蛋白質(zhì)化學(xué)及相關(guān)試驗(yàn)

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ti&riTiionl尋nd蛋白質(zhì)化學(xué)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)一.氨基酸混合物的分析分離（一）分配層析法的一般原理.混合物在層析系統(tǒng)中的分離決定于該混合物的組分在移動相（可以是 ）和固定相（ ）兩相分配系數(shù).逆流分溶原理：一定量的某一溶質(zhì)在一定量的溶劑系統(tǒng)中分配時，轉(zhuǎn)移次數(shù)越多，即分溶管數(shù)越多，其分溶曲線越集中，即峰形越窄而高，這樣有利于混合物中各物質(zhì)的完全分離。（二）層析方法.紙層析（1）支持物:紙，紙上的羥基具有親水性，因此能吸附一層水作為固定相，而通常有機(jī)溶劑作為流動相（2）原理：是根據(jù)溶質(zhì)物質(zhì)的極性進(jìn)行分離的。相對遷移率Rf=X/Y圖3—8.柱層析（1）填充物：親水性的不溶物質(zhì)，如纖維素、淀粉、硅膠等。（2）洗月脫劑：與水不互溶的溶劑，如苯酚、正丁醇等。.離子交換層析（1）離子交換樹脂基質(zhì)：是具有酸性或堿性基團(tuán)的人工合成聚苯乙烯（單體）-苯二乙烯（交聯(lián)劑）進(jìn)行聚合和交聯(lián)反應(yīng)生成的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的不溶性的高分子化合物。樹脂一般都制成：球形的顆粒。帶電基團(tuán)：是通過化學(xué)反應(yīng)引入基質(zhì)。有陽離子和陰離子兩種交換樹脂。（2）氨基酸與樹脂的親和力：取決于它們之間的靜電吸引和氨基酸側(cè)鏈與樹脂基質(zhì)間的疏水相互作用。.吸附層析（1）吸附劑：如氧化鋁、硅膠、活性炭等（2）各種成分的分離過程：溶解、吸附、再溶解、再吸附（六）薄層層析（七）氣液層析流動相為氣體（氫、氮、氮），固定相為涂漬在固體顆粒表面的液體時稱為氣液層析或氣液色譜，簡稱為氣相色譜。（八）高效（壓）液相層析HPLC固定相支持劑顆粒很細(xì)，因而表面積很大。溶劑系統(tǒng)采取高壓。一、肽（是氨基酸的線性聚合物）xcfi：—coo-Amino-

terTniinalend肽：一個氨基酸的竣基和另一個氨基酸的氨基脫水縮合而成的化合物。其中的氨基酸單位稱氨基酸殘基。肽鍵：氨基酸間月兌水后形成的共價鍵稱肽鍵（酰氨鍵）寡肽：25（10個）個氨基酸殘基以下。多肽：多于25個（10個）氨基酸殘基的肽鏈。

環(huán)狀肽：肽和肽鍵結(jié)構(gòu).肽鍵的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（P164）：肽鍵的特點(diǎn)是氮原子上的孤對電子與羰基具有明顯的共軛作用。組成肽鍵的原子處于同一平面。肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵特性，不能自由旋轉(zhuǎn),呈現(xiàn)相對的剛性和平面化。肽鍵的亞氨基沒有明顯的解離和質(zhì)子化。除脯氨酸外，多以反式結(jié)構(gòu)存在。.肽平面、肽單位、二面角肽平面：連接在肽鍵上的六個原子共處于一個平面上。肽單位：肽鏈主鏈上的重復(fù)結(jié)構(gòu)，C「CO-NH-C.。二面角：在多肽鏈里，C.碳原子剛好位于互相連接的兩個肽平面的交線上。C.碳原子上的Ca-C和Ca-N可以繞軸旋轉(zhuǎn)，角度為山和力，這就是a-碳原子上的一對二面角。它決定了由a-碳原子連接的兩個肽單位的相對位置。（二）肽的物理化學(xué)性質(zhì)肽的晶體是離子晶格，溶點(diǎn)高。具有兩性解離和等電點(diǎn)：肽的酸堿性質(zhì)一一決定于末端a-氨基和a-竣基及R基。pH>R基pKa.[HA]<[A-]pH<R基pKa.[HA]>[A-]多肽鏈中可解離功能團(tuán)的pKa值（記）例：Gly-Glu-Lys-Ala具有旋光性。茚三酮反應(yīng)、a-氨基和a-竣基及R基的反應(yīng)。茚三酮反應(yīng)不是肽的特有反應(yīng)。N端是脯氨酸或焦谷氨酸時無a-氨基試劑的反應(yīng)具有雙縮脲反應(yīng)：（參看實(shí)驗(yàn)講義）具紫外吸收：在280nm處有最大吸收峰，可進(jìn)行肽類定量測定。（三）天然存在的活性肽具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。含有非蛋白質(zhì)氨基酸和肽鍵。例1：a-鵝膏蕈堿（環(huán)狀八肽，劇毒毒素。能與真核生物的RNA聚合酶H牢固結(jié)合而抑制酶的活性）。谷胱甘肽：Y-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸一、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（共價結(jié)構(gòu)、化學(xué)結(jié)構(gòu)）指多肽鏈中氨基酸的序列。包括二硫鍵的位置。（一）蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定要求樣品必須是均一的。純度在97%以上知道蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量.測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目經(jīng)測定末端基（C端或N端），看蛋白質(zhì)的摩爾數(shù)與末端基的摩爾數(shù)的比例？.拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈和二硫鍵借助非共價相互作用締合的（亞基之間）采用變性劑：8mol/L尿素；6mol/L鹽酸胍；SDS處理。通過共價二硫橋（S—S）交聯(lián)的

采用氧化劑或還原劑：將二硫鍵斷裂。.分析每一多肽鏈的氨基酸組成待測樣品經(jīng)酸（6mol/LHCl）和堿（5mol/LNaOH）完全水解，用氨基酸分析儀進(jìn)行測定（或?qū)游龇ǎ?。表示方法：每摩爾蛋白質(zhì)中含氨基酸殘基的摩爾數(shù)?；?00克蛋白質(zhì)中含氨基酸的克數(shù)。.測定多肽鏈的氨基酸序列多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化原理：選用專一性強(qiáng)的、斷裂點(diǎn)少的、反應(yīng)產(chǎn)率高的蛋白水解酶或化學(xué)試劑進(jìn)行有控制的裂解。后將所得混合物進(jìn)行分離純化。常用方法：酶解法化學(xué)法酶解法（P174）胰蛋白酶：水解Lys、Arg的竣基所形成的肽鍵。糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：R1=Phe、Trp、Tyr嗜熱菌蛋白酶：胃蛋白酶：氨肽酶竣肽酶：化學(xué)法澳化氰水解法（CNBr）:切割Met的竣基所形成的肽鍵。用羥胺斷裂:它斷裂一Asn-Gly-,但專一性不高。蛋白質(zhì)中出現(xiàn)機(jī)率低，適于分子量大的蛋白質(zhì)序列的測定。.確定肽段在多肽鏈中的次序例：胰島素B鏈的測序（180頁）所得資料：N一末端殘基HC一末端殘基S第一套肽段OUSPSEOVERLAHOWT第二套肽段SEOWTOUVERLAPSHO借助重疊肽確定肽段次序：HOWTOUSEOVERLAPS6.確定原多肽鏈中二硫鍵的位置采用胃蛋白酶：專一性低，切點(diǎn)多。肽段比較小，分離、鑒定比較容易。作用pH在酸性范圍（2）有利于防止二硫鍵發(fā)生交換反應(yīng)。肽段混合物進(jìn)行Brown及Hartly的對角線電泳：例：有一個A肽：1）酸水解得到：Ala、Arg、Ser、Glu、Phe、Met；2）當(dāng)A肽與FDNB試劑反應(yīng)后得：DNP-Ala；3）當(dāng)A肽用CNBr降解時得到：游離的Ser和一種肽；4）當(dāng)A肽用胰蛋白酶降解時得到兩種肽：一種含Ala、Arg,另一種含其它氨基酸5）當(dāng)A肽用糜蛋白酶降解時得到兩種肽：一種含Met、Ser,另一種含其它氨基酸；問A肽的氨基酸排列順序如何？答：Ala—Arg—Glu—phe—Met—Ser第五節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)、分離和純化一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)與蛋白質(zhì)電泳二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀三、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性四、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定

五、蛋白質(zhì)的分離純化原則六、蛋白質(zhì)的分離純化方法七、蛋白質(zhì)的含量測定與純度鑒定一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)與蛋白質(zhì)電泳.蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和蛋白質(zhì)的等離子點(diǎn):蛋白質(zhì)電泳（Electrophoresis）：在不同的pH環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)不同。在等電點(diǎn)偏酸性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動；在等電點(diǎn)偏堿性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場中向負(fù)極移動。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳。利用蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象，可以將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。.影響電泳遷移率的主要因素：凝膠的分子篩效應(yīng)對長短不同的棒形分子會產(chǎn)生不同的阻力（主要因素〕凝膠的濃度和交聯(lián)度同一電泳條件下，分子小，受阻小，游動快，遷移率大。相對分子質(zhì)量大者，遷移率小.PAGE（非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳）：分子的分離是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小，以及它的凈（負(fù)或正）電荷。較小的分子量，較多的凈負(fù)（或正）電荷向正（或負(fù)）極移動的快。4.SDS（變性聚丙烯酰胺凝膠電泳）：所有蛋白質(zhì)都帶有與質(zhì)量成比例的相同負(fù)電荷。最小的蛋白質(zhì)遷移最遠(yuǎn)。用于測定蛋白質(zhì)樣品的純化程度、蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量和蛋白質(zhì)中多肽亞基的數(shù)量。Fig.2蛋白質(zhì)的凝膠電泳5.等電聚焦和雙向凝膠電泳使用大孔隙聚丙烯酰胺凝膠并含有兩性聚電解質(zhì)，如果將電場加到凝膠上，兩性聚電解質(zhì)遷移并產(chǎn)生pH梯Fig.2蛋白質(zhì)的凝膠電泳蛋白質(zhì)混合物是在具有pH梯度的介質(zhì)進(jìn)行的。各種蛋白質(zhì)到達(dá)pH等于它的pI位置時，即不再移動成條帶。雙向凝膠電泳：等電聚焦與SDS相結(jié)合的電泳方法。二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀（一）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì).蛋白質(zhì)溶液是膠體溶液.維持蛋白質(zhì)的膠體系統(tǒng)穩(wěn)定的因素1-100nm大小的質(zhì)點(diǎn)在動力學(xué)上是穩(wěn)定的.某一pH下質(zhì)點(diǎn)帶有同種電荷，互相排斥。質(zhì)點(diǎn)能與溶劑（水）形成水化層，相互間不易靠攏。（二）蛋白質(zhì)的沉淀作用（P300）.可逆沉淀：.不可逆沉淀：.沉淀蛋白質(zhì)的方法等電點(diǎn)沉淀（可逆，不變性）強(qiáng)酸堿沉淀（不可逆）：蛋白質(zhì)的鹽析（可逆，不變性）：硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉。有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)（可逆或不可逆）：乙醇、丙酮或甲醇。重金屬鹽和生物堿劑沉淀蛋白質(zhì)：Hg2+、Ag2+、苦味酸。

加熱（變性）沉淀蛋白質(zhì)：三、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性.概念蛋白質(zhì)在某些外界因素的影響下，結(jié)構(gòu)狀態(tài)被破壞，引起理化性質(zhì)改變、生理活性喪失的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性。當(dāng)環(huán)境條件恢復(fù)時，蛋白質(zhì)的生物活性有可能也恢復(fù)，這就是蛋白質(zhì)的復(fù)性。NaiiivomoleculeFig.3蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性O(shè)Bfralu/edmoleGUetNaiiivomoleculeFig.3蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性O(shè)Bfralu/edmoleGUet.變性的實(shí)質(zhì)：次級鍵（有時包括二硫鍵）被破壞，天然構(gòu)象解體。變性不涉及一級結(jié)構(gòu)的破壞。.蛋白質(zhì)變性后，往往出現(xiàn)下列現(xiàn)象：生物活性喪失。硫水基團(tuán)外露，分子結(jié)構(gòu)伸展松散，易水解。溶解度降低、沉淀，粘度增加。.變性的因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑和去污劑、鹽濃度、重金屬離子、熱、機(jī)械力等。制備活性蛋白質(zhì)時嚴(yán)防蛋白質(zhì)變性。四、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定.化學(xué)組成測定法例1：肌紅蛋白和血紅蛋白含鐵量均為0.335%,計(jì)算二者的相對分子質(zhì)量。最小M=Fe分子量/Fe（%）X100=55.8/0.335=16700肌紅蛋白M=167000血紅蛋白M=167000X4=668000.沉降法在60000?80000r/min的高速離心力作用下，蛋白質(zhì)分子會沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向移動。蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和形狀有關(guān)。沉降系數(shù)是溶質(zhì)顆粒在單位離心場中的沉降速度，用S表示。一個S單位，為1X10-1秒，相對分子質(zhì)量越大，S值越大。由沉降系數(shù)S可根據(jù)斯維得貝格（Svedberg〕方程計(jì)算蛋白質(zhì)分子的相對分子質(zhì)量：M=RST/D（1—iP〕R：氣體常數(shù) T：絕對溫度D：擴(kuò)散系數(shù) P：溶劑的密度.凝膠過濾法（分子篩層析，P297-298）經(jīng)常使用的凝膠：交聯(lián)葡聚糖（44頁，Sephadex）,聚丙烯酰胺和瓊脂糖（49頁，Sepharose）。凝膠過濾的原理：與分子大小和形狀有關(guān)。顆粒大的移動快，顆粒小的移動慢。

測定方法：測幾種蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物的Ve（洗脫體）。再測待測樣品的Ve。.SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS—PAGE）SDS:十二烷基硫酸鈉，是一種陰離子去污劑，能破裂蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用。SDS以其烴鏈與蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈結(jié)合成復(fù)合體，每兩個氨基酸殘基結(jié)合一個SDS分子。不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合體具有相同的構(gòu)象，長橢圓棒，且覆蓋有相同的負(fù)電荷，具有幾乎相同的荷質(zhì)比，向正極移動。注意：電泳遷移率不受各種蛋白質(zhì)原有的電荷、分子形狀等因素的影響，而與多肽鏈分子量大小相關(guān)。分子量大的泳動慢，小的泳動快。五、蛋白質(zhì)的分離純化的原則（步驟）前處理：選材、破碎、勻漿、溶解、離心或差速離心。粗分級分離：鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑分級分離，離心。細(xì)分級分離：層折法。結(jié)晶：結(jié)晶過程本身也伴隨著一定程度的純化。六、蛋白質(zhì)的分離純化方法（P301）.根據(jù)分子大小不同的純化方法P301-304.密度梯度（區(qū)帶）離心.蛋白質(zhì)的層析X凝膠過濾（分子排阻、凝膠過濾層析、凝膠滲透層析）派離子交換層析蛋白質(zhì)的分離基于它的總凈電荷。常用離子交