分子生物學(xué)常用技術(shù)簡(jiǎn)化版

關(guān)于分子生物學(xué)常用技術(shù)簡(jiǎn)化版第一頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日第十九章分子生物學(xué)常用技術(shù)第二頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日分子生物學(xué)技術(shù)能幫助我們干什么？揭示生物大分子(DNA、RNA、蛋白質(zhì))的結(jié)構(gòu)與功能DNA

水平：基因序列分析、拷貝數(shù)和染色體定位RNA

水平：定量分析、基因表達(dá)產(chǎn)物的可變剪接分析蛋白質(zhì)水平：蛋白質(zhì)定量、定位、功能細(xì)胞與整體水平：基因在活體中的功能目的：了解疾病發(fā)生的規(guī)律，提供治療與預(yù)防手段第三頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日我們需要了解和掌握哪些基本技術(shù)？基本技術(shù)：核酸：測(cè)序、印跡、雜交、體外擴(kuò)增技術(shù)蛋白質(zhì)：電泳與印跡、組學(xué)技術(shù)、相互作用綜合技術(shù)：基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)基因生物與基因敲除技術(shù)應(yīng)用技術(shù)：基因診斷基因治療第四頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日Molecularhybridization:利用已知核酸序列(探針/probe)檢測(cè)與其互補(bǔ)的未知核酸序列用途：確認(rèn)核酸序列間同源性對(duì)特定核酸序列進(jìn)行定量自核酸混合體中辨認(rèn)特定核酸序列第一節(jié)：核酸分子雜交第五頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日一、基本原理變性(denature)復(fù)性(renature)雜交(hybiridization)第六頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日核酸變性在特定變性因素作用下，DNA雙螺旋解離的過(guò)程破壞氫鍵與疏水作用可導(dǎo)致變性熱變性：高溫可使核酸變性，溫度高于90℃時(shí)任何核酸雙鏈都將變性酸堿變性：pH<3或pH>11時(shí)核酸將變性，DNA使用堿變性，RNA則不可化學(xué)試劑變性：能夠破壞氫鍵的化學(xué)試劑如尿素或甲酰胺可使核酸變性第七頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日變性溫度Tm：meltingtemperature，解鏈溫度或變性溫度影響變性溫度的因素：溶液的離子強(qiáng)度變性溫度與離子強(qiáng)度正相關(guān)，低鹽利于變性DNA分子的GC含量GC％＝(Tm－69.3)×2.24第八頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日核酸復(fù)性變性的DNA單鏈相互識(shí)別并結(jié)合，恢復(fù)其天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程復(fù)性類似與化學(xué)反應(yīng)，需要一定反應(yīng)時(shí)間第九頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日影響DNA復(fù)性速度的因素DNA分子的濃度：濃度高，復(fù)性快DNA分子的長(zhǎng)度：長(zhǎng)片段復(fù)性速度慢DNA分子的復(fù)雜性：重復(fù)序列復(fù)性速度快不同物種C0t曲線比較

人類基因組C0t曲線第十頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日二、核酸探針Probe：用于測(cè)定未知核酸片段的已知序列探針為DNA

或RNA，可以為單鏈或雙鏈探針必需經(jīng)過(guò)標(biāo)記：放射性標(biāo)記或非放射性標(biāo)記第十一頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日1.探針有哪些種類？DNA探針：常規(guī)探針利用基因組DNA序列或cDNA序列合成的探針，一般為雙鏈，也可制備成單鏈RNA探針：高靈敏度探針

一般是通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄而來(lái)，均為單鏈寡核苷酸探針(oligo-nucleotide)：用于點(diǎn)突變檢測(cè)人工合成的短序列(~20nt)，可自由選擇序列第十二頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日2.標(biāo)記物有哪些？標(biāo)記物的要求：高度的靈敏性：足以檢測(cè)到極微量的核酸序列高度的特異性：足以在大量非特異性序列中檢測(cè)到特異的靶序列標(biāo)記物的種類：放射性同位素(radioisotope)非放射性標(biāo)記物(non-radioactivelabel)第十三頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日放射性同位素特點(diǎn)：靈敏度最高的標(biāo)記物，足以檢測(cè)到飛克級(jí)微量的核酸序列

g→mg→μg→ng→pg→fg常用的放射性同位素第十四頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日放射性標(biāo)記的核苷酸單體dNTPorNTP5’or3’P32labelling第十五頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日非放射性標(biāo)記物特點(diǎn)：安全且易于存放，但靈敏度與特異性均不及放射性同位素地高辛：通過(guò)地高辛抗體結(jié)合并檢測(cè)生物素：結(jié)合親和素/鏈親和素(avidin/streptavidin)化學(xué)發(fā)光物質(zhì)：通過(guò)紫外激發(fā)或化學(xué)反應(yīng)而發(fā)光電子密度標(biāo)記物：金等重金屬第十六頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日3.如何檢測(cè)雜交信號(hào)？同位素標(biāo)記物：蓋革計(jì)數(shù)器、液體閃爍計(jì)數(shù)器放射自顯影(autoradiography)第十七頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日如何檢測(cè)雜交信號(hào)？非放射性標(biāo)記物：酶聯(lián)免疫技術(shù)(enzymelinkedimmuno-assay)化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence)第十八頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日三、如何對(duì)核酸探針進(jìn)行標(biāo)記？第十九頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日1.缺口平移nicktranslation:適用于標(biāo)記雙鏈DNA控制DNaseI的用量，可以控制探針的長(zhǎng)度第二十頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日2.非放探針的酶促標(biāo)記生物素或地高辛標(biāo)記的核苷酸單體通過(guò)酶促反應(yīng)可以參入探針第二十一頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日3.非放探針的化學(xué)標(biāo)記利用光敏基因經(jīng)可見(jiàn)光照射直接與核酸結(jié)合第二十二頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日四、如何進(jìn)行雜交？樣品(DNAorRNA)吸附于支持物尼龍膜、硝酸纖維膜、載玻片等與標(biāo)記的探針雜交封閉液封閉后雜交，雜交爐中進(jìn)行緩沖液清洗控制溫度與變性劑濃度顯色放射自顯影/酶聯(lián)顯色第二十三頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日五、雜交有哪些不同的方式？斑點(diǎn)雜交：dothybridizationSouthern印跡雜交：SouthernblotNorthern印跡雜交：NorthernblotWesternblotting：不是雜交原位雜交：insituhybridization反Northern印跡雜交：reverseNorthernblot基因芯片/DNA微陣列：Genechip/DNAmicroarray第二十四頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日dothybridization將核酸樣品直接點(diǎn)在雜交膜上與探針進(jìn)行雜交特點(diǎn)：簡(jiǎn)便但特異性不高可探測(cè)核酸含量，但無(wú)法得知分子大小第二十五頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日SouthernblotEdwinSouthern創(chuàng)立的方法電泳技術(shù)與雜交結(jié)合，可顯示靶DNA序列的長(zhǎng)度可進(jìn)行毛吸管轉(zhuǎn)移、真空轉(zhuǎn)移與電轉(zhuǎn)移第二十六頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日電泳轉(zhuǎn)膜雜交第二十七頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日Northernblot類似于Southern印跡雜交的方法，用于RNA檢測(cè)第二十八頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日insituhybridization原位雜交：特定mRNA的組織細(xì)胞分布第二十九頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日FISHFluorescenceinsituhybridization

(FISH)：特定基因的染色體定位第三十頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日反Northern雜交與DNA芯片反Northern雜交：將探針DNA片段固定在雜交膜上，利用標(biāo)記物標(biāo)記的RNA進(jìn)行雜交第三十一頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR，polymerasechainreaction在體外選擇性擴(kuò)增特定DNA片段的高效手段70年代有人提出PCR的設(shè)想，因缺乏寡核苷酸的合成手段和適合的酶而無(wú)法進(jìn)行1984年KaryMullis發(fā)明PCR，并因此獲得1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)全自動(dòng)的熱循環(huán)儀和多種PCR衍生技術(shù)使其成為重要的科學(xué)研究手段第三十二頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日一、PCR的基本原理在體外，以特定引物引導(dǎo)，通過(guò)DNA

聚合酶選擇性擴(kuò)增特定區(qū)域變性(denature)退火(anneal)延伸(extension)第三十三頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日DNA的體內(nèi)復(fù)制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈第三十四頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’GGAUCG5’AUCGCG5’引物酶引物酶RNA引物RNA引物DNA解旋解鏈引物合成DNA的體內(nèi)復(fù)制第三十五頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’GGAUCG5’AUCGCG5’TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶DNA解旋解鏈引物合成新鏈延伸DNA的體內(nèi)復(fù)制第三十六頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’變性復(fù)性加熱退火DNA加熱解鏈第三十七頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日模板DNA94℃第三十八頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日55℃引物1引物2DNA引物第三十九頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第四十頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日第1輪結(jié)束94℃第2輪開(kāi)始第四十一頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日72℃TaqTaqTaqTaq55℃第四十二頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日第2輪結(jié)束第四十三頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

第四十四頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1-3步25-30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性新鏈延伸DNA的體外擴(kuò)增熱循環(huán)DNA解鏈第四十五頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200μmol/L引物各0.1-0.5μmol/L模板DNA

0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5UMg2+

1.5mmol/LDNA的體外擴(kuò)增第四十六頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日PCR技術(shù)的特點(diǎn)高度的靈敏性：理論上經(jīng)20循環(huán)可將目的基因片段擴(kuò)增220＝1000000倍高度的特異性：利用引物與模板的特異性配對(duì)，可保證擴(kuò)增的特異性一對(duì)20堿基長(zhǎng)引物的多樣性為440＝1024應(yīng)用的廣泛性：目前已經(jīng)成為分子生物學(xué)研究必不可少的手段操作的簡(jiǎn)便性：不需要復(fù)雜的設(shè)備和繁瑣的流程第四十七頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日二、做PCR要有什么條件？酶：TaqDNA聚合酶模板DNA：可以為基因組DNA或cDNA引物：人工合成的寡核苷酸片段dNTP：聚合反應(yīng)的核苷酸單體緩沖液：包含特定的pH、離子強(qiáng)度和Mg2+反應(yīng)程序：變性、退火、延伸組成的循環(huán)儀器：DNA熱循環(huán)儀，或稱PCR儀第四十八頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日DNA聚合酶催化的聚合反應(yīng)dNTP第四十九頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日1.什么是耐熱DNA聚合酶早期PCR曾使用DNA聚合酶I在高溫時(shí)發(fā)生變性，每一循環(huán)都需要重新添加酶延伸反應(yīng)溫度為37℃，非特異性太多目前常用

TaqDNA

聚合酶純化自嗜熱水生菌

(Thermusaquaticus)可耐受95℃高溫，最適反應(yīng)溫度為72℃左右第五十頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日TaqDNApolymerase在70~75℃范圍活性最佳，每秒可延伸150nt95℃時(shí)的半衰期為40min按變性時(shí)間1min計(jì)，能滿足30循環(huán)的反應(yīng)Taq酶具有5’→3’聚合活性和5’→3’外切活性不具備校讀活性，錯(cuò)誤率為2×10－4左右錯(cuò)誤合成的DNA片段可以作為模板，循環(huán)數(shù)越多，最終擴(kuò)增產(chǎn)物錯(cuò)誤率越高只能用于檢測(cè)，不適合基因克隆第五十一頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日有保真性的耐熱DNA聚合酶嗎？PfuDNApolymerase：常用的高保真耐熱DNA聚合酶有5’→3’

外切活性錯(cuò)誤率約1×10－6適應(yīng)于基因克隆第五十二頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日2.如何設(shè)計(jì)寡聚核苷酸引物？引物(primer)是PCR反應(yīng)必備的前提，對(duì)PCR產(chǎn)物類型、長(zhǎng)度和反應(yīng)的特異性具有決定作用PCR需要兩條引物，引物決定擴(kuò)增范圍和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度第五十三頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日引物設(shè)計(jì)原則引物長(zhǎng)度一般為15~30核苷酸引物太短影響雜交體的穩(wěn)定和特異性引物太長(zhǎng)隨機(jī)匹配序列增多，特異性反而下降GC含量一般為40％~60％應(yīng)充分考慮退火溫度(annealingtemperature)GC含量低，退火溫度低，易出現(xiàn)非特異GC含量高，非特異性結(jié)合也會(huì)增加引物解鏈溫度粗略計(jì)算公式：

引物的解鏈溫度Tm＝4(G＋C)＋2(A＋T)第五十四頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日引物設(shè)計(jì)原則引物自身不應(yīng)該存在鏈內(nèi)互補(bǔ)序列，以防止出現(xiàn)發(fā)卡結(jié)構(gòu)

兩條引物間、同一引物的分子間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列出現(xiàn)互補(bǔ)易導(dǎo)致引物二聚體的出現(xiàn)，影響擴(kuò)增效率第五十五頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日引物設(shè)計(jì)原則避免引物與非特異序列間的同源性引物的3，末端必須與模板完全互補(bǔ)，5，末端允許添加非配對(duì)序列5，末端允許添加非匹配序列，如：酶切位點(diǎn)5’3’第五十六頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日3.如何選擇dNTP和緩沖液?dNTP是聚合反應(yīng)的底物常規(guī)使用濃度：0.2mMeach探針標(biāo)記時(shí)，可使用同位素或非放標(biāo)記的dNTP緩沖液：特定的pH和離子強(qiáng)度Mg2＋濃度一般為1.5mMPCRmix：預(yù)制的便捷反應(yīng)體系第五十七頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日4.用什么做模板DNA？PCR的模板(template)可以是基因組DNA

或cDNA逆轉(zhuǎn)錄-PCR(reversetranscriptionPCR)：RT-PCR在利用DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)純化比較簡(jiǎn)單血液、病原體、體外培養(yǎng)細(xì)胞、甚至病理標(biāo)本經(jīng)簡(jiǎn)單處理后均可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增RNA樣品一般要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格純化，并逆轉(zhuǎn)錄未經(jīng)純化的RNA不穩(wěn)定，無(wú)法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中如存在DNA，將對(duì)RNA擴(kuò)增產(chǎn)生干擾第五十八頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日6.如何設(shè)計(jì)反應(yīng)程序？PCR的循環(huán)數(shù)：理論上20~25即可滿足擴(kuò)增需要，但實(shí)際循環(huán)數(shù)一般為25~35過(guò)多循環(huán)后到達(dá)平臺(tái)期，繼續(xù)延長(zhǎng)循環(huán)數(shù)無(wú)效模板濃度高時(shí)平臺(tái)期出現(xiàn)早，模板濃度低時(shí)平臺(tái)期出現(xiàn)晚，應(yīng)根據(jù)模板濃度調(diào)節(jié)循環(huán)數(shù)第五十九頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日反應(yīng)程序的關(guān)鍵是退火溫度退火溫度：提高退火溫度有助于提高反應(yīng)的特異性退火溫度過(guò)高將導(dǎo)致引物與模板無(wú)法配對(duì)，影響擴(kuò)增效率反應(yīng)的退火溫度主要取決于引物序列第六十頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日三、我們能用PCR做什么？自PCR技術(shù)創(chuàng)立以來(lái)，經(jīng)近20年的發(fā)展，在基本PCR技術(shù)基礎(chǔ)上產(chǎn)生了多種PCR的衍生技術(shù)，應(yīng)用于各種不同的目的基因克隆或亞克隆－－基因工程特定基因表達(dá)量的分析基因突變的檢測(cè)－－基因診斷病原體特征性序列的鑒定－－基因診斷定點(diǎn)誘變－－第4節(jié)DNA序列測(cè)定－－第3節(jié)第六十一頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日最常用的

PCR是RT-PCRRT-PCR：reversetranscriptionPCR以mRNA為模板先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行PCR為什么要以mRNA為模板？mRNA無(wú)內(nèi)含子，克隆的基因可在原核表達(dá)mRNA的量代表了基因的表達(dá)水平第六十二頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日如何利用

RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平?定量PCR(quantitative

PCR)PCR產(chǎn)物的量與起始的模板量有關(guān)利用PCR對(duì)模板DNA或cDNA進(jìn)行定量測(cè)定定量PCR一般用于特定基因mRNA水平的檢測(cè)RT-PCR可用于基因表達(dá)水平檢測(cè)需設(shè)定內(nèi)部參照物(referencegene)，如：GAPDH、actin、18srRNA等穩(wěn)定表達(dá)基因定量是相對(duì)的，一般是不準(zhǔn)確的第六十三頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日為什么說(shuō)RT-PCR定量是不準(zhǔn)確的？

指數(shù)擴(kuò)增期，產(chǎn)物量與模板量成正比進(jìn)入平臺(tái)期，產(chǎn)物量不能再反應(yīng)模板量不同樣品進(jìn)入平臺(tái)期的循環(huán)數(shù)不同，難以選擇測(cè)定的時(shí)間節(jié)點(diǎn)第六十四頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日有精確定量方法嗎？實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timePCR)：以產(chǎn)物量到達(dá)一定閾值所需要的循環(huán)數(shù)為定量標(biāo)準(zhǔn)需要對(duì)PCR產(chǎn)物的生成量進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)控第六十五頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日如何進(jìn)行產(chǎn)物量的實(shí)時(shí)檢測(cè)？需要熒光標(biāo)記探針與兩側(cè)PCR引物探針標(biāo)記有報(bào)告熒光與粹滅熒光反應(yīng)過(guò)程中探針被降解，報(bào)告熒光顯色可通過(guò)熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控第六十六頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日巢式PCR可以提高擴(kuò)增效率和特異性

Nested-primerPCR內(nèi)外兩套引物分兩輪進(jìn)行擴(kuò)增在克隆一些低豐度基因時(shí)可以采用經(jīng)過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增，具有更高的靈敏度四條引物均與模板匹配，因此增加了特異性第六十七頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日可以利用多對(duì)引物進(jìn)行多重PCR多重PCR(multi-primerPCR)多組引物同時(shí)進(jìn)行的PCR，可大幅度降低PCR反應(yīng)的工作量第六十八頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日可以在組織切片上進(jìn)行原位PCR原位PCR(insituPCR)在組織切片或細(xì)胞涂片上進(jìn)行的PCR方法主要用于特定基因表達(dá)水平的原位分析組織切片經(jīng)過(guò)固定、蛋白酶和DNase消化后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增第六十九頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日Sequencing：基因結(jié)構(gòu)分析的最基本方法主要方式：化學(xué)降解法酶法：Sanger法/雙脫氧鏈末端終止法二代/三代測(cè)序技術(shù)第三節(jié)：基因測(cè)序第七十頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日適用于寡核苷酸片段測(cè)序的方法基本反應(yīng)：G：DMSG/A：哌啶T/C：肼(低鹽)C：肼(高鹽)一、化學(xué)降解法第七十一頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日Sanger在1977年建立的方法，也稱酶法測(cè)序DNA序列測(cè)定的最常用方法二、雙脫氧末端終止法在反應(yīng)體系中加入2’,3’-ddNTP，由于其沒(méi)有3’-OH而不能與下一個(gè)核苷酸相連，于是DNA鏈的合成便終止。第七十二頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日Sanger法測(cè)序第七十三頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日模板：?jiǎn)捂湣鷨坞p鏈均可酶：Klenow→耐熱DNA聚合酶標(biāo)記：同位素標(biāo)記→熒光標(biāo)記電泳：平板電泳→毛細(xì)管電泳

4泳道→單一泳道酶法測(cè)序的自動(dòng)化程度越來(lái)越高第七十四頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日二代測(cè)序技術(shù)(next-generationsequencing)1天完成全基因組測(cè)序羅氏、Solexa、ABI等公司各有不同技術(shù)利用微珠或芯片實(shí)現(xiàn)大通量，邊合成邊測(cè)序三代測(cè)序技術(shù)(next-next-generationsequencing)：3分鐘完成全基因組測(cè)序基于納米微孔的單分子測(cè)序技術(shù)二代測(cè)序與三代測(cè)序技術(shù)第七十五頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日第四節(jié)：DNA定點(diǎn)誘變技術(shù)(自學(xué)）目前主要用PCR方法進(jìn)行定點(diǎn)誘變也可進(jìn)行突變基于的全合成第七十六頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日第五節(jié)：RNA干擾技術(shù)學(xué)習(xí)基因工程之后，在基因剔除技術(shù)部分介紹第七十七頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日第六節(jié)：生物芯片生物芯片(biochip)：基于微電子技術(shù)和生物信息技術(shù)建立的高度集成化的生物樣本分析方法生物芯片是后基因組時(shí)代的利器生物芯片有哪些種類？DNAmicroarrayProteinmicroarrayAntibodymicroarrayChemicalcompoundmicroarrayTissuemicroarray第七十八頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日什么是基因芯片技術(shù)？基因芯片(genechip)，一種高通量的核酸雜交方法，又稱DNA微陣列(DNAmicroarray)將大量探針固定與固相支持物，與標(biāo)記的待測(cè)樣品進(jìn)行雜交的方法Affymetrix公司已經(jīng)將GeneChip注冊(cè)第七十九頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日如何制作基因芯片？cDNA芯片：cDNA片段以顯微打印的方式固定于固相支持物表面，集成度較低原位合成芯片：以激光蝕刻技術(shù)直接合成寡核苷酸探針，集成度可達(dá)105點(diǎn)陣/cm2以上第八十頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日基因芯片能幫助我們干什么？基因表達(dá)譜芯片(geneexpressionprofile)：基因表達(dá)的大通量分析SNP芯片(singlenucleotidepolymorphism)：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性的大通量檢測(cè)微小RNA芯片(miRNA)：分析microRNA甲基化芯片：分析基因組甲基化狀態(tài)ChIP-chip(chromatinimmunoprecipitation)：分析DNA與蛋白質(zhì)的相互作用第八十一頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日芯片的主要工作流程選擇與購(gòu)買(mǎi)芯片準(zhǔn)備樣品標(biāo)記樣品雜交檢測(cè)雜交信號(hào)分析處理結(jié)果第八十二頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日第七/八節(jié)：蛋白質(zhì)分析方法蛋白質(zhì)的定量分析：ELISA(Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay)Westernblot蛋白質(zhì)的定位：免疫組織化學(xué)熒光蛋白的活細(xì)胞定位蛋白質(zhì)相互作用的研究蛋白質(zhì)功能的研究蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)第八十三頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日Proteomics蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)：對(duì)特定組織細(xì)胞總蛋白的整體性研究第八十四頁(yè)，共九十七頁(yè)，2022年，8月28日蛋白質(zhì)組學(xué)研究的目的什么？解讀基因組：基因組編碼了多少基因？蛋白表達(dá)：比研究RNA表達(dá)深入了一步蛋白功能：超過(guò)1/3的蛋白質(zhì)功能不明確蛋白質(zhì)修飾：糖基化、磷酸化、酶解等蛋白質(zhì)定位：subproteome蛋白-蛋白相互作用：互作是功能的基礎(chǔ)第八十五頁(yè)，共九