酸性磷酸酶的檢測試驗報告

酸性磷酸酶的檢測實驗報告一.實驗?zāi)康?以Gomori鉛法為例學(xué)習(xí)細(xì)胞化學(xué)方法檢測水解酶的原理和方法。.掌握小鼠等實驗動物腹腔巨噬細(xì)胞采集和制片的方法。.觀察巨噬細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶的分布進(jìn)一步了解溶酶體的結(jié)構(gòu)和功能。二.實驗原理.向小鼠腹腔內(nèi)注射無菌淀粉肉湯，排異反應(yīng)使小鼠產(chǎn)生大量巨噬細(xì)胞，且巨噬細(xì)胞吞噬淀粉肉湯后不會對細(xì)胞造成傷害，反而被“喂養(yǎng)”。連續(xù)多天注射使小鼠腹腔內(nèi)聚集大量巨噬細(xì)胞。.由于無法直接觀察酸性磷酸酶的分布，可以通過檢測酸性磷酸酶代謝產(chǎn)物的方法間接觀察。酸性磷酸酶催化反應(yīng)。再通過福爾馬林-鈣固定，再通過顯色與染色過程。在光鏡油鏡下可觀察到黑色顆粒，也就是硫化鉛沉淀，從而觀測酸性磷酸酶在巨噬細(xì)胞中的分布。三.實驗材料及設(shè)備1.實驗材料：1/9a）連續(xù)三天向腹腔中注射1mL6%淀粉肉湯的小鼠一只b）酸性磷酸酶工作液，c）福爾馬林-鈣固定液2%硫化銨溶液0.1%沙黃染液2. 實驗設(shè)備：a）普通光學(xué)顯微鏡b）載玻片若干c）4攝氏度冷藏柜d）染色皿若干、吸水紙、滴管、剪刀、白瓷板等實驗方法及步驟（一）實驗組：.巨噬細(xì)胞采集與附著a）配置6%淀粉肉湯，連續(xù)三天向小鼠腹腔內(nèi)注射，注意不要傷害小鼠器官。b）用脊髓脫臼法快速處死小鼠。在白瓷板上用剪刀打開小鼠腹腔，用適量生理鹽水沖洗小鼠內(nèi)臟。c）用膠頭滴管吸取生理鹽水沖洗液，滴于潔凈的載玻片上，注意不要涂抹，每個載玻片各滴兩滴，注意做好編號與正反標(biāo)記。d）將載玻片置于有U形玻璃支架的大型培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿在4攝氏度的冷藏柜中放置30min。用吸水紙吸去多余生理鹽水，注意不要讓細(xì)胞完全干燥。.酶的反應(yīng)將玻片置于37攝氏度的酸性磷酸酶工作液中，溫浴30min。生理鹽水小心沖洗，吸去多余水分。3.細(xì)胞的固定3.細(xì)胞的固定將玻片置于福爾馬林-鈣固定液的染缸中，固定5min。蒸餾水沖洗，吸去多余水分。4.顯色a）2%硫化銨溶液中處理3?5min，取出載玻片，用蒸餾水漂洗。b）普通光鏡下初步觀察，在視野中嘗試找出黑色顆粒聚集的5.區(qū)域。5.區(qū)域。染色0.1%沙黃染液染色1?3min，蒸餾水漂洗后晾干。6.觀察6.觀察置于油鏡下觀察，尋找有細(xì)小黑色顆粒的巨噬細(xì)胞，并觀察記錄。（二）對照組:對照一：在放入工作液前先用50攝氏度?80攝氏度的生理鹽水處理30min,使酶失去活性。其余步驟與實驗組相同。對照二：工作液中不添加B-甘油磷酸鈉，用蒸餾水代替。其余步驟與實驗組相同。五.實驗結(jié)果.實驗組a）染色前

染色前在光鏡下初步觀察，可見細(xì)胞呈點(diǎn)狀分布在載玻片上，細(xì)胞呈灰色，依稀可以看見巨噬細(xì)胞被細(xì)胞核擠成一圈的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的輪廓，細(xì)胞中間更透明。由于未使用油鏡且未染色，不規(guī)則的細(xì)胞形狀與色彩給尋找溶酶體帶來了巨大的難度。故染色后進(jìn)行正式觀察。b）染色后5/9

經(jīng)過沙黃染色后的巨噬細(xì)胞呈暗紅色，細(xì)胞內(nèi)染色不均勻白色呈星狀分布。此時在100X物鏡油鏡下觀察可見大部分細(xì)胞中有細(xì)小棕黑色顆粒，在細(xì)胞中不規(guī)則分布，每個細(xì)胞中數(shù)量差異較大，密度也不同。左下示意圖中可見密度較高，較為顯著，右下分布則較為稀疏，顏色也較淺。關(guān)于棕黑色顆粒大小、分布、數(shù)量差異的具體探討見第六節(jié)討論一。.對照組：對照組一對照組二

對照組一對照組二在對照組一中，由于使用80攝氏度的生理鹽水處理，在此溫度下，大量細(xì)胞被破壞脫落，殘余細(xì)胞較少，且疑似細(xì)胞內(nèi)容物被破壞，染色很淺，依稀可見淡紅色細(xì)胞輪廓。未見棕黑色細(xì)小顆粒。在對照二中，工作液未添加B-甘油磷酸鈉，用蒸餾水代替，酸性磷酸酶無反應(yīng)底物，故后續(xù)反應(yīng)也無法進(jìn)行。染色情況與實驗組基本相同，但是未見細(xì)小棕黑色顆粒。六.實驗討論1.實驗結(jié)論：運(yùn)用代謝產(chǎn)物間接觀察的方法，根據(jù)實驗組觀測結(jié)果，巨噬細(xì)胞的酸性磷酸酶集中分布于細(xì)胞質(zhì)的一些細(xì)小顆粒中，查詢資料推測為溶酶體；故巨噬細(xì)胞中的酸性磷酸酶集中分布于溶酶體中。根據(jù)對照實驗可知，有活性的酸性溶菌酶和反應(yīng)底物是該觀測方法的必須因素，該觀察酸性磷酸酶的方法科學(xué)有效。詢資料推測為溶酶體；故巨噬細(xì)胞中的酸性磷酸酶集中分布于溶酶體中。根據(jù)對照實驗可知，有活性的酸性溶菌酶和反應(yīng)底物是該觀測方法的必須因素，該觀察酸性磷酸酶的方法科學(xué)有效。2.討論一：為什么在巨噬細(xì)胞中，棕黑色細(xì)小顆粒的分布和數(shù)量有很大差異?a）巨噬細(xì)胞成熟程度不同，所含溶酶體的數(shù)量也不同。b）巨噬細(xì)胞中有初級溶酶體和次級溶酶體。初級溶酶體是剛從高爾基體分離出，只含有溶酶體酶的細(xì)胞小泡。較小，光鏡下呈更為細(xì)小的棕黑色顆粒次級溶酶體是同時含有消化中的細(xì)胞底物和溶酶體酶的消化泡，體積較大。在光鏡下呈較大的棕黑色顆粒。c）注射進(jìn)入腹腔中的淀粉肉湯分布不均勻，處于外源性異物更多的區(qū)域的巨噬細(xì)胞會產(chǎn)生更多的溶酶體。部分細(xì)胞可能已經(jīng)消化了大部分胞吞的外源性異物，溶酶體數(shù)量與體積均較小。.討論二：如果標(biāo)本液在工作液中孵育時間過久，可能會出現(xiàn)什么現(xiàn)象？酸性磷酸酶將會持續(xù)催化反應(yīng)進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物大量堆積，甚至導(dǎo)致溶酶體破裂，反應(yīng)產(chǎn)物彌漫。這些產(chǎn)物在經(jīng)過后續(xù)步驟后都會在光鏡下呈棕黑色沉淀，脫離酸性磷酸酶原來位置而不規(guī)則分布。所以可能會導(dǎo)致“視野中隨機(jī)大量分布棕黑色物資”從而干擾了“觀察酸性磷酸酶在細(xì)胞中的分布”這一目的。.討論三：實驗結(jié)果中觀測到的棕黑色物質(zhì)，就是酸性磷酸酶嗎？不是，棕黑色物質(zhì)是硫化鉛沉淀。是磷酸代謝酶在工作液中的代謝產(chǎn)物經(jīng)過一系列的后續(xù)顯色過程產(chǎn)生的棕黑色沉淀。我們通過觀察這一物質(zhì)的分布，從而推斷出酸性磷酸酶在細(xì)胞中的分布情況。七.參考文獻(xiàn)[1]李素文.《細(xì)胞生物學(xué)實驗指導(dǎo)》[M].高等教育出版社，2015(3):46-48.[2]翟中和，王喜忠，丁明孝等.《細(xì)胞生物學(xué)》[M].高