床免疫功能檢測課件

人體免疫功能的檢測第一節(jié)免疫應答的類型及組成免疫應答分兩種類型一.非特異性免疫應答二.特異性免疫應答一.非特異性免疫應答（固有性免疫應答，innateimmuneresponse)（一）概念

先天獲得，無個體差異（二）特點1.起作用迅速2.先天獲得3.無個體差異4.不因同一抗原進入機體次數(shù)多少改變反應強弱二.特異性免疫應答（適應性免疫應答，adaptiveimmuneresponse)（一）概念后天因抗原刺激獲得（二）特點1.后天獲得2.免疫發(fā)生時間因首次或再次接觸抗原而不同3.有個體差異4.免疫發(fā)生強弱與抗原進入次數(shù)有關（三）組成細胞免疫：由T細胞主導完成體液免疫：由B細胞主導完成第二節(jié)人體免疫功能檢測非特異免疫功能體液中殺菌物質——補體、溶菌酶吞噬細胞——大、小吞噬細胞（數(shù)量、功能）特異性免疫功能細胞免疫功能T細胞數(shù)量功能體液免疫功能B細胞數(shù)量功能人特異免疫功能的檢測一.T細胞數(shù)量的檢測二.T細胞功能的檢測三.B細胞數(shù)量的檢測四.B細胞功能的檢測T細胞表面主要CD抗原及其特異性

CD抗原特異性

CD2E受體、全部T細胞和部分NK細胞

CD3成熟T細胞

CD4T（輔助/誘導）細胞、M、HIV受體

CD8T（殺傷/抑制）細胞、NK細胞的亞型CD25活化T細胞、IL-2受體檢測T細胞方法：

用標記的抗CD抗原的單克隆抗體檢測1.間接免疫熒光法：用熒光素標記的單抗作為試劑染色淋巴細胞，計算出染上熒光的淋巴細胞百分率如：熒光標記的抗CD4淋巴細胞染上熒光的細胞為CD4+細胞染色3.抗體致敏細胞花環(huán)法

用相應單抗致敏紅細胞（單抗結合到紅細胞表面），與淋巴細胞混合有相應抗原的T細胞周圍可吸附紅細胞，形成花環(huán)（二）T細胞特異性受體（E受體）的檢測E花環(huán)形成試驗(ErythrocyteRosetteformingtest)原理：

T淋巴細胞表面有綿羊紅細胞（SRBC)受體，當淋巴細胞與綿羊紅細胞混合時，T細胞通過該受體吸附綿羊紅細胞，形成的花環(huán)。E:erythrocyte,紅細胞E花環(huán)形成試驗據(jù)實驗條件不同又分兩種：Et花環(huán)形成試驗（total,總E花環(huán)）Ea花環(huán)形成試驗（active,活性E花環(huán)）1.Et花環(huán)形成試驗

淋巴細胞+SRBC(1:20~50)37°C、5分鐘低速離心4°C、2hor過夜形成花環(huán)的百分率意義：表示總T細胞數(shù)量（凡是T細胞均能形成花環(huán)），數(shù)量低于正常，說明細胞免疫功能不好。正常值：60%~80%（三）T細胞的-醋酸萘酯酶測定(-acidnaphthylacetateesterase,ANAE)成熟的T細胞中富含ANAE-醋酸萘酯醋酸+萘酚紅色沉淀暗紅色該試驗將T淋巴細胞染成暗紅色。正常值60~80%ANAE酸性時水解六偶氮品紅偶聯(lián)甲基綠復染二.T細胞功能的檢測

反映機體細胞免疫功正常，除了要T淋巴細胞數(shù)量正常外，還要T細胞功能正常。檢測T細胞功能正常的試驗有：（一）淋巴細胞轉化試驗（二）相關的細胞因子的檢測（在細胞因子章節(jié)介紹）（三）淋巴細胞的細胞毒性檢測2.刺激物一般為有絲分裂原和抗原分兩類（1）非抗原刺激物（有絲分裂原）可刺激相關的一類淋巴細胞發(fā)生轉化，與機體是否已曾受過某一抗原致敏無關。常有：

非抗原刺激物

刺激物能刺激發(fā)生轉化細胞植物血凝素T(phytohemagglutinin,PHA)刀豆素AT(ConcanavalinA,ConA)脂多糖(LPS)B美洲商陸(PWM)T、B3.試驗方法（1）形態(tài)學檢測法

將待測者血取出，加入一定量刺激物（一般用PHA)培養(yǎng)，3天后涂片染色，計數(shù)轉化淋巴細胞（根據(jù)形態(tài)）的百分率。正常值60%~80%操作過程：試驗管:抗凝血0.5ml+PHA2mg+培養(yǎng)液對照管：抗凝血+培養(yǎng)液37°C

5%co2培養(yǎng)3天涂片染色計數(shù)轉化淋巴細胞百分率轉化與未轉化淋巴細胞的區(qū)別轉化細胞未轉化細胞特點母細胞過渡型小淋巴細胞細胞大小（直徑）12~20μ12~16μ6~8μ胞核染色質疏松疏松致密核仁1~3個有或無無分裂相有或無無無量豐富稍寬窄嗜堿性強、深蘭色蘭色天青蘭空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無胞漿形態(tài)學方法的優(yōu)缺點優(yōu)點：簡便、不需要特殊儀器，無有害物（放射性物質）污染。缺點：判斷結果不客觀，操作中易損害細胞，辨認困難，結果判斷難以規(guī)范化。（2）同位素摻入法原理：

T細胞受PHA刺激后，細胞進入增殖周期進行有絲分裂。整個細胞周期分G1、S、G2、M四個期。在G1期合成少量DNA和蛋白質，為DNA復制準備，S期細胞合成DNA量明顯增加。試驗中當細胞進入S期時，在培養(yǎng)液中加入3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR)，細胞攝入，合成DNA,據(jù)摻入細胞內的同位素量，可推測細胞增殖活躍程度，從而判斷淋巴細胞轉化的程度。步驟：外周血分離淋巴細胞洗滌3次計數(shù)并配成1×106/ml0.1ml細胞+16400.1ml+PHA0.5mg/ml37°C

54-56h5%co2加3H-TdR1μci/孔37°C

16-18h5%co2收集于濾膜上80~85°C

30分鐘置有閃爍液的閃爍瓶中用計數(shù)儀測cpm（每分鐘脈沖數(shù)）計算刺激指數(shù)：刺激指數(shù)(SI)=

實驗組cpm對照組cpmCpm：每分鐘脈沖數(shù)正常值：SI3.0同位素摻入法的優(yōu)缺點優(yōu)點：結果客觀準確，有取代形態(tài)學法的趨勢缺點：技術要求高，操作中每一個因素的改變都可影響結果；需要特殊儀器檢測；有同位素污染問題（3）MTT(四甲基偶氮唑鹽）法原理：MTT在活細胞線粒體琥珀酸脫氫酶作用下，被還原成蘭黑色的MTT-甲，形成MTT-甲的量與細胞增殖程度呈正相關。淋巴細胞受刺激物刺激增殖，細胞數(shù)增多，故通過比色法測A值，計算出刺激指數(shù)作為判斷淋巴細胞轉化率的指標。

試驗孔A均值SI=對照孔A均值步驟：

外周血分離淋巴細胞洗滌3次計數(shù)并配成1×106/ml0.1ml細胞+16400.1ml+PHA0.5mg/ml37°C

、68h5%co237°C、4h5%co2培養(yǎng)結束，取出，1500rpm×10min離心去上清液，每孔加100μlDMSO，混勻5min，室溫放置20min后，于酶標儀上測570nmA值每孔加5mg/mlMTT10μl按公式計算SIDMSO：二甲亞砜（二）T細胞介導的細胞毒試驗

細胞毒性T細胞（CTL)具有殺傷靶細胞的作用，它是評價機體細胞免疫水平的一種指標之一。檢測這種殺傷作用的試驗稱為細胞毒試驗。CD8+CTL與靶細胞表面相應抗原結合通過脫顆粒，釋放穿孔素、顆粒酶，使靶細胞溶解、凋亡。CTLCD8+靶細胞穿孔素、顆粒酶靶細胞溶解、凋亡致敏淋巴細胞方法1.形態(tài)學方法

淋巴細胞與靶細胞按一定比例加在一起培養(yǎng)一段時間，染色后計數(shù)殘留靶細胞（腫瘤細胞）數(shù)，計算淋巴細胞抑制腫瘤細胞生長的抑制率。對照組：對照組平均殘留腫瘤細胞數(shù)實驗組：實驗組平均殘留腫瘤細胞數(shù)抑制率%=對照組-實驗組對照組100%2.同位素法：常用51Cr釋放試驗原理：

用51Cr標記靶細胞（一般為腫瘤細胞），將它與待測淋巴細胞（效應細胞）一起培養(yǎng)，效應細胞破壞靶細胞，51Cr釋放出來，測定其51Cr數(shù)量，便可推知效應細胞的殺傷能力。方法：效應細胞：受檢者外周血單個核細胞靶細胞：用鉻酸鈉（Na251Cr)標記傳代腫瘤細胞分三組：1.最大釋放組50μl靶C+150μlDW(靶細胞全溶)2.自發(fā)釋放組50μl靶C+150μl培養(yǎng)液3.實驗組50μl靶C+150μl培養(yǎng)液+100μl效C效C：靶C分別為100：1；50：1；25：1培養(yǎng)后取上清測cpm計算特異溶解百分率：實驗組cpm-自發(fā)釋放組cpm

最大釋放組cpm-自發(fā)釋放組cpm100%特異溶解百分率大于50%為陽性細胞免疫功能體內檢測法—Ⅳ型超敏反應皮試原理：Ⅳ型超敏反應的本質是細胞免疫，所以Ⅳ型超敏反應如為陽性，說明細胞免疫功能好。所用抗原：OT或PPD以OT為例OT1:20000.1ml皮內注射，48—72h觀察結果，紅腫硬結大于0.5cm為陽性該試驗設計是基于人群中96%的人均感染過結核菌（被結核抗原致敏）致敏淋巴細胞再次接觸抗原，釋放出細胞因子，使局部產生以巨噬細胞、淋巴細胞浸潤為主的炎癥（表面為紅腫硬結）。陽性：感染過結核菌，細胞免疫功能好陰性：細胞免疫功能差或未感染過結核注意與Ⅰ型超敏反應皮試區(qū)別三.B細胞數(shù)量的檢測（一）B細胞表面識別抗原受體（SmIg,SurfacemembraneIg)的檢測SmIg是B細胞膜表面球蛋白存在于成熟B淋巴細胞膜上為結構蛋白類型為：IgM、IgD。作用及意義：B細胞表面標志b.識別抗原受體c.檢測外周血淋巴細胞表面有SmIg者為B細胞，故可作為檢測B細胞數(shù)量的方法。2.方法（常用免疫熒光法）（1）試劑：羊抗人IgM、IgD熒光標記物（2）外周血淋巴細胞涂片，熒光抗體染色（3）觀察：陽性細胞呈斑點狀、環(huán)狀、帽狀熒光（4）注意點：染色后30分鐘內觀察，否則帽狀熒光易脫落或被吞飲3.正常值：15%~20%（二）B細胞表面抗原的檢測B細胞表面特有的CD抗原有：CD19、CD20用抗CD20的單抗（間接熒光免疫法、酶免疫組化法）檢測外周血淋巴細胞，陽性