植物胚胎課件

植物胚胎培養(yǎng)技術(shù)

植物胚胎培養(yǎng)技術(shù)是指對(duì)植物的胚及其胚器官進(jìn)行人工離體無(wú)菌培養(yǎng)，使其發(fā)育成幼苗的技術(shù)。

植物胚胎培養(yǎng)包括幼胚培養(yǎng)、成熟胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)和試管受精等內(nèi)容。一、植物胚胎培養(yǎng)的基本概念1、胚胎培養(yǎng)指使胚或具胚器官在離體無(wú)菌條件下發(fā)育成幼苗的技術(shù)。廣義胚胎培養(yǎng)研究還包括胚乳培養(yǎng)和試管受精等技術(shù)。雙子葉植物胚3、胚乳培養(yǎng)指處于細(xì)胞期的胚乳組織的離體培養(yǎng)。4、胚珠培養(yǎng)指未受精或受精后的胚珠離體培養(yǎng)。不同植物的胚珠形態(tài)結(jié)構(gòu)倒生胚珠二、胚胎培養(yǎng)的應(yīng)用1、克服遠(yuǎn)緣雜交的不育性，獲稀有雜種植物2、打破種子休眠，提早結(jié)實(shí)，縮短育種年限3、使生活力低下或無(wú)生活力的種子萌發(fā)4、使柑橘類(lèi)植物合子胚正常發(fā)育5、測(cè)定種子生活力6、獲三倍體或單倍體植株7、快速繁殖特殊植物8、用于理論研究植物胚結(jié)構(gòu)幼胚培養(yǎng)成熟胚培養(yǎng)

據(jù)培養(yǎng)目的不同剝?nèi)〉碾x體胚發(fā)育時(shí)期的不同胚培養(yǎng)成熟胚培養(yǎng)一般較易獲得成功（一）幼胚培養(yǎng)幼胚完全是異養(yǎng)的，離體條件下培養(yǎng)要求培養(yǎng)基成分復(fù)雜，培養(yǎng)不易成功。

幼胚培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)：取材時(shí)期幼胚剝離培養(yǎng)條件的控制（是否需要特殊處理）幼胚（心形胚階段）對(duì)培養(yǎng)條件和營(yíng)養(yǎng)的要求都較高。需要多種的營(yíng)養(yǎng)和適宜的培養(yǎng)條件。影響幼胚培養(yǎng)成功的因素主要包括幼胚發(fā)育時(shí)期、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件等。（1）天然提取物及某些蛋白制品；1934年銀杏幼胚培養(yǎng)中添加銀杏胚乳有促進(jìn)作用；1941年曼佗羅幼胚培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)添加椰子乳能很好的促進(jìn)幼胚的發(fā)育(200-500um的幼胚)。此外，大麥胚乳、麥芽提取物、酵母提取物、水解酪蛋白等都能促進(jìn)幼胚的發(fā)育。（2）滲透壓的作用：胚發(fā)育早期要求較高的的滲透壓，而隨著胚的發(fā)育逐漸降低。幼胚培養(yǎng)時(shí)，其發(fā)育過(guò)程有以下幾種發(fā)育方式：a、胚性發(fā)育，此種方式不能萌發(fā)成苗b、早熟萌發(fā)，長(zhǎng)成的苗十分瘦弱c、產(chǎn)生愈傷組織，再由愈傷組織分化形成胚或不定芽(2)、早熟萌發(fā)(earlymaturesprouting)幼胚接種后，離體胚不繼續(xù)胚性生長(zhǎng)，而是在培養(yǎng)基上迅速萌發(fā)成幼苗，通常稱(chēng)之為早熟萌發(fā)。在大多數(shù)情況下，一個(gè)幼胚萌發(fā)成一個(gè)植株，但有時(shí)會(huì)由于細(xì)胞分裂產(chǎn)生大量的胚性細(xì)胞，以后形成許多胚狀體，從而可以形成許多植株，這種現(xiàn)象就是所謂的叢生胚現(xiàn)象。(3)、愈傷組織(callus)在許多情況下，幼胚在離體培養(yǎng)中首先發(fā)生細(xì)胞增殖，形成愈傷組織。一般來(lái)講由胚形成的愈傷組織大多為胚性愈傷組織，這種胚性愈傷組織很容易分化形成植株。（二）成熟胚培養(yǎng)成熟胚是自養(yǎng)的，培養(yǎng)基需要簡(jiǎn)單。主要目的:◆研究胚發(fā)育過(guò)程的形態(tài)建成◆生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的作用◆胚與胚乳相互關(guān)系和營(yíng)養(yǎng)要求牡丹成熟胚的離體培養(yǎng)與快速繁殖Matureembryocultureandrapidpropagationoftreepeony培養(yǎng)方法：A、將受精后成熟或未成熟種子或果實(shí)，用70%—75%酒精表面消毒消毒幾分鐘B、用0.1%升汞溶液或飽和漂白粉溶液消毒10min，無(wú)菌水反復(fù)沖洗C、無(wú)菌操作臺(tái)上，直接或在解剖鏡下剝?nèi)∨呓臃N在培養(yǎng)基上胚乳是由兩個(gè)單倍的極核和一個(gè)單倍的精子結(jié)合而成的3倍體組織。由它可獲得無(wú)子結(jié)實(shí)的3倍體植株，進(jìn)而可將它加倍成6倍體植株。

不同胚乳發(fā)育類(lèi)型及發(fā)育時(shí)期直接影響外植體取材時(shí)期以及胚乳細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織頻率。胚乳培養(yǎng)的后代，常發(fā)生細(xì)胞染色體數(shù)目變化，形成多倍體、非整倍體等。四、胚乳培養(yǎng)2、細(xì)胞型胚乳

特點(diǎn)：◆初生胚乳核的分裂開(kāi)始，即產(chǎn)生細(xì)胞壁，形成胚乳細(xì)胞◆無(wú)游離核時(shí)期大多數(shù)雙子葉合瓣花植物是這樣的胚乳，如番茄、煙草、芝麻等。3、沼生目型胚乳

◆核型胚乳與細(xì)胞型胚乳的中間類(lèi)型◆初生胚乳核的第一次分裂將胚囊分隔為兩室，其中珠孔端室比合點(diǎn)端室寬大◆核進(jìn)行分裂形成狀態(tài)的游離核，最后形成細(xì)胞（二）胚乳培養(yǎng)的關(guān)鍵A、胚乳發(fā)育時(shí)期的影響發(fā)育早期胚乳：操作不便，誘導(dǎo)率低游離核期或剛轉(zhuǎn)入細(xì)胞期的核型胚乳：難得callus旺盛生長(zhǎng)期胚乳：易誘導(dǎo)產(chǎn)生callus★旺盛期胚乳特征

§胚已分化完成

§胚乳已形成細(xì)胞組織

§充分生長(zhǎng)，達(dá)到成熟大小

§外觀(guān)為半透明的固體狀

§富有彈性水稻：授粉后4d黑麥草：授粉后8~10d黃瓜：授粉后7~16d梨：授粉后20d大麥：授粉后10~20d玉米和小麥：授粉后8~12d一些草本植物胚乳培養(yǎng)的適宜取材時(shí)期一般情況下：接近成熟或完全成熟的胚乳callus誘導(dǎo)率很低，甚至無(wú)callus木本植物，如：桑寄生科、檀香科植物，其成熟胚乳和誘導(dǎo)產(chǎn)生callusB、培養(yǎng)基和激素的影響培養(yǎng)基：MS、B5、MT、White、LS等水解酪蛋白、酵母提取物也很必要

激素：要求特殊大麥胚乳只有在添加2，4-D的培養(yǎng)基上才能生長(zhǎng)獼猴桃胚乳培養(yǎng)中，玉米素最好棗的胚乳培養(yǎng)中，激素似乎無(wú)特殊要求C、其他因素的影響蔗糖濃度：3%~5%溫度：25℃pH值：如玉米6.1~7.0；蘋(píng)果6.0~6.2等（三）培養(yǎng)方法：A、取授粉4-8d后的幼果，常規(guī)消毒B、無(wú)菌條件下切開(kāi)果實(shí)，取出種子，分離出胚乳C、接種在培養(yǎng)基上，在25-27℃和黑暗條件或散射光下培養(yǎng)形成愈傷組織D、轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上，待愈傷組織長(zhǎng)出芽后，切下不定芽E、插入生根培養(yǎng)基中，光下培養(yǎng)10-15d，切口處長(zhǎng)出白色的不定根※兩種植物胚乳培養(yǎng)的方法A、枸杞開(kāi)花20d的枸杞胚乳MS+2，4-D0.2mg/L生根MS分化出苗MS+BA0.2mg/L不同倍性的胚乳植株callusB、葡萄取出種子切去合點(diǎn)部分接種White+CM10%+2，4-D2.0+CH500+KT1.0+蔗糖3%~4%瓊脂8%1個(gè)月，胚乳愈傷組織長(zhǎng)大，胚解體未授粉胚珠和子房培養(yǎng)是離體受精的基礎(chǔ)，可誘發(fā)大孢子發(fā)育成單倍體植株，且孤雌產(chǎn)生的單倍體植株獲得率較孤雄生殖高。胚珠培養(yǎng)中，已授粉具有球形胚或更后期的胚珠易培養(yǎng)成種子，且培養(yǎng)基及添加成分相對(duì)要求不高。而受精不久的胚珠則需要成分復(fù)雜的培養(yǎng)基，培養(yǎng)難度大。

五、胚珠和子房培養(yǎng)1、胚珠培養(yǎng)的意義有利于合子和早期原胚的培養(yǎng)胚分化不全的種子的胚培養(yǎng)獲得雜交后代和優(yōu)良品種離體授粉的需要獲得無(wú)病毒苗（一）胚珠培養(yǎng)2、胚珠培養(yǎng)的方法長(zhǎng)度小于3mm的胚珠，難與直接解剖，可先接種于液體培養(yǎng)基中，根據(jù)培養(yǎng)情況采取相應(yīng)培養(yǎng)條件。（二）子房培養(yǎng)1、子房培養(yǎng)的意義

★有效地挽救雜種胚的敗育★單倍體植株的培育★離體授粉的需要★離體條件形成果實(shí)★花被功能研究2、子房培養(yǎng)的方法授粉前或授粉后的子房表面消毒接種培養(yǎng)受精后的子房仍需進(jìn)行表面消毒后再接種。而未受精子房可將花被表面消毒后，在無(wú)菌條件下直接剝?nèi)∽臃拷臃N。子房培養(yǎng)只需較簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基即可形成果實(shí)，并含成熟種子。影響因素1、胚珠（子房）的成活率及育齡離體胚珠（子房）培養(yǎng)的成活率直接影響試管受精的成功率。胚珠（子房）離體成活率的關(guān)鍵是培養(yǎng)基成分的篩選。2、母體組織的影響柱頭可影響某些植物受精，應(yīng)切除柱頭和花柱。而有些植物則需要保留，更有利于離體受精，如煙草。3、花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)離體花粉萌發(fā)率和花