實(shí)驗(yàn)三-雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量課件

實(shí)驗(yàn)雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度

實(shí)驗(yàn)雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)分光光度法測(cè)定的原理和方法2.學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)含量測(cè)定的原理和方法3.掌握雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康腃u2+堿性溶液紫紅色絡(luò)合物（雙縮脲）

一實(shí)驗(yàn)原理Cu2+堿性溶液紫紅色絡(luò)合物（雙縮脲）一實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)在堿性溶液中也能與硫酸銅發(fā)生相同反應(yīng)，產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物。

蛋白質(zhì)在堿性溶液中也能與硫酸銅發(fā)生相同反應(yīng)，產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物

蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵，因此，有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2＋形成紫紅色絡(luò)合物，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量和氨基酸成份無(wú)關(guān)。在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，未知樣品的溶液與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液同時(shí)反應(yīng)，并于540～560nm下比色，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法或?qū)φ辗ㄇ蟪鑫粗獦悠返牡鞍踪|(zhì)濃度。蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵，因此，有雙縮干擾物質(zhì)：

Tris緩沖液和某些氨基酸，凡含有－CONH2－，－CH2－NH2，－CS－NH2等基團(tuán)的物質(zhì)都會(huì)產(chǎn)生干擾。缺點(diǎn)：靈敏度低1-20mg優(yōu)點(diǎn)：快速（20-30min）不同蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近此法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。干擾物質(zhì)：二實(shí)驗(yàn)操作試管編號(hào)

1

23標(biāo)準(zhǔn)蛋白（ml）樣品（ml）H2O(ml)雙縮脲試劑（ml）

—1.0———1.02.01.01.04.04.04.0室溫放置30分鐘，于540nm處比色實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、試管要洗干凈2、取樣要準(zhǔn)確

3、加樣順序不可顛倒

4、各管試劑加完后要立即混勻

5、顯色后放置時(shí)間不可太短或過(guò)長(zhǎng)

6、儀器在使用前要預(yù)熱和校準(zhǔn)二實(shí)驗(yàn)操作試管編號(hào)12原理：物質(zhì)的電子結(jié)構(gòu)不同，所能吸收光的波長(zhǎng)也不同，這就構(gòu)成了物質(zhì)對(duì)光的選擇吸收基礎(chǔ)。根據(jù)物質(zhì)對(duì)光的吸收特征和吸收強(qiáng)度，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量的分析方法，常用紫外—可見(jiàn)分光光度法。光的電磁波性質(zhì)射線x射線紫外光紅外光微波無(wú)線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可見(jiàn)光三分光光度法原理：物質(zhì)的電子結(jié)構(gòu)不同，所能吸收光的波長(zhǎng)也不同，這就構(gòu)成了定性分析與定量分析的基礎(chǔ)

物質(zhì)對(duì)光的選擇吸收A在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，物質(zhì)對(duì)光的吸收與物質(zhì)的濃度成正比。AC增大定性分析基礎(chǔ)定量分析基礎(chǔ)定性分析與定量分析的基礎(chǔ)物質(zhì)對(duì)光的選擇吸收A在一定的實(shí)驗(yàn)I0I參比樣品入射光I0透射光I

一束單色光通過(guò)溶液介質(zhì)后，光能被吸收一部分，吸收多少與溶液的濃度和厚度成正比。在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，物質(zhì)對(duì)光的吸收與物質(zhì)的濃度成正比。Lambert—Beer定律A=εCLT（透射比）=I/I0=10-CLlg(1/T)=CLA為吸光度；ε為吸收系數(shù)；C為溶液濃度；L為溶液光程的厚度I0I參比樣品入射光I0透射光I一束單色光通過(guò)溶應(yīng)用（1）比較吸收光譜曲線（2）比較最大吸收波長(zhǎng)蛋白質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)為280nm，核酸的最大吸收波長(zhǎng)為260nm。（3）比較吸光度的比值

純DNA應(yīng)用1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（至少5個(gè)）按測(cè)定管同樣方法處理顯色，在選定的波長(zhǎng)分別測(cè)定各管的吸光度（A），以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（C）為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的A從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品含量，再計(jì)算出樣品的濃度。常用方法標(biāo)準(zhǔn)系列未知樣品1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法常用方法標(biāo)準(zhǔn)系列未知樣品

標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品的測(cè)定條件必須一致。

待測(cè)樣品的濃度必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

2.標(biāo)準(zhǔn)管法

CX/AX=CS/AS，已知CS，測(cè)定AS、AX，可求得CX。

3.摩爾吸光系數(shù)法

C=A/（為L(zhǎng)=1cm，C為1mol/L時(shí)的吸光系數(shù)，也稱(chēng)為摩爾吸光系數(shù)。）2.標(biāo)準(zhǔn)管法四分光光度計(jì)的使用

四分光光度計(jì)的使用

單波長(zhǎng)單光束分光光度計(jì)0.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)單波長(zhǎng)單光束分光光度計(jì)0.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示紫

1．722型分光光度計(jì)的外形1．722型分光光度計(jì)的外形2.儀器操作鍵介紹“方式設(shè)定”鍵（MODE）：用于設(shè)置測(cè)試方式“100%T/0ABS”鍵：用于自動(dòng)調(diào)整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%T”鍵：用于自動(dòng)調(diào)整零透射比“波長(zhǎng)設(shè)置”旋鈕：用于設(shè)置分析波長(zhǎng)2.儀器操作鍵介紹3.樣品測(cè)試操作①打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，使儀器預(yù)熱20分鐘②用“波長(zhǎng)設(shè)置”按鈕將波長(zhǎng)設(shè)置在您將要使用的分析波長(zhǎng)位置上③打開(kāi)樣品室蓋，將參比溶液倒入比色皿中放入比色皿架靠近測(cè)定者一端位置，并將樣品溶液倒入比色皿中放入比色皿架的其它位置，蓋好樣品室蓋。④拉動(dòng)比色皿架拉桿一小格使比色皿架擋住光路，按“0%T”鍵調(diào)透射比為零⑤推入比色皿架使參比溶液位于光路中，蓋好樣品室蓋，按“100%T”調(diào)100%透射比⑥按“方式鍵”（MODE）將測(cè)試方式設(shè)置為吸光度方式A，此時(shí)應(yīng)顯示為0，如果不是則按“100%T”再調(diào)A零⑦將被測(cè)溶液拉入光路中，此時(shí)，顯示器上所顯示是被測(cè)樣品的吸光度參數(shù)⑧實(shí)驗(yàn)完成后，關(guān)閉電源，洗凈比色皿，并蓋好蓋布。在簽名本上簽名。3.樣品測(cè)試操作

返回光路返回光路

返回光路返回光路返回返回比色皿的使用

1.由于紫外光不能透過(guò)玻璃比色皿，紫外光區(qū)測(cè)量時(shí)要用石英比色皿。

2.同組使用的比色皿必須配套（規(guī)格、新舊程度一致）。

3.比色皿2光面與2毛面，光學(xué)表面對(duì)準(zhǔn)光路，不能有任何污損，否則會(huì)引起光吸收的增加。

4.比色皿中所盛溶液不能太少，也不能太多，一般所盛液體約占全部容積的2/3。

5.腐蝕性溶液不得長(zhǎng)期盛放在比色皿中。

6.每次使用后,應(yīng)立即倒空，然后用水沖洗比色皿。比色皿的使用

空白管的作用

測(cè)量過(guò)程中，因比色皿本身和溶劑也會(huì)產(chǎn)生一定的光吸收，故設(shè)置一個(gè)空白管，即其中除了待測(cè)溶質(zhì)以外，其它的成分完全相同。測(cè)量時(shí)，首先以空白管對(duì)準(zhǔn)光路對(duì)儀器調(diào)零，既消除比色皿本身對(duì)光的吸收，又消除了非待測(cè)物對(duì)光的吸收，所測(cè)值即為待測(cè)物造成的光吸收?？瞻坠艿淖饔?/p>

謝謝謝謝實(shí)驗(yàn)雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度

實(shí)驗(yàn)雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)分光光度法測(cè)定的原理和方法2.學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)含量測(cè)定的原理和方法3.掌握雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康腃u2+堿性溶液紫紅色絡(luò)合物（雙縮脲）

一實(shí)驗(yàn)原理Cu2+堿性溶液紫紅色絡(luò)合物（雙縮脲）一實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)在堿性溶液中也能與硫酸銅發(fā)生相同反應(yīng)，產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物。

蛋白質(zhì)在堿性溶液中也能與硫酸銅發(fā)生相同反應(yīng)，產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物

蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵，因此，有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2＋形成紫紅色絡(luò)合物，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量和氨基酸成份無(wú)關(guān)。在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，未知樣品的溶液與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液同時(shí)反應(yīng)，并于540～560nm下比色，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法或?qū)φ辗ㄇ蟪鑫粗獦悠返牡鞍踪|(zhì)濃度。蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵，因此，有雙縮干擾物質(zhì)：

Tris緩沖液和某些氨基酸，凡含有－CONH2－，－CH2－NH2，－CS－NH2等基團(tuán)的物質(zhì)都會(huì)產(chǎn)生干擾。缺點(diǎn)：靈敏度低1-20mg優(yōu)點(diǎn)：快速（20-30min）不同蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近此法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。干擾物質(zhì)：二實(shí)驗(yàn)操作試管編號(hào)

1

23標(biāo)準(zhǔn)蛋白（ml）樣品（ml）H2O(ml)雙縮脲試劑（ml）

—1.0———1.02.01.01.04.04.04.0室溫放置30分鐘，于540nm處比色實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、試管要洗干凈2、取樣要準(zhǔn)確

3、加樣順序不可顛倒

4、各管試劑加完后要立即混勻

5、顯色后放置時(shí)間不可太短或過(guò)長(zhǎng)

6、儀器在使用前要預(yù)熱和校準(zhǔn)二實(shí)驗(yàn)操作試管編號(hào)12原理：物質(zhì)的電子結(jié)構(gòu)不同，所能吸收光的波長(zhǎng)也不同，這就構(gòu)成了物質(zhì)對(duì)光的選擇吸收基礎(chǔ)。根據(jù)物質(zhì)對(duì)光的吸收特征和吸收強(qiáng)度，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量的分析方法，常用紫外—可見(jiàn)分光光度法。光的電磁波性質(zhì)射線x射線紫外光紅外光微波無(wú)線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可見(jiàn)光三分光光度法原理：物質(zhì)的電子結(jié)構(gòu)不同，所能吸收光的波長(zhǎng)也不同，這就構(gòu)成了定性分析與定量分析的基礎(chǔ)

物質(zhì)對(duì)光的選擇吸收A在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，物質(zhì)對(duì)光的吸收與物質(zhì)的濃度成正比。AC增大定性分析基礎(chǔ)定量分析基礎(chǔ)定性分析與定量分析的基礎(chǔ)物質(zhì)對(duì)光的選擇吸收A在一定的實(shí)驗(yàn)I0I參比樣品入射光I0透射光I

一束單色光通過(guò)溶液介質(zhì)后，光能被吸收一部分，吸收多少與溶液的濃度和厚度成正比。在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，物質(zhì)對(duì)光的吸收與物質(zhì)的濃度成正比。Lambert—Beer定律A=εCLT（透射比）=I/I0=10-CLlg(1/T)=CLA為吸光度；ε為吸收系數(shù)；C為溶液濃度；L為溶液光程的厚度I0I參比樣品入射光I0透射光I一束單色光通過(guò)溶應(yīng)用（1）比較吸收光譜曲線（2）比較最大吸收波長(zhǎng)蛋白質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)為280nm，核酸的最大吸收波長(zhǎng)為260nm。（3）比較吸光度的比值

純DNA應(yīng)用1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（至少5個(gè)）按測(cè)定管同樣方法處理顯色，在選定的波長(zhǎng)分別測(cè)定各管的吸光度（A），以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（C）為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的A從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品含量，再計(jì)算出樣品的濃度。常用方法標(biāo)準(zhǔn)系列未知樣品1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法常用方法標(biāo)準(zhǔn)系列未知樣品

標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品的測(cè)定條件必須一致。

待測(cè)樣品的濃度必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

2.標(biāo)準(zhǔn)管法

CX/AX=CS/AS，已知CS，測(cè)定AS、AX，可求得CX。

3.摩爾吸光系數(shù)法

C=A/（為L(zhǎng)=1cm，C為1mol/L時(shí)的吸光系數(shù)，也稱(chēng)為摩爾吸光系數(shù)。）2.標(biāo)準(zhǔn)管法四分光光度計(jì)的使用

四分光光度計(jì)的使用

單波長(zhǎng)單光束分光光度計(jì)0.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)單波長(zhǎng)單光束分光光度計(jì)0.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示紫

1．722型分光光度計(jì)的外形1．722型分光光度計(jì)的外形2.儀器操作鍵介紹“方式設(shè)定”鍵（MODE）：用于設(shè)置測(cè)試方式“100%T/0ABS”鍵：用于自動(dòng)調(diào)整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%T”鍵：用于自動(dòng)調(diào)整零透射比“波長(zhǎng)設(shè)置”旋鈕：用于設(shè)置分析波長(zhǎng)2.儀器操作鍵介紹3.樣品測(cè)試操作①打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，使儀器預(yù)熱20分鐘②用“波長(zhǎng)設(shè)置”按鈕將波長(zhǎng)設(shè)置在您將要使用的分析波長(zhǎng)位置上③打開(kāi)樣品室蓋，將參比溶液倒入比色皿中放入比色皿架靠近測(cè)定者一端位置，并將樣品溶液倒入比色皿中放入比色皿架的其它位置，蓋好樣品室蓋。④拉動(dòng)比色皿架拉桿一小格使比色皿架擋住光路，按“0%T”鍵調(diào)透射比為零⑤推入比色皿架使參比溶