非洲爪蟾課件

ModelOrganismDEVELOPMENTALBIOLOGYOfXenopusLaevisLecturesbytheFirstGroupOutline1、非洲爪蟾簡介；2、重要的模式生物;3、胚胎發(fā)育-重點(diǎn)講原腸胚；4、ExperimentalMethods；5、標(biāo)志性研究-重點(diǎn)戈登核移植；6、標(biāo)志性研究；7、提問環(huán)節(jié)非洲爪蟾學(xué)名：Xenopuslaevis屬名：Xenopus門：脊索動(dòng)物門(PhylumChordata）亞門：脊椎動(dòng)物亞門(Vertebrata)

綱：兩棲綱（Amphibia）

目：無尾目(Salientia)

科：負(fù)子蟾科(Pipidae)

重要的模式生物

優(yōu)點(diǎn)：取卵方便：通過注射激素，可以隨時(shí)誘導(dǎo)非洲爪蟾排卵，不受季節(jié)限制，更可通過人工授精獲得受精卵；非洲爪蟾卵子和胚胎個(gè)體較大，直徑可達(dá)1.4毫米，很方便進(jìn)行實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)研究，如顯微注射、胚胎切割和移植等；早期胚胎發(fā)育很快，在24℃下2天左右就可以孵化成可以自由游動(dòng)的幼蟲，便于進(jìn)行研究；非洲爪蟾較為活潑，易于飼養(yǎng)。重要的模式生物嚴(yán)重缺陷：

?非洲爪蟾生命周期過長，從受精發(fā)育至成熟具生殖能力的成蛙需時(shí)一年；

?非洲爪蟾是異源四倍體生物，多數(shù)基因都存在4個(gè)拷貝，很難進(jìn)行遺傳突變試驗(yàn)。胚胎發(fā)育CleavageBlastulaGastrulationNeurulationTailbudstagePrelarvalshape

原腸胚

非洲爪蟾預(yù)定內(nèi)胚層細(xì)胞內(nèi)陷，形成狹縫狀胚孔內(nèi)陷引發(fā)原腸形成。原腸作用的下一個(gè)時(shí)期包括邊緣區(qū)細(xì)胞的內(nèi)卷以及動(dòng)物半球細(xì)胞的外包和向胚孔處集中.隨著瓶狀細(xì)胞進(jìn)入胚胎內(nèi)部，背唇被后來內(nèi)卷進(jìn)入胚胎發(fā)育為頭部中胚層前體的細(xì)胞代替。隨著新細(xì)胞進(jìn)入胚胎內(nèi)部，囊胚腔被擠壓到與背唇相對的一側(cè)。最終，卵黃栓也被包入內(nèi)部。Experimentalmethods?ForbiologicalactivitymeasurementthematerialtobeinjectedwillusuallybeamRNAmadeinvitro.?TheRNAsynthesisisperformedusingplasmidscarryingpromotersforRNApolymerasesofbacteriophagesuchasSp6,T3,orT7,andapoly(A)additionsitetoensureinvivoadditionofpoly(A)tostabilizethemessage.ExperimentalmethodsUntilsuchtimeasaglucocorticoid,ususallydexamethasone,isadded.Asalipid-solublesubstance,dexamethasonecanpenetrateintotheembryoandwillbindtothereceptor,liberatingitfromthehsp90,andallowingittomovetothenucleuswherethetranscriptionfactorpartofthemoleculecanexertitsbiologicalactivity.Experimentalmethods?InXenopus，itisnotpracticaltostudytheeffectsofmutatinggenestoinactivity,butforinhibitionexperimentstherearethreestandardprotocolswhichareveryeffective.?Themostcommonlyusedistheinjectionofantisensemorpholinooligosintofertilizedeggs.Experimentalmethods?Ifitisdesiredtoinhibitamaternallyactinggene,thenantisensedeoxy-oligonucleotidesarealsoeffective.?ItisoftenveryimportanttobeabletodepletetheoocyteofaspecificmRNAsinceitisduringthesestagesthatvariousmaternalcomponentsarelaiddownthatareessentialtolater,zygotic,development.

?Theantisenseoligoisinjectedintotheoocyteand,likethemorpholinos,hybridizestothetargetmessages.ButinthiscasetheresultingRNA–DNAhybridisatargetforthenucleaseRNAseHwhichdestroysthemessage.ExperimentalmethodsInordertoestablishlaterdevelopmentaleffectsoftheseexperimentsitisthennecessarytomakethetreatedoocytesintoembryos.Progesterone→coloringthemwithavitaldye→reimplanting→embryoExperimentalmethods?Thethirdprotocolinvolvesthedesignofdominantnegativeversionsofgeneproductswhichcanspecificallyinhibitthenormalproteinonoverexpression.?InXenopus,particularlyextensiveusehasbeenmadeofdomainsversionsoftranscriptionfactors.?Theeffectordomainofthefactorisreplacedbyastrongactivator(e.g.VP16)orastrongrepressor(e.g.engrailedrepressor).Experimentalmethods?Iftheeffectof,say,theVP16fusionissimilartothenormalfactorthisshowsthatthenormalfactormustbeanactivator.?IftheEnRversiongivesanormalphenotypethenthetranscriptionfactorislikelytobearepressor.標(biāo)志性研究?直到20世紀(jì)90年代，人們以非洲爪蟾為模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，找到了組織者中真正的作用分子：BMP信號(hào)抑制因子和Wnt信號(hào)抑制因子?

1962年，英國牛津大學(xué)的生物學(xué)家戈登利用非洲爪蟾進(jìn)行了一系列的核移植試驗(yàn)，以研究不同發(fā)育時(shí)期胚胎細(xì)胞核的發(fā)育能力。此實(shí)驗(yàn)證明了細(xì)胞核的全能性，完成了世界上最早的克隆動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)，也開創(chuàng)了動(dòng)物克隆的時(shí)代。標(biāo)志性研究戈登先用紫外線照射爪蟾卵細(xì)胞，破壞其細(xì)胞核，然后取爪蟾蝌蚪的腸上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞等的細(xì)胞核，植入上述處理過的卵細(xì)胞內(nèi)，其中一少部分卵會(huì)開始分裂并可發(fā)育至一定時(shí)期。利用蝌蚪小腸上皮細(xì)胞作為核供體，通過連續(xù)核移植的辦法，戈登成功獲得了少量蝌蚪，其中有幾只成功發(fā)育成為成體爪蟾完成了世界上最早的克隆動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)。這一結(jié)果轟動(dòng)了科學(xué)界，充分證明了細(xì)胞核的全能性，也開創(chuàng)了動(dòng)物克隆的時(shí)代。有關(guān)研究2010年非洲爪蟾IL-6基因的克隆及生物信息學(xué)分析；2011年非洲爪蟾在生殖內(nèi)分泌干擾作用、甲狀腺干擾作用和胚胎發(fā)育毒性三方面的應(yīng)用及其近年來的研究進(jìn)展；2011年目的克隆非洲爪蟾β突觸核蛋白基因(xenopus-β-synuclein,xSYNB)并研究其亞細(xì)胞定位；2011非洲爪蟾BAFF及其信號(hào)通路相關(guān)基因的比較生