DB32∕T 3762.17-2021 新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范 第17部分：核酸檢測用假病毒陽性質控品

ICS13.100C50DB32江蘇省地方標準DB32/T3762.17—2021新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范第17部分：核酸檢測用假病毒陽性質控品TechnicalspecificationsforSARS-CoV-2detectionPart17:Pseudoviruspositivecontrolmaterialfornucleicaciddetection2021-12-09發(fā)布2022-01-09實施DB32/T3762.17—2021目次前123456789言............................................................................................................................................................II范圍..............................................................................................................................................................1規(guī)范性引用文件..........................................................................................................................................1術語和定義..................................................................................................................................................1縮略語..........................................................................................................................................................2技術要求......................................................................................................................................................2試劑和材料..................................................................................................................................................3儀器和設備..................................................................................................................................................3假病毒原液的技術要求..............................................................................................................................3質控品的制備..............................................................................................................................................510質控品的技術要求......................................................................................................................................5IDB32/T3762.17—2021前言DB32/T3762《新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范》目前分為以下部分：——第1部分：生物樣本采集、運輸和保存；——第2部分：病毒分離與鑒定；——第3部分：核酸熒光PCR檢測程序；——第4部分：重組酶介導等溫擴增程序；——第5部分：血清IgM和IgG抗體酶聯(lián)免疫吸附檢測程序；——第6部分：血清IgM和IgG抗體膠體金免疫層析檢測程序；——第7部分：空氣樣本檢測與評估；——第8部分：物體表面檢測與評估；——第9部分：醫(yī)務人員職業(yè)暴露檢測與評估；——第10部分：微量血清中和試驗；——第11部分：全基因組高通量測序；——第12部分：藥物體外抗病毒效果測定；——第13部分：疊氮溴化丙錠-熒光PCR檢測程序；——第14部分：N亞基因組熒光PCR檢測程序；——第15部分：血清/血漿IgM和IgG抗體磁微粒化學發(fā)光法檢測程序；——第16部分：核酸數(shù)字PCR法；——第17部分：核酸檢測用假病毒陽性質控品；——第18部分：規(guī)?；怂釞z測程序。本文件為DB32/T3762的第17部分。本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。IIDB32/T3762.17—2021新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范第17部分：核酸檢測用假病毒陽性質控品1范圍本文件規(guī)定了新型冠狀病毒核酸檢測用假病毒類弱陽性質控品的術語和定義、縮略語、試劑和材料、儀器和設備、假病毒原液的技術要求、質控品的制備和質控品的技術要求。本文件適用于新型冠狀病毒核酸檢測用假病毒類弱陽性質控品的技術要求以及評價方法。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法JJF1006一級標準物質技術規(guī)范JJF1343標準物質定值的通用原則及統(tǒng)計學原理3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1質控品controlmaterial用于體外診斷的質量控制物質，是一種旨在用于醫(yī)學用途的檢測系統(tǒng)中使用的物質、材料、物品或設備，其目的是評價或驗證測量精密度、測量準確度、由于試劑或分析儀器的變化檢測系統(tǒng)可能產(chǎn)生的分析偏差等性能特征，可用于能力驗證、實驗室內(nèi)質量控制。3.2假病毒pseudovirus一種具有病毒擬似的物理結構和特異性核酸序列的病毒樣粒子，其分析特性與真實病毒相似，但不具備自我復制和感染的能力。3.3假病毒質控品pseudoviruscontrolmaterial由假病毒原料定量分裝后制成，能夠參與到病毒檢測從提取到擴增的全過程；具有生物安全性的同時可作為測量標準，用于病毒核酸定性和定量測量方法的驗證評價以及實驗室的質量控制。3.4計量溯源性metrologicaltraceability1

DB32/T3762.17—2021通過一條具有規(guī)定不確定度的不間斷的比較鏈，使測量結果或測量標準的值能夠與規(guī)定的參考標準（通常是與國家測量標準或國際測量標準）聯(lián)系起來的特性。3.5同源性homology兩個核酸分子的核苷酸序列間的相似程度。本文指假病毒質控品中目的基因序列與相應的真實病毒參考毒株序列的一致性。3.6均勻性uniformity同一批次生產(chǎn)的假病毒質控品，每個最小包裝單元含有等量的目標假病毒的狀態(tài)。通過測量取自不同包裝單元或取自同一包裝單元的、特定量的樣品，定量測量結果落在規(guī)定不確定度范圍內(nèi)，則可認為質控品所含目標假病毒的量是均勻的。3.7穩(wěn)定性stability假病毒質控品在特定的保存條件和保存時間內(nèi)，假病毒的量保持在規(guī)定范圍內(nèi)的能力。4縮略語下列縮略語適用于本文件。DMEM：Dulbecco改良培養(yǎng)基（Dulbecco’smodifiedeagle’smedium）PCR：聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction）qPCR：熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitativepolymerasechainreaction）RT-PCR：逆轉錄聚合酶鏈式反應（reversetranscriptionpolymerasechainreaction）RT-qPCR：逆轉錄熒光定量聚合酶鏈式反應（reversetranscriptionquantitativepolymerasechainreaction）RNase：核糖核酸酶（ribonuclease）5技術要求5.1假病毒質控品的技術要求主要分為兩個方面，包含對假病毒原液的技術要求，如假病毒內(nèi)靶標RNA序列的同源性、假病毒原液的雜質殘留等；還包含對質控品成品的技術要求，如靶標RNA定值、均勻性、穩(wěn)定性等。5.2假病毒質控品必須同時滿足以下8點技術要求，才能作為新型冠狀病毒核酸檢測用的弱陽性質控品：a)用于制備質控品的原料假病毒含有與新冠核酸檢測的靶標RNA序列一致的RNA；用于制備質控品的假病毒原液不含有cDNA雜質；b)c)d)用于制備質控品的假病毒原液無菌；質控品的靶標RNA濃度為試劑盒檢出限的1.5-3倍左右，且定值結果具有計量溯源性；2DB32/T3762.17—2021e)f)質控品同批次均勻性合格；質控品短期、長期及極端環(huán)境下穩(wěn)定性合格；質控品適用于至少8款獲批上市的新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒。g)6試劑和材料6.16.26.36.46.56.6無酶水：GB/T6682中的一級水，應為無RNA酶的水。PCR、RT-PCR、RT-qPCR、數(shù)字PCR相關試劑：商品化試劑。PCR引物、探針：參照權威機構公布的序列或自行設計。RNase：商品化試劑。無RNA酶的各型號槍頭、EP管、PCR管、離心管、試管：商品化耗材。本文件中所有的化學試劑，除特別說明外，全部為分析純級別試劑。7儀器和設備7.17.27.37.47.57.67.77.87.9生物安全柜。普通離心機、冷凍離心機。恒溫水浴鍋。PCR儀。核酸電泳儀。凝膠成像系統(tǒng)。熒光定量PCR儀。數(shù)字PCR系統(tǒng)。各型號移液器。7.10培養(yǎng)箱。8假病毒原液的技術要求8.1靶標RNA序列同源性的檢測8.1.1檢測方法8.1.1.1RT-PCR檢測提取假病毒的RNA作為模板。選用中國疾病預防控制中心或世界衛(wèi)生組織推薦的（見表1）或根據(jù)靶標RNA自行設計的引物進行RT-PCR擴增。設置以水為模板的陰性對照，以含靶標RNA的標準物質為模板的陽性對照。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離、回收反應產(chǎn)物。3

DB32/T3762.17—2021表1中國疾病預防控制中心、世界衛(wèi)生組織推薦的新型冠狀病毒核酸檢測引物和探針序列目標基因引物/探針序列（5’—3’）FRPFRPFRPCCCTGTGGGTTTTACACTTAAORF1abACGATTGTGCATCAGCTGA5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'GGGGAACTTCTCCTGCTAGAATNECAGACATTTTGCTCTCAAGCTG5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTATATTGCAGCAGTACGCACACA5'-FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ-3'8.1.1.2測序及溯源性分析將8.1.1.1的產(chǎn)物測序。測序結果與相應的新型冠狀病毒核酸檢測靶標RNA的參考序列進行比對。8.1.2結果判定在RT-PCR陰性對照和陽性對照都成立的情況下：a)b)若滿足假病毒RNA的RT-PCR產(chǎn)物的電泳結果為陽性且測序結果比對一致，則為合格；若假病毒RNART-PCR產(chǎn)物的電泳結果為陰性，則表明假病毒未包裹病毒RNA，或假病毒核酸提取失敗，應重新制備假病毒或提取核酸。8.2cDNA雜質的檢測8.2.1檢測方法分別以未做核酸提取的假病毒原液和假病毒中提取的RNA為模板，使用推薦的或自行設計的引物和探針或商品化試劑盒進行qPCR擴增。設置以水為模板的陰性對照，以重組質粒為模板的陽性對照。8.2.2結果判定在陰性對照和陽性對照都成立的情況下：a)若未提取的假病毒原液和/或假病毒提取的RNA的qPCR結果為陽性，即出現(xiàn)典型的S型擴增曲線或依據(jù)試劑盒說明書判定，則表明原液中或假病毒內(nèi)含有cDNA雜質，即為不合格，應重新消化去除cDNA雜質。b)若未提取的假病毒原液和假病毒提取的RNA的qPCR結果為陰性，即未起峰或依據(jù)試劑盒說明書判定，說明無cDNA，即為合格。8.39無菌檢測用DMEM培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)假病毒原液24h，溶液澄清，無菌生長，即為合格。質控品的制備4DB32/T3762.17—2021對結果判定為合格的假病毒原液，根據(jù)需要使用適當?shù)娜軇俨《驹线M行稀釋后，分裝至凍存管，直接或凍干后-20℃保存。具體制備過程本文件不作贅述。10質控品的技術要求10.1新型冠狀病毒靶標RNA的定量10.1.1基本要求采用核酸提取方法提取假病毒質控品的RNA，采用RT-qPCR法或數(shù)字PCR法對靶標RNA的濃度進行定值。使用推薦的或自行設計的引物和探針或商品化試劑盒進行定值。核酸提取方法和靶標RNA濃度的定值方法均應通過適宜的國家有證標準物質的驗證方可采用。10.1.2RT-qPCR定量法10.1.2.1使用RT-qPCR法進行定量時，所使用的具體方法應為針對新型冠狀病毒靶標RNA片段設計建立的方法。10.1.2.2重組質粒。10.1.2.3標準品可以為拷貝數(shù)已知的新型冠狀病毒RNA或cDNA，或含有相關目的DNA片段的將標準品以10倍進行梯度稀釋至少5個梯度，分別以每個梯度的標準品溶液作為模板，進行RT-qPCR反應，根據(jù)各梯度標準品的Ct值和濃度制定標準曲線和公式。10.1.2.4根據(jù)質控品RNA的Ct值，利用標準曲線和公式計算出質控品中新型冠狀病毒靶標RNA的濃度。10.1.3數(shù)字PCR定量法10.1.3.1使用數(shù)字PCR法進行定量時，所使用的具體方法應為針對新型冠狀病毒靶標RNA片段設計建立的方法。10.1.3.2提取假病毒RNA，上樣至數(shù)字PCR反應體系，進行數(shù)字PCR反應。按照式（1）計算質控品RNA的濃度。CC1A（1）BC—質控品中靶標RNA的原始濃度，單位為拷貝每微升；C1—數(shù)字PCR檢測結果所示的靶標RNA的濃度，單位為拷貝每微升；A—數(shù)字PCR反應體系中靶標RNA的稀釋倍數(shù)；B—核酸提取時靶標RNA的濃縮倍數(shù)。10.1.4靶標RNA濃度的計算定值結果采取10.1.2或10.1.3所述的方法進行靶標RNA的濃度計算，質控品濃度為新冠核酸檢測試劑盒檢出限的1.5-3倍左右即為合格。10.2均勻性檢測10.2.1檢測方法5DB32/T3762.17—2021按照JJF1006和JJF1343的要求，依據(jù)每一批次質控品的制備數(shù)量，隨機抽樣選擇不同數(shù)量的包裝單元進行均勻性檢測。對質控品進行核酸提取后，按10.1.2或10.1.3的方法進行靶標RNA濃度測定，計算每一個包裝單元靶標RNA的濃度。10.2.2均勻性判定對所得數(shù)據(jù)按照JJF1006和JJF1343的統(tǒng)計學要求進行檢驗，若結果無顯著性差異，則