蛋白質(zhì)相互作用多種方法課件

蛋白質(zhì)相互作用研究方法Proteininteraction：twoormoreproteins(sameordifferent)interactorformcomplex人類蛋白質(zhì)組相用

有一些蛋白質(zhì)可以以單體的形式發(fā)揮作用，但是大部分的蛋白質(zhì)都是和伴侶分子或是與其他蛋白質(zhì)一起發(fā)揮作用的。蛋白質(zhì)相關(guān)知識(shí)及研究蛋白質(zhì)相互作用的必要性運(yùn)用生物信息學(xué)的方法由繁入簡(jiǎn)實(shí)驗(yàn)分析的方法由簡(jiǎn)入繁整體系統(tǒng)部分單體酵母蛋白質(zhì)相互作用聯(lián)絡(luò)圖人蛋白質(zhì)相互作用聯(lián)絡(luò)圖研究蛋白質(zhì)相互作用的目的是發(fā)現(xiàn)并明確其相互作用的生物學(xué)意義蛋白質(zhì)相互作用是一種表象，通過表象分析規(guī)律，是研究蛋白質(zhì)相互作用的核心“種瓜得瓜，種豆得豆”是一種表象，反映了遺傳這樣一種本質(zhì)現(xiàn)象可研究對(duì)象合適的研究方法

研究蛋白質(zhì)相互作用的意義1、蛋白質(zhì)間的相互作用是細(xì)胞生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。2、基因只是決定蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)才是發(fā)揮作用的主體。蛋白質(zhì)的相互作用是發(fā)揮其功能的主要活動(dòng)。研究蛋白質(zhì)相互作用是為了研究相應(yīng)的生物學(xué)功能確定研究目標(biāo)尋找相互作用建立相互作用網(wǎng)絡(luò)和功能體系免疫共沉淀噬菌體展示技術(shù)酵母雙雜交技術(shù)基因外抑制子合成致死篩選分子生物學(xué)方法Pulldown試驗(yàn)遺傳學(xué)方法蛋白質(zhì)相互作用研究方法生物物理學(xué)方法串聯(lián)親和純化

免疫共沉淀

（co-immunoprecipitation，CO-IP）

當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也可能沉淀下來。蛋白質(zhì)Y的沉淀是基于與蛋白質(zhì)X的物理性相互作用，稱為免疫共沉淀。

Westernblot：變性抗原，主要用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的存在與否。免疫共沉淀：非變性抗原，用于鑒定不同蛋白質(zhì)間的相互作用。多采用非離子變性劑（NP40或TritonX-100)免疫共沉淀檢測(cè)蛋白質(zhì)的原理和常見問題YABAYBY非特異性實(shí)驗(yàn)過程實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵1、實(shí)驗(yàn)最需要注意點(diǎn)就是抗體的性質(zhì)?？贵w不同和抗原結(jié)合能力也不同，特別是多抗的特異性是問題。2、為防止蛋白的分解、修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3、考慮抗體/緩沖液的比例?？贵w過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。主要用于：兩種感興趣蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)存在相互作用；也用于鑒定一個(gè)特定蛋白質(zhì)的未知相互作用蛋白。

注意：1要求在一系列清洗過程中保持蛋白質(zhì)復(fù)合體不變。因?yàn)槌霈F(xiàn)假陽(yáng)性的概率比較高。

2設(shè)置的對(duì)照：在對(duì)照組中使用對(duì)照抗體，以缺失目的蛋白的細(xì)胞系作為陰性對(duì)照等等。優(yōu)點(diǎn)：1、相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；2、蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；3、可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點(diǎn)：1、可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；2、兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；3、如用westernblot檢驗(yàn)，必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性，靈敏度不如親和色譜高。靶蛋白X基因亞克隆到帶有GST基因的原核表達(dá)載體中，并在細(xì)菌中表達(dá)GST融合蛋白（GST-X）把GST融合蛋白(探針、誘餌蛋白)掛到帶有GST底物的Sepharosebeads上，然后把另一種含目的蛋白質(zhì)（捕獲蛋白）的溶液加入其中。由于谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀GST融合蛋白，如發(fā)生相互作用則形成復(fù)合物：GST-X-Y，沉淀收集下來，洗脫非特異結(jié)合的蛋白后采用SDS鑒定與誘餌蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)。原理GST-Pulldown

Assay右：對(duì)照，中間翻轉(zhuǎn)混合時(shí)發(fā)生相互作用，膠上只與GST融合蛋白結(jié)合而不與GST結(jié)合的特異性條帶表示新的相互作用蛋白。GSTpulldownGSTFusionProteinPurificationbindingwashelution檢測(cè)GST融合蛋白與靶蛋白相互作用：1、放射性標(biāo)記融合蛋白：快速簡(jiǎn)單易行2、抗GST抗體檢測(cè)3、生物素標(biāo)記融合蛋白：沒有放射性，但可能對(duì)探針蛋白和其他蛋白的相互作用有影響。應(yīng)用：一確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用；一是鑒定兩個(gè)已知蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。特點(diǎn)：比較簡(jiǎn)便，如果用抗GST抗體檢測(cè)或生物素標(biāo)記融合蛋白避免了使用同位素等危險(xiǎn)物質(zhì)，在蛋白質(zhì)相互作用研究中有很廣泛的應(yīng)用。融合蛋白具有高通量性、高選擇性的特點(diǎn)，由于融合蛋白的多樣性以及表達(dá)系統(tǒng)的多樣性(如細(xì)菌、果蠅、哺乳動(dòng)物)，該方法能夠研究蛋白質(zhì)在復(fù)雜體系中的相互作用。

注意：該方法的成功應(yīng)用取決于是否能夠得到足夠多，并且保持蛋白質(zhì)活性的重組融合蛋白，且無(wú)過度降解（探針蛋白變成不同降解產(chǎn)物的混合物）和不溶，以及如何避免內(nèi)源性誘餌蛋白的干擾。串聯(lián)親和純化（TAP）近年來質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展迅速，其功能強(qiáng)大且靈敏度高，常用來鑒定相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合體或復(fù)合體亞基，但通常難以獲得足夠量純化的蛋白質(zhì)復(fù)合體，成為質(zhì)譜在這方面應(yīng)用的一個(gè)限速步驟。1999年Rigaut（德國(guó)）等人共同提出了一套分離復(fù)合蛋白的新方法—串聯(lián)親和純化(Tandemaffinitypurification，TAP)，兼具標(biāo)準(zhǔn)親和純化（可以得到高純度地拷貝數(shù)的蛋白質(zhì)復(fù)合體）和免疫共沉淀（用于特異性的標(biāo)記蛋白與親和柱之間的相互作用）兩種生化方法的優(yōu)點(diǎn)，為蛋白質(zhì)復(fù)合體的分離鑒定提供了一條新路徑。

適用：研究蛋白質(zhì)復(fù)合體中多個(gè)蛋白質(zhì)間的相互作用，特別適用于研究蛋白質(zhì)在生理?xiàng)l件下的相互作用首先通過基因工程給被分離純化蛋白的一端加一個(gè)TAP標(biāo)簽，該標(biāo)簽由IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ProtA)及一個(gè)鈣調(diào)蛋白結(jié)合多肽(CBP)組成，結(jié)構(gòu)域與多肽之間由一個(gè)TEV蛋白酶切位點(diǎn)隔開。原理方法

1、基因重組將細(xì)胞內(nèi)源性的目標(biāo)蛋白基因置換為帶有TAP標(biāo)簽的基因，溫和裂解細(xì)胞，獲取細(xì)胞抽提物。

2、將抽提物加入IgG親和柱，TAP標(biāo)簽的ProtA端會(huì)與IgG形成強(qiáng)結(jié)合，在用洗脫液洗脫掉大部分非特異性結(jié)合物和雜蛋白。

實(shí)驗(yàn)流程3、含有TEV蛋白酶的洗脫夜將蛋白質(zhì)復(fù)合體切割下來。在鈣離子參與下，被切割下來帶有CBP的蛋白質(zhì)復(fù)合體與鈣調(diào)蛋白緊密結(jié)合，充分洗脫，就可以進(jìn)一步去除非特異作用的蛋白質(zhì)雜質(zhì)，最后純化出高純度的目的蛋白復(fù)合體。4、經(jīng)過串聯(lián)親和純化的目的蛋白，通過SDS或者雙向電泳分離之后，找出與目的蛋白相互作用的蛋白質(zhì)，采用質(zhì)譜分析的方法對(duì)其進(jìn)行分析鑒定。Mammalian

Tap-tag-LC-MS/MS

method

TAP優(yōu)點(diǎn)加工和修飾過的蛋白可以作誘餌，相互作用發(fā)生在天然環(huán)境和細(xì)胞部位，一次操作可以分離和分析多組分的復(fù)合物，得到廣泛應(yīng)用，由于TAP標(biāo)簽的高度特異性以及采用兩步洗脫純化法，在純化過程中不需要強(qiáng)烈沖洗，因此可以更好地保持較不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)復(fù)合物，而且非特異蛋白的量也會(huì)很低，這是一步純化法所不能比擬的?？朔穗p雜交篩選步驟復(fù)雜、假陽(yáng)性結(jié)果較多、難于量化、不能滿足大規(guī)模蛋白質(zhì)組研究需要的缺陷。TAP缺點(diǎn)更傾向于高豐度和穩(wěn)定的相互作用，許多低親和力、瞬時(shí)和依賴特殊細(xì)胞環(huán)境的相互作用可能檢測(cè)不到。另外，TAP必須采用能產(chǎn)生表達(dá)TAP標(biāo)簽的蛋白，這種標(biāo)簽蛋白的表達(dá)最好接近生理水平，所以最好將帶標(biāo)簽的基因用天然啟動(dòng)子表達(dá)。但在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，天然啟動(dòng)子表達(dá)標(biāo)簽蛋白是非常困難的，其表達(dá)水平不同于無(wú)標(biāo)簽的內(nèi)源蛋白，由非生理水平的誘餌蛋白而產(chǎn)生假陽(yáng)性。親和純化（affinitypurification

）純化：

抗體

Epitope-tag：flag,myc,HA,V5,GST…

核酸Pull-downImmunoprecipitationTAP(TandemAffinityPurification)

酵母雙雜交（Yeasttwo-hybrid

）

1989年Field等發(fā)明了酵母雙雜交系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用了酵母的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子GAL4含有的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,DNA結(jié)合域(DNAbindingdomain,BD)及轉(zhuǎn)錄激活域(activationdomain,AD),將已知基因(誘餌基因)和靶基因或含有靶基因的cDNA分別構(gòu)建在含BD及AD質(zhì)粒載體上,將這兩種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞,若BD結(jié)合的誘餌蛋白能夠與AD結(jié)合的靶蛋白或文庫(kù)中某些cDNA編碼的蛋白相互作用、彼此間結(jié)合時(shí),則會(huì)導(dǎo)致位于側(cè)翼的BD與AD在空間上接近,呈現(xiàn)GAL4轉(zhuǎn)錄因子的完全活性,啟動(dòng)下游的報(bào)告基因如His及LacZ等基因的表達(dá),從而在特定的缺陷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。一、酵母雙雜交系統(tǒng)基本原理典型的真核生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子，如GAL4、GCN4、等都含有二個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域:DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activatingdomain)。前者可識(shí)別DNA上的特異17bp長(zhǎng)序列（UAS），并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用，啟動(dòng)它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。His,β-galBD和AD功能上相互獨(dú)立又互相依賴，只有通過某種方式結(jié)合在一起才具有完整的轉(zhuǎn)錄因子活性據(jù)此可將兩個(gè)待測(cè)蛋白（X和Y）分別與這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域建成融合蛋白（BD-X和AD-Y），并共表達(dá)于同一個(gè)酵母細(xì)胞內(nèi)，如果兩個(gè)待測(cè)蛋白間能相互作用，就會(huì)通過待測(cè)蛋白的橋梁作用使AD與BD形成一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄激活因子，并激活相應(yīng)的報(bào)告基因表達(dá)。通過對(duì)報(bào)告基因的檢測(cè)就可很容易知道待測(cè)分子間是否發(fā)生了相互作用。進(jìn)一步用已知蛋白X作為誘餌，分離獲得與之相互作用的蛋白質(zhì)Y及其編碼序列。His,β-gal二、酵母雙雜交系統(tǒng)組成與BD融合的蛋白表達(dá)載體誘餌蛋白baitprotein與AD融合的蛋白表達(dá)載體靶蛋白preyprotein帶有多個(gè)報(bào)告基因的宿主菌株

HIS3、URA3、LacZ和LEU2等報(bào)告基因LacZreporter-Blue/WhiteScreeningHIS3reporter-ScreenonHis+media(usuallyneedtoadd3ATtoincreaseselectivity)LEU2reporter-ScreenonLeu+mediaADE2reporter-ScreenonAde+mediaURA3reporter-ScreenonUra+media(candonegativeselectionbyaddingFOA)

X-β-半乳糖苷酶藍(lán)白斑顯色分析舉例X-BD+Y-ADX-BD+gal4-ADGal4-BD+Y-ADgal4-BD+gal4-ADYeasttwo-hybrid（酵母雙雜交）應(yīng)用

發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質(zhì)

鑒定和分析已有的蛋白質(zhì)間的相互作用

確定蛋白質(zhì)間相互作用的功能基團(tuán)lacZUASDBADlacZUASADDBlacZlacZUASADYDBXlacZ發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質(zhì)BDB-PrMarker1AD基因庫(kù)Marker2lacZUASADYlacZDBB-prBDB-PrMarker1AD基因庫(kù)Marker2lacZUASADlacZDBB-prBDB-PrMarker1YAD基因庫(kù)Marker2文庫(kù)篩選的步驟1、將待測(cè)基因與Gal4或LexA或其他合適蛋白的DNA結(jié)合域融合構(gòu)建誘餌質(zhì)粒。2、將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化缺乏報(bào)告基因啟動(dòng)子的酵母細(xì)胞株中，選擇被轉(zhuǎn)化的酵母。3、再將文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母中。4、通過報(bào)告基因的功能篩選相互作用的蛋白。確定蛋白質(zhì)間相互作用的功能基團(tuán)ProteinA1234BDB-PrMarker1AD1Marker2AD2Marker2AD3AD3白蘭白白鑒定和分析已有的蛋白質(zhì)間的相互作用BDB-PrMarker1ADA-PrMarker2蘭：相互作用白：不相互作用序列分析

從酵母中分離質(zhì)粒然后轉(zhuǎn)化E.coli從大腸桿菌中提取質(zhì)粒并測(cè)序在數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)所測(cè)定序列與已知蛋白的同源性酵母雙雜交測(cè)序結(jié)果酵母雙雜交得到的陽(yáng)性克隆子質(zhì)粒經(jīng)過DNA測(cè)序，由NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST檢索cDNA編碼的蛋白質(zhì)舉例測(cè)序結(jié)果查詢過程cDNA序列NCBIBLASTNucleotidemegablastsearchformatresultsBlast舉例Results舉例優(yōu)點(diǎn)

1、快速獲得相互作用蛋白的基因2、只需單一步驟的質(zhì)粒構(gòu)建3、檢測(cè)在真核活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行,在一定程度上

代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。4、作用信號(hào)是在融合基因表達(dá)后,在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的,省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟5、檢測(cè)的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng),因而可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用。6、酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細(xì)胞類型和分化時(shí)期材料構(gòu)建cDNA文庫(kù),能分析細(xì)胞漿、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細(xì)胞部位及功能的蛋白。7、通過mRNA產(chǎn)生多種穩(wěn)定的酶使信號(hào)放大。同時(shí),酵母表型,X—Gal及HIS3蛋白表達(dá)等檢測(cè)方法均很敏感局限性1、雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等，這些反應(yīng)在核內(nèi)無(wú)法進(jìn)行。另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴于其他非酵母蛋白的輔助，這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究。2、假陽(yáng)性是酵母雙雜交系統(tǒng)的最