蘇景寬：國家基金申請技巧講座課件

基金申請技巧講座

第四軍醫(yī)大學(xué)科研部

蘇景寬

基金申請技巧講座

第四軍醫(yī)大學(xué)科研部

蘇景寬

1第一部分

如何撰寫申請書

第一部分

如何撰寫申請書

2一、摘要（限400字）

包括：研究方法、內(nèi)容、目標(biāo)、科學(xué)意義。

如：采用……方法，進行……研究，闡明……機制或揭示……規(guī)律，為……奠定基礎(chǔ)／提供……思路。作用：畫龍點睛效果：引發(fā)評議專家的興趣，使其產(chǎn)生探個究竟的好奇心——“他到底是怎么做的？”一、摘要（限400字）

包括：研究方法、內(nèi)容、目標(biāo)、科學(xué)3

采用改良的消減雜交技術(shù)建立老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞差異表達基因文庫并制備基因芯片，利用此芯片篩選出白內(nèi)障相關(guān)基因。通過基因轉(zhuǎn)染在體和培養(yǎng)的晶狀體上皮細胞，觀察細胞的形態(tài)、增殖和凋亡、骨架蛋白及晶狀體蛋白的變化，研究基因的功能。從晶狀體上皮細胞的角度闡明老年性白內(nèi)障發(fā)生的分子生物學(xué)機制，為防治白內(nèi)障提供新思路和理論依據(jù)。采用改良的消減雜交技術(shù)建立老年性白內(nèi)障晶狀體4二、立論依據(jù)

對基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合國際科學(xué)發(fā)展趨勢，

論述科學(xué)意義對應(yīng)用基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合學(xué)科前沿，圍繞國民經(jīng)濟和社會發(fā)展中的重要科技問題論述應(yīng)用前景二、立論依據(jù)5

在立論依據(jù)的闡述中，對研究領(lǐng)域、研究方向、

具體科學(xué)問題的理解

研究領(lǐng)域：白內(nèi)障的研究，包括發(fā)病機制、預(yù)防、診斷、

治療措施等研究

研究方向：白內(nèi)障發(fā)病機制的研究，包括環(huán)境因素、致病

靶點、細胞水平、分子水平研究等

科學(xué)問題：白內(nèi)障發(fā)病過程中的相關(guān)基因研究，包括致病

基因篩選、功能研究、調(diào)控機制、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等在立論依據(jù)的闡述中，對研究領(lǐng)域、研究方向、6在研究領(lǐng)域?qū)用鎻难芯糠较蛘归_圍繞某一具體科學(xué)問題（本項目研究目標(biāo)）進行歸納分析提出研究設(shè)想從研究領(lǐng)域切入研究意義國內(nèi)外現(xiàn)狀分析在研究領(lǐng)域?qū)用鎻难芯糠较蛘归_圍繞某一具體科學(xué)問題提出研究從研7

1、項目的研究意義

存在問題：對科學(xué)意義的闡述不足或夸大

撰寫方法：

從領(lǐng)域入手，提出主要問題，引出熱點研究方向。圍繞熱點研究方向進行簡要分析，找出目前尚未解決的具體科學(xué)問題，以此為切入點提出假設(shè)，闡述如果解決了該問題（研究目標(biāo)），對該領(lǐng)域甚至相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)貢獻（理論意義或應(yīng)用前景）。

1、項目的研究意義8

老年性白內(nèi)障是與年齡相關(guān)的疾病，隨著年齡的增加，其發(fā)病比率也不斷升高。特別是人類趨向老齡化，白內(nèi)障的患病人數(shù)還將持續(xù)增加。目前，它已是人類第一位的致盲疾病。迄今為止,治療白內(nèi)障唯一有效的方法是通過手術(shù)摘除混濁的晶狀體并植入人工晶狀體。雖然手術(shù)后患者可以恢復(fù)良好的視力，但是不可避免的術(shù)后并發(fā)癥以及手術(shù)設(shè)備、材料耗資巨大，治療白內(nèi)障所花費的資金已成為世界各國包括富裕的發(fā)達國家嚴(yán)重的醫(yī)療負擔(dān)。最近的調(diào)查表明，如果把老年性白內(nèi)障的發(fā)病時間延緩10年，白內(nèi)障手術(shù)的數(shù)量就會減少45%[1]。所以，一些學(xué)者認(rèn)為通過預(yù)防白內(nèi)障發(fā)生或延緩其發(fā)展的途徑征服白內(nèi)障已成為一項全球性的社會和社會經(jīng)濟問題[2]。老年性白內(nèi)障是與年齡相關(guān)的疾病，隨著年齡的9

但是目前我們對老年性白內(nèi)障發(fā)病機理的認(rèn)識還不十分清楚。多年以來許多學(xué)者的研究結(jié)果證實晶狀體上皮細胞在老年性白內(nèi)障發(fā)生中起重要的作用，但對其中進一步的基因調(diào)控知之甚少。如果從參與老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞變化的相關(guān)基因入手，研究基因的生物學(xué)功能，有可能抓住引起白內(nèi)障發(fā)生、發(fā)展的主要環(huán)節(jié)。據(jù)此，本研究擬利用改良的消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)準(zhǔn)確、全面、快速的特點，以晶狀體上皮細胞為研究對象，一次性篩選出老年性白內(nèi)障全部有差異表達的基因，從中再篩選出與白內(nèi)障相關(guān)基因，并著重對其功能進行研究，從基因水平闡明白內(nèi)障的發(fā)病機制，為防治白內(nèi)障提供新思路和理論依據(jù)。但是目前我們對老年性白內(nèi)障發(fā)病機理的認(rèn)識還10

2、國內(nèi)外現(xiàn)狀分析（與綜述的區(qū)別）

存在問題：A、低水平重復(fù)：不了解最新進展，對國內(nèi)外現(xiàn)狀缺乏真正了解，提出的問題別人已解決。B、文獻復(fù)習(xí)不全：檢索文獻方法不當(dāng)、選擇關(guān)鍵詞不妥，甚至人為縮小檢索范圍。C、總結(jié)表達不夠：對國內(nèi)外現(xiàn)狀缺乏歸納分析，只是簡單羅列，缺乏邏輯性和針對性。

D、對方法原理理解不夠：對研究方法不熟悉，簡單移植或夸大其作用，缺乏實際應(yīng)用的可行性。2、國內(nèi)外現(xiàn)狀分析（與綜述的區(qū)別）11

撰寫方法：要緊緊圍繞本次申請項目的主題。A、從領(lǐng)域切入，簡要論述國內(nèi)外研究成果，并引出當(dāng)前的熱點研究方向。B、從研究方向展開，較詳細地分析國內(nèi)外的研究

進展，闡明在該方向上存在的問題。C、圍繞存在的問題，結(jié)合國內(nèi)外以往的研究結(jié)果、

當(dāng)前的現(xiàn)狀及今后的發(fā)展趨勢，詳細論述和分析這些問題產(chǎn)生的原因，提出該方面的空白點、未知數(shù)、以及研究的難點、焦點，從而為自己申請項目確立研究目標(biāo)奠定充分的立論基礎(chǔ)。

12

D、對擬采用的技術(shù)方法進行介紹和分析。

成熟的方法重點介紹可以應(yīng)用于本研究的理論依據(jù)和實驗依據(jù)。

新方法在詳細介紹其原理的基礎(chǔ)上，闡明可以應(yīng)用于本研究的理論依據(jù)和實驗依據(jù)。

需特別注意的問題：必須對所運用的技術(shù)方法的原理、流程尤其是在實際運用中可能出現(xiàn)的問題要十分清楚，絕不能是一種簡單的移植。例如：抗體+功能基團，理論上可以實現(xiàn)融合，但存在“活性、表達載體選擇、純化等問題。E、提出本項目的研究設(shè)想。D、對擬采用的技術(shù)方法進行介紹和分析。13

防治白內(nèi)障必須針對其發(fā)病的主要環(huán)節(jié)。多年以來，國內(nèi)外學(xué)者從不同的角度探討白內(nèi)障的發(fā)生機理。就致病的環(huán)境因素講，氧化因子、紫外線輻射、晶狀體周圍環(huán)境中離子濃度改變及一些生長因子、細胞因子的改變均與老年性白內(nèi)障的發(fā)生有關(guān)。就研究的部位分，晶狀體中皮質(zhì)與核的蛋白質(zhì)改變及晶狀體纖維的改變與白內(nèi)障的形成有關(guān)，而位于晶狀體前囊膜下單層的晶狀體上皮細胞在白內(nèi)障的形成中的變化更引人關(guān)注。

防治白內(nèi)障必須針對其發(fā)病的主要環(huán)節(jié)。多年14

因為晶狀體上皮細胞是晶狀體中唯一有分裂活性、數(shù)量相對穩(wěn)定的細胞，它們分裂、分化出晶狀體纖維細胞、產(chǎn)生晶體蛋白，終生不停息，形成了晶狀體均一、對稱的結(jié)構(gòu)，對維持晶狀體的透明起重要作用。不僅如此，晶狀體上皮細胞還是晶狀體中受外來刺激影響較早的部位，已有研究證實老年性白內(nèi)障的晶狀體上皮細胞還發(fā)生退行性變、細胞膜通透性增加、細胞內(nèi)酶活性改變、細胞數(shù)量減少、凋亡細胞增多等改變，與單純老化的晶狀體之間存在差異[3-5]。因為晶狀體上皮細胞是晶狀體中唯一有分裂活性15

體外實驗也證實多種因素(H2O2、UV-B、晶狀體蛋白的自身抗體)誘發(fā)的白內(nèi)障模型中晶狀體上皮的損傷是晶狀體混濁的主要環(huán)節(jié)[6-8]。因此，從晶狀體上皮細胞的變化入手探討白內(nèi)障的成因，有可能抓住揭示白內(nèi)障發(fā)病機理的主要環(huán)節(jié)。而晶狀體上皮細胞變化的基因調(diào)控機制是問題的關(guān)鍵所在，也是有待我們深入研究的問題。體外實驗也證實多種因素(H2O2、UV-B、晶16

白內(nèi)障的形成與晶狀體的老化密不可分，是晶狀體老化的極端表現(xiàn)。晶狀體的老化是多種因素相互作用的結(jié)果，包括基因的和非基因的隨機變化的不斷積累，也有程序性的、非隨機性的組織特異性多種基因表達的改變。目前，國內(nèi)外對白內(nèi)障相關(guān)基因的研究主要以下三方面：

白內(nèi)障的形成與晶狀體的老化密不可分，是晶17

一是對體外培養(yǎng)的晶狀體白內(nèi)障模型及上皮細胞的研究。UV-B輻射作用誘導(dǎo)的白內(nèi)障中晶狀體上皮細胞是主要的靶細胞，其Na-K-ATP酶的活性增加，蛋白質(zhì)的合成和分泌增加；上皮細胞的凋亡增加，其中有c-fos基因的表達增加；還有組蛋白H4、H3的低表達`和蛋白酶C、β-肌動蛋白、γ-肌動蛋白基因的高表達[9-12]。Carper等[13]利用RT-PCR-DD(reversetranscription-polymerasechainreactiondifferentialdisplay)技術(shù)研究H2O2誘導(dǎo)的晶體上皮細胞的基因差異性表達結(jié)果顯示NADH脫氫酶4亞基、細胞色素b、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶基因表達減少以及細胞因子的核蛋白、替代拼接因子2（alternativesplicingfactor）、β-三羥基異丁酰輔酶A水解酶基因表達的增加。一是對體外培養(yǎng)的晶狀體白內(nèi)障模型及上皮18

二是利用轉(zhuǎn)基因動物的研究。波形纖維蛋白基因（vimentin）、雜交的Ⅲ型中間纖維蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出白內(nèi)障，而且有隨小鼠年齡增加白內(nèi)障加重的趨勢。晶狀體改變的共同特點是晶狀體纖維細胞分化受抑制[14,15]。Gong等[16]報告晶狀體的細胞膜蛋白連接蛋白α3（α3Connexin）基因敲除小鼠（knockoutmouse）在晶狀體形成的早期及纖維細胞分化早期不受影響，其后出現(xiàn)與晶狀體蛋白溶解有關(guān)的核性白內(nèi)障。雖然體外實驗和白內(nèi)障轉(zhuǎn)基因小鼠都提示我們一些基因的變化與白內(nèi)障有關(guān)，但是，這些變化的基因是否與老年性白內(nèi)障形成有關(guān)，目前尚缺乏進一步的報告。

二是利用轉(zhuǎn)基因動物的研究。波形纖維蛋白基19

三是對人老年性白內(nèi)障晶體上皮的研究。Lee[17]利用RT-PCR技術(shù)研究顯示前極性白內(nèi)障與核性白內(nèi)障上皮細胞中纖維連接蛋白、I型膠原纖維、α-平滑肌蛋白、TGF-β1、TGF-β2、TGF-βⅡ型受體、結(jié)締組織生長因子的基因表達有差異。Kantorow等[18]利用RT-PCR-DD研究老年性白內(nèi)障與正常晶狀體上皮的基因差異性表達的初步結(jié)果是老年性白內(nèi)障有三個高表達基因和12個低表達的基因。但就DD-PCR技術(shù)來講，在實驗中難以解決假陰性、假陽性以及克隆全長cDNA的問題。

三是對人老年性白內(nèi)障晶體上皮的研究。Le20

上述三方面的研究均取得了不同程度的研究結(jié)果，但由于當(dāng)時技術(shù)條件的限制都未能全面闡明與白內(nèi)障相關(guān)的基因及其功能。尋找白內(nèi)障時晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞間差異表達的基因有可能揭示白內(nèi)障的發(fā)病機理。上述三方面的研究均取得了不同程度的研究結(jié)果，21

尋找差異表達基因的經(jīng)典方法是消減雜交技術(shù)（subtractivehybridization,SH），它是……，但是實驗操作復(fù)雜。

經(jīng)過改進后的抑制性消減雜交（suppressionsubtractivehybridization,SSH是Diatchenko等1996年建立的方法）……簡化了實驗操作，但仍然問題很多。我校生化教研室建立了改良消減雜交技術(shù)[19，20]，其特點是：簡便易行，能夠獲得目的細胞特異表達的全長基因，對低豐度基因也能有效分離。

尋找差異表達基因的經(jīng)典方法是消減雜交技術(shù)（22

該方法的建立者已利用這一技術(shù)從脂多糖刺激前后的人牙髓細胞的差異表達的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達的基因，其中5個為新基因。同理，利用此方法也能快速、有效地獲得白內(nèi)障晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞間差異表達的基因，并克隆到全長cDNA，為進一步的結(jié)構(gòu)和功能研究打下基礎(chǔ)。該方法的建立者已利用這一技術(shù)從脂多糖刺激前后的23基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)，使檢測差異表達基因和未知DNA分子變得更快捷、準(zhǔn)確、高效?；蛐酒窃?996年被提出并開始研制的，該技術(shù)是將成千上萬的DNA探針集中到1厘米見方的基片上，利用堿基互補原理，DNA探針中的已知堿基序列與被測定的未知DNA分子雜交后由標(biāo)記分子標(biāo)記雜交體，經(jīng)自動閱讀設(shè)備分析雜交結(jié)果，從而對檢測基因進行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析，確定未知DNA分子。基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)，使檢測差異表達基因和未知DN24

由于目前尚沒有針對白內(nèi)障研究的現(xiàn)成基因芯片，根據(jù)本研究的需要，我們將篩選到的差異表達的所有基因建立cDNA文庫，再利用基因芯片技術(shù)制備成基因芯片，以此檢測多個樣本中白內(nèi)障晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞間差異表達的基因，從中進一步篩選出白內(nèi)障特異的基因，它們中可能有已知基因，也可能有未知基因。通過以上兩種技術(shù)的有機結(jié)合，我們能更快捷、有效、準(zhǔn)確地得到白內(nèi)障相關(guān)基因。由于目前尚沒有針對白內(nèi)障研究的現(xiàn)成基因芯片25

綜上所述，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為研究白內(nèi)障發(fā)生過程中的功能基因及特異調(diào)控基因提供了有利武器。本項目從晶狀體上皮細胞入手，利用改良的消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)系統(tǒng)研究與白內(nèi)障相關(guān)的基因，并采用對體外培養(yǎng)細胞和在體晶狀體上皮細胞的基因轉(zhuǎn)染，探討它們在晶狀體上皮細胞變化和白內(nèi)障形成中的作用，可望闡明白內(nèi)障晶狀體上皮細胞變化的分子生物學(xué)機制，為防治白內(nèi)障提供新的思路和理論依據(jù)。綜上所述，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為研究白內(nèi)障263、參考文獻

A、文獻類別要全：以英文文獻為主，同時也要引用

中文文獻---國內(nèi)同行中知名專家的文獻。

B、引文信息要全：文章題目、作者姓名、具體出處

（包括期刊名、年份、卷期、頁碼等）。

C、文獻年代要新：主要是近五年的文獻，最好能有

07年的最新文獻。

3、參考文獻

A、文獻類別要全：以英文文獻為27三、研究方案

1、研究目標(biāo)

撰寫要求：有限目標(biāo)，與研究內(nèi)容相呼應(yīng)

如：明確……關(guān)系，揭示……規(guī)律，闡明……原理（機制），建立……方法等舉例：篩選出與老年性白內(nèi)障相關(guān)的基因，明確部分基因在白內(nèi)障形成中的作用，從晶狀體上皮變化的角度闡明白內(nèi)障的發(fā)生機理，為防治白內(nèi)障提供線索。三、研究方案1、研究目標(biāo)如：明確……關(guān)系28

2、研究內(nèi)容：

存在問題：內(nèi)容過多，一個研究周期難以完成內(nèi)容分散，不能集中闡明研究目標(biāo)撰寫要求：內(nèi)容要適當(dāng)—確保研究周期內(nèi)完成為目標(biāo)服務(wù)—與目標(biāo)相輔相成要重點闡述—注意與技術(shù)路線區(qū)別

2、研究內(nèi)容：29舉例：

（1）篩選白內(nèi)障相關(guān)基因：采用改良的消減雜交技術(shù)，獲得人老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞和正常晶狀體上皮細胞差異表達的基因片段，建立cDNA文庫。制備差異表達基因的基因芯片，利用基因芯片技術(shù)從多個標(biāo)本的老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞中篩選出白內(nèi)障相關(guān)基因。舉例：30

（2）研究白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)：……

（3）研究白內(nèi)障相關(guān)基因在晶狀體上皮細胞變化中的作用：……觀察指標(biāo)如下：

①存活細胞數(shù)；②光鏡、透射電鏡下細胞形態(tài)的變化；③細胞凋亡檢測：用原位末端標(biāo)記和連接酶介導(dǎo)PCR方法，從形態(tài)和DNA水平分析細胞凋亡；④細胞增殖的檢測：……；⑤細胞骨架蛋白的檢測：……；⑥晶狀體蛋白的檢測：（2）研究白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)：……31

3、擬解決的關(guān)鍵問題：

存在問題：抓不住關(guān)鍵問題或抓得不準(zhǔn)。什么是關(guān)鍵問題？

--研究過程中對達預(yù)期目標(biāo)有重要影響的某些研究內(nèi)容或因素。--為達預(yù)期目標(biāo)所必須掌握的關(guān)鍵技術(shù)或研究手段。撰寫要求：找出關(guān)鍵問題，提出解決辦法。3、擬解決的關(guān)鍵問題：32舉例：

（1）建立差異表達的cDNA文庫：建立差異cDNA文庫是篩選老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的前提。為使差異cDNA文庫具有代表性，我們采取以下解決方案：①選擇各種類型老年性白內(nèi)障晶狀體的前囊膜、取足夠大量的標(biāo)本（擬取50例標(biāo)本）作為建庫的mRNA的來源。②利用改良的消減雜交技術(shù)可快速、有效地獲得差異表達的完整cDNA片段。此技術(shù)是本課題組成員主要的研究成果，在應(yīng)用此項技術(shù)中已積累了較豐富的實驗經(jīng)驗。舉例：33（2）制備基因芯片：制備用于本研究的芯片是篩選老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。制備基因芯片的關(guān)鍵是在1平方厘米的基片上放上成百上千的不同基因探針而不使它們發(fā)生任何混淆。在制作基因芯片時做到：①嚴(yán)格按操作程序進行；②在標(biāo)本的處理及RNA提取時避免污染，否則即會造成嚴(yán)重的損失。只要嚴(yán)格按操作程序進行操作就可以避免發(fā)生差錯。

（2）制備基因芯片：34（3）在體基因轉(zhuǎn)染：在體基因轉(zhuǎn)染是進行白內(nèi)障相關(guān)基因功能研究的關(guān)鍵。在體的晶狀體上皮細胞大部分處在靜息狀態(tài)，只有位于赤道前區(qū)的少量細胞具有分裂活性，而且晶狀體表面有一層膠原性質(zhì)的囊膜包裹。在體晶狀體的基因轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵是如何使大量分裂后細胞轉(zhuǎn)染，如何使病毒穿過晶狀體的囊膜，針對以上問題我們擬采取下列方法解決：①選用反轉(zhuǎn)錄病毒的慢病毒載體（lentiviralvector），它克服了一般反轉(zhuǎn)錄病毒只能轉(zhuǎn)染有分裂能力細胞的局限性，對分裂后細胞也能有效的轉(zhuǎn)染。這對在體晶狀體的基因轉(zhuǎn)染有很大的優(yōu)越性。②采用直徑1-2μm玻璃微管在顯微鏡下將病毒載體注入晶狀體的前囊膜下，既不破壞晶狀體的完整性，又可使病毒接觸到囊膜下的上皮細胞。（3）在體基因轉(zhuǎn)染：35

4、研究方法

存在問題：過于簡單：在方案中只有方法名稱而無具體步驟。過于繁雜：大量羅列一些常規(guī)的實驗方法。撰寫要求：以研究項目的需求為前提，盡量采用最適合的方法和手段，并將其操作步驟和關(guān)鍵環(huán)節(jié)體現(xiàn)在技術(shù)路線當(dāng)中。4、研究方法36

5、技術(shù)路線

存在問題：不清楚，不詳細，不可行。

撰寫要求：清晰、詳細、注意邏輯性。

撰寫方法：—以時間順序為主線設(shè)計技術(shù)路線—以研究內(nèi)容為主線設(shè)計技術(shù)路線—分大小標(biāo)題，突出邏輯關(guān)系。—詳細地寫清楚每個具體步驟。5、技術(shù)路線37

（1）人晶狀體上皮細胞的獲得：老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞取自白內(nèi)障患者手術(shù)中取出的前囊膜（晶狀體上皮細胞緊貼于前囊膜），直徑約5mm。正常晶狀體上皮細胞取自角膜移植供體眼的晶狀體，在顯微鏡下撕下前囊膜，直徑約8mm。按文獻提供的方法去除晶狀體纖維細胞，仔細清洗以去除血細胞污染。

（2）建立差異cDNA文庫：從50例白內(nèi)障手術(shù)患者的前囊膜上取下的晶狀體上皮細胞作為實驗組，從25例正常晶狀體前囊膜上取下的晶狀體上皮細胞作為對照組，利用改良的消減雜交技術(shù)[19，20]，獲得差異表達的cDNA，并建立文庫。主要的實驗流程如下：（1）人晶狀體上皮細胞的獲得：老年性白內(nèi)障晶38

正常晶狀體上皮細胞白內(nèi)障晶狀體上皮細胞

PromegaPolyATtract?System1000

mRNA分離 mRNA分離

oligo-dT18反轉(zhuǎn)錄ntechCap-finder方法反轉(zhuǎn)錄 cDNA

Biotin-21-dUTPpending-cDNA隨機引物PCR雜交

SephacrylS-400柱正常晶狀體上皮細胞白內(nèi)障晶狀體上皮39

除鹽及小片段

鏈親和素-生物素磁性分離

除去雜交體及過量正常晶狀體上皮細胞cDNA“長距離”PCR

目的cDNA的特異擴增

克隆、鑒定、轉(zhuǎn)化建立差異基因文庫

40（3）制備基因芯片篩選白內(nèi)障相關(guān)基因：

①基因芯片的制備：………②白內(nèi)障相關(guān)基因的篩選：……（4）白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)分析：①序列測定：......②序列的計算機分析：......③獲得全長基因：......（5）基因轉(zhuǎn)染：

①培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞的轉(zhuǎn)染：……②在體晶狀體的轉(zhuǎn)染：……（3）制備基因芯片篩選白內(nèi)障相關(guān)基因：41

6、可行性分析

對實驗方案設(shè)計的分析理論分析研究手段方法分析預(yù)實驗結(jié)果分析對相關(guān)條件的分析所用特殊實驗材料（試劑）的分析對所具備的實驗條件進行分析對項目組成員搭配及其運用技術(shù)方法的能力分析6、可行性分析42(1)關(guān)于建立差異cDNA文庫：老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞是處在不同狀態(tài)下的細胞，細胞基因表達的改變是細胞蛋白功能等改變的基礎(chǔ)。尋找這些有差異的基因是探索細胞功能、狀態(tài)變化原因的突破口。利用的消減雜交技術(shù)是篩選差異表達基因的有效方法。改良的消減雜交技術(shù)是我們研究組成員建立的方法，應(yīng)用此方法已經(jīng)從脂多糖刺激前后的人牙髓細胞的差異表達的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達的基，其中5個為新基因，這一研究成果進一步證實了該方法的可操作性，而且我們在運用此方法過程中也積累了較豐富的經(jīng)驗，因此，本研究利用這一方法從兩種狀態(tài)的晶狀體上皮細胞中篩選差異表達的基因并建立cDNA文庫是可行的。(1)關(guān)于建立差異cDNA文庫：43

7、創(chuàng)新性

存在問題：對創(chuàng)新點提煉不夠把運用新技術(shù)、新方法理解為創(chuàng)新與研究目標(biāo)、研究內(nèi)容相混淆

對創(chuàng)新的理解：原始創(chuàng)新：填補空白或修改傳統(tǒng)的理論發(fā)明創(chuàng)造新技術(shù)、新方法

跟蹤創(chuàng)新：補充、完善現(xiàn)有理論修改、完善現(xiàn)有技術(shù)方法（1＋1＞2）提煉方法：用逆向思維方法提煉創(chuàng)新點7、創(chuàng)新性44

（1）基因篩選方法上的創(chuàng)新：首次采用改良的消減雜交技術(shù)建立白內(nèi)障晶狀體上皮細胞差異表達基因文庫，并制備相應(yīng)的基因芯片，利用此基因芯片篩選出老年性白內(nèi)障相關(guān)基因。上述兩種方法的有機結(jié)合使我們能快速、準(zhǔn)確、定性、定量地獲得多個白內(nèi)障相關(guān)基因。通過分析這些基因的結(jié)構(gòu)、研究它們的功能，揭示老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞變化的分子生物學(xué)機制，為防治白內(nèi)障提供新的思路。

（2）基因功能研究上的創(chuàng)新：......（1）基因篩選方法上的創(chuàng)新：45

8、年度研究計劃及預(yù)期研究結(jié)果

年度研究計劃：按年度列出研究內(nèi)容及其階段目標(biāo)擬組織的重要學(xué)術(shù)交流活動、國際合作與交流計劃

預(yù)期研究結(jié)果：

理論成果：建立/豐富/補充/填補......技術(shù)方法：建立/完善…...專利：可望獲得……論文：國際、國內(nèi)人才培養(yǎng)：青年科技骨干、博碩研究生

8、年度研究計劃及預(yù)期研究結(jié)果46四、研究基礎(chǔ)

1、研究工作積累

存在問題：內(nèi)容過簡；與申請項目無關(guān)。

撰寫要求：介紹與申請項目直接相關(guān)的預(yù)實驗研究結(jié)果；提供相關(guān)的研究論文、成果及專利等材料；以往應(yīng)用與申請項目有關(guān)的技術(shù)方法的經(jīng)歷；工作積累也要包括項目組成員的所有信息。四、研究基礎(chǔ)47

（1）有關(guān)消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)的工作基礎(chǔ):本研究所用的基因篩選技術(shù)主要是改良的消減雜交技術(shù)，此技術(shù)是我們研究組成員主要參與建立的，并利用此技術(shù)從脂多糖刺激前后的人牙髓細胞的差異表達的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達的基因，其中5個為新基因，有關(guān)此技術(shù)的研究論文有：......

（2）有關(guān)基因轉(zhuǎn)染方面的研究工作基礎(chǔ)：......

（3）有關(guān)老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的研究基礎(chǔ)：......

（1）有關(guān)消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)的工作基礎(chǔ):48

2、工作條件

實驗室整體實力和規(guī)模（地位、課題、成果等）

實驗室所具備的與申請項目相關(guān)的主要儀器設(shè)備

實驗室所在單位具備的申請項目所需的實驗條件

3、項目組人員簡歷

所有人員均需介紹（重點是項目負責(zé)人）

介紹內(nèi)容根據(jù)在項目中的分工有所側(cè)重

列出與申請項目相關(guān)的研究論文及成果

2、工作條件

實驗室整體實力和規(guī)模（地位、49第二部分

撰寫申請書時常見問題解析

第二部分

撰寫申請書時常見問題解析

50

1、對立論依據(jù)、實驗方案、研究基礎(chǔ)應(yīng)闡述的內(nèi)容

以及三者關(guān)系的理解

立論依據(jù)：闡述背景和理由，回答“為什么”

實驗方案：是申請書的核心，回答“怎么做”

研究基礎(chǔ)：展示積累和實力，回答“做了啥”

一、對部分撰寫內(nèi)容及其相互關(guān)系的理解1、對立論依據(jù)、實驗方案、研究基礎(chǔ)應(yīng)闡述的內(nèi)容

512、對研究目標(biāo)的確定

國內(nèi)外現(xiàn)狀分析中提出的具體科學(xué)問題就是項目的研究目標(biāo)，研究目標(biāo)具體到什么程度，要根據(jù)研究周期、資助強度來確定。

2、對研究目標(biāo)的確定

國內(nèi)外現(xiàn)狀分析中52

3、研究目標(biāo)、研究內(nèi)容、研究方法的關(guān)系

依據(jù)目標(biāo)確定研究內(nèi)容

根據(jù)內(nèi)容選擇研究方法4、研究內(nèi)容與技術(shù)路線的區(qū)別

研究內(nèi)容：根據(jù)總體目標(biāo)分若干分題，重點回答

做什么—觀察指標(biāo)、階段目標(biāo)

技術(shù)路線：重點回答怎么做—在具體步驟中體現(xiàn)

研究內(nèi)容和研究方法3、研究目標(biāo)、研究內(nèi)容、研究方法的關(guān)系

依535、對擬解決的關(guān)鍵問題與可行性分析撰寫時的區(qū)別二者相同之處：擬解決的關(guān)鍵問題在可行性分析時也要提及

二者不同之處：撰寫擬解決關(guān)鍵問題，重點回答如何解決。解決辦法包括：通過研究思路的設(shè)計巧妙運用最新出現(xiàn)的研究方法通過不同方法各自優(yōu)點的有機結(jié)合

在進行可行性分析時，重點回答能夠解決。

分析問題角度：通過對現(xiàn)有理論分析提供理論依據(jù)通過對預(yù)研結(jié)果分析提供實驗依據(jù)通過對他人研究成果描述提供佐證5、對擬解決的關(guān)鍵問題與可行性分析撰寫時的區(qū)別546、創(chuàng)新點、研究目標(biāo)和預(yù)期研究結(jié)果的區(qū)別三者的共同點：都包含一個“新”字。

三者的不同點：概念的外延不同。創(chuàng)新點：①形態(tài)學(xué)證實在腦下垂體中確有神經(jīng)纖維存在

②進一步實驗證實是肽能神經(jīng)研究目標(biāo)：通過各種形態(tài)學(xué)研究充分證明在腦下垂體中確有肽能神經(jīng)支配預(yù)期研究結(jié)果：提出腦下垂體肽能神經(jīng)和體液雙重調(diào)節(jié)

假說，對原有理論提出挑戰(zhàn)。6、創(chuàng)新點、研究目標(biāo)和預(yù)期研究結(jié)果的區(qū)別55

二、尚需注意的幾個問題

1、在項目設(shè)計過程中要樹立整體觀念，要講述一個完整的故事。2、文字表達要精雕細琢，每一句話說明什么要做到心中有數(shù)。3、文獻回顧不能回避國內(nèi)外最新研究進展，尤其是不同學(xué)派的觀點。4、重點內(nèi)容、觀點要用黑體強調(diào)。

二、尚需注意的幾個問題56第三部分

基金申報相關(guān)規(guī)定及要求

第三部分

基金申報相關(guān)規(guī)定及要求

57一、基金申報管理規(guī)定一、基金申報管理規(guī)定58申請者基本資格：項目的實際負責(zé)人；正式受聘，年工作不少于六月；在職研究生只可申請面上項目限項規(guī)定：高級專業(yè)技術(shù)職務(wù)的科技工作者申請與承擔(dān)（含參加）面上、重點、重大等類別基金項目的數(shù)量（不包括執(zhí)行期一年及在一年以內(nèi)的基金項目）累計不得超過三項項目管理相關(guān)規(guī)定申請者基本資格：項目的實際負責(zé)人；正式受聘，年工作不少于六月59面上項目管理辦法面上項目包括自由申請項目、青年科學(xué)基金項目和地區(qū)科學(xué)基金項目，資助期限一般為三年

面上項目的申請采取集中受理方式申請者須符合《規(guī)定》要求，并具有高級專業(yè)技術(shù)職務(wù)或已獲得博士學(xué)位。具有中級專業(yè)技術(shù)職務(wù)但未獲得博士學(xué)位的研究人員，經(jīng)兩名具有高級專業(yè)技術(shù)職務(wù)的同行專家推薦，亦可申請。在職研究生作為申請者須征得導(dǎo)師同意面上項目管理辦法面上項目包括自由申請項目、青年科學(xué)基金項目和60青年科學(xué)基金項目的申請者限在受理申請當(dāng)年1月1日未滿35周歲，并且未曾獲得該類項目的資助申請者同期只能申請一項，每個項目的申請者限為一人。申請者和具有高級專業(yè)技術(shù)職務(wù)的項目組主要成員，當(dāng)年申請及承擔(dān)（含參加）在研的面上項目數(shù)合計不得超過兩項。不具有高級專業(yè)技術(shù)職務(wù)的申請者，當(dāng)年申請及負責(zé)在研的面上項目數(shù)合計不得超過一項，但參加項數(shù)不限面上項目管理辦法青年科學(xué)基金項目的申請者限在受理申請當(dāng)年1月1日未滿35周歲61研究經(jīng)費是指直接用于科學(xué)研究的費用?？蒲袠I(yè)務(wù)費：測試計算分析費,動力能源費,差旅費,調(diào)研和學(xué)術(shù)會議費,資料、論文版面費和印刷費,文獻檢索、入網(wǎng)等信息通訊費,學(xué)術(shù)刊物訂閱費實驗材料費:原材料、試劑、藥品等消耗品購置費,實驗動物、植物的購置、種植、養(yǎng)殖費,標(biāo)本、樣品的采集加工費和包裝運輸費儀器設(shè)備費:專用儀器設(shè)備購置、運輸、安裝費和修理費,自制專用儀器設(shè)備的材料、配件購置費和加工費實驗室改裝費:不得用于實驗室擴建、土建、房屋維修等費用的開支協(xié)作費:外單位協(xié)作承擔(dān)自然科學(xué)基金項目部分研究試驗工作的費用經(jīng)費管理辦法研究經(jīng)費是指直接用于科學(xué)研究的費用。經(jīng)費管理辦法62國際合作與交流經(jīng)費：直接關(guān)系的國際合作與交流費用,包括項目組人員出訪及外國專家來訪的部分費用勞務(wù)費：用于直接參加項目研究的研究生、博士后人員的勞務(wù)費用管理費：項目依托單位為組織和支持項目研究而支出的費用,包括項目執(zhí)行中公用儀器設(shè)備、房屋占用費等經(jīng)費管理辦法國際合作與交流經(jīng)費：直接關(guān)系的國際合作與交流費用,包括項目組63科目面上重大、重點杰出國際合作費<15%<10%<20%勞務(wù)費<15%<10%<10%管理費<5%<5%<5%經(jīng)費管理辦法科目面上重大、重點杰出國際合作費<15%<10%<20%64二、2007版申請書注意事項二、2007版申請書注意事項65建議正文編輯方式使用Word錄入、編輯和排版需要錄入的申請書正文部分內(nèi)容。完成編輯后，將該文件命名保存打開申請書文件，光標(biāo)定位在正文中需要插入內(nèi)容的位置選擇“插入”下拉菜單中的“文件”插入功能，選擇包含申請書正文內(nèi)容的文件，將其內(nèi)容全部導(dǎo)入到申請書中（不要使用剪貼板功能進行文件內(nèi)容導(dǎo)入）建議正文編輯方式使用Word錄入、編輯和排版需要錄入的662007年面上項目申請資助經(jīng)費30萬元/項2007年面上項目申請資助經(jīng)費67確認(rèn)項目負責(zé)人申報資格確認(rèn)申請書為2007版確認(rèn)提交和打印電子文檔時已“檢查保護”確認(rèn)電子版的版本號與紙質(zhì)文件完全一致確認(rèn)申報學(xué)科選擇正確，項目信息填報完整無誤確認(rèn)項目負責(zé)人和項目組成員親自簽字形式審查要點：12個確認(rèn)確認(rèn)項目負責(zé)人申報資格形式審查要點：12個確認(rèn)68確認(rèn)參與多個項目的人員身份和提法一致確認(rèn)項目組成員統(tǒng)計人數(shù)與填報人數(shù)一致確認(rèn)正文中流程圖及插入圖片位置、形式正確確認(rèn)電子郵箱暢通，以便及時查閱郵件確認(rèn)所有附件材料完整并已經(jīng)盡量電子化確認(rèn)A3紙雙面套印，蓋章頁放在最后形式審查要點：12個確認(rèn)確認(rèn)參與多個項目的人員身份和提法一致形式審查要點：12個確認(rèn)69謝謝！

謝謝！

70

基金申請技巧講座

第四軍醫(yī)大學(xué)科研部

蘇景寬

基金申請技巧講座

第四軍醫(yī)大學(xué)科研部

蘇景寬

71第一部分

如何撰寫申請書

第一部分

如何撰寫申請書

72一、摘要（限400字）

包括：研究方法、內(nèi)容、目標(biāo)、科學(xué)意義。

如：采用……方法，進行……研究，闡明……機制或揭示……規(guī)律，為……奠定基礎(chǔ)／提供……思路。作用：畫龍點睛效果：引發(fā)評議專家的興趣，使其產(chǎn)生探個究竟的好奇心——“他到底是怎么做的？”一、摘要（限400字）

包括：研究方法、內(nèi)容、目標(biāo)、科學(xué)73

采用改良的消減雜交技術(shù)建立老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞差異表達基因文庫并制備基因芯片，利用此芯片篩選出白內(nèi)障相關(guān)基因。通過基因轉(zhuǎn)染在體和培養(yǎng)的晶狀體上皮細胞，觀察細胞的形態(tài)、增殖和凋亡、骨架蛋白及晶狀體蛋白的變化，研究基因的功能。從晶狀體上皮細胞的角度闡明老年性白內(nèi)障發(fā)生的分子生物學(xué)機制，為防治白內(nèi)障提供新思路和理論依據(jù)。采用改良的消減雜交技術(shù)建立老年性白內(nèi)障晶狀體74二、立論依據(jù)

對基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合國際科學(xué)發(fā)展趨勢，

論述科學(xué)意義對應(yīng)用基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合學(xué)科前沿，圍繞國民經(jīng)濟和社會發(fā)展中的重要科技問題論述應(yīng)用前景二、立論依據(jù)75

在立論依據(jù)的闡述中，對研究領(lǐng)域、研究方向、

具體科學(xué)問題的理解

研究領(lǐng)域：白內(nèi)障的研究，包括發(fā)病機制、預(yù)防、診斷、

治療措施等研究

研究方向：白內(nèi)障發(fā)病機制的研究，包括環(huán)境因素、致病

靶點、細胞水平、分子水平研究等

科學(xué)問題：白內(nèi)障發(fā)病過程中的相關(guān)基因研究，包括致病

基因篩選、功能研究、調(diào)控機制、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等在立論依據(jù)的闡述中，對研究領(lǐng)域、研究方向、76在研究領(lǐng)域?qū)用鎻难芯糠较蛘归_圍繞某一具體科學(xué)問題（本項目研究目標(biāo)）進行歸納分析提出研究設(shè)想從研究領(lǐng)域切入研究意義國內(nèi)外現(xiàn)狀分析在研究領(lǐng)域?qū)用鎻难芯糠较蛘归_圍繞某一具體科學(xué)問題提出研究從研77

1、項目的研究意義

存在問題：對科學(xué)意義的闡述不足或夸大

撰寫方法：

從領(lǐng)域入手，提出主要問題，引出熱點研究方向。圍繞熱點研究方向進行簡要分析，找出目前尚未解決的具體科學(xué)問題，以此為切入點提出假設(shè)，闡述如果解決了該問題（研究目標(biāo)），對該領(lǐng)域甚至相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)貢獻（理論意義或應(yīng)用前景）。

1、項目的研究意義78

老年性白內(nèi)障是與年齡相關(guān)的疾病，隨著年齡的增加，其發(fā)病比率也不斷升高。特別是人類趨向老齡化，白內(nèi)障的患病人數(shù)還將持續(xù)增加。目前，它已是人類第一位的致盲疾病。迄今為止,治療白內(nèi)障唯一有效的方法是通過手術(shù)摘除混濁的晶狀體并植入人工晶狀體。雖然手術(shù)后患者可以恢復(fù)良好的視力，但是不可避免的術(shù)后并發(fā)癥以及手術(shù)設(shè)備、材料耗資巨大，治療白內(nèi)障所花費的資金已成為世界各國包括富裕的發(fā)達國家嚴(yán)重的醫(yī)療負擔(dān)。最近的調(diào)查表明，如果把老年性白內(nèi)障的發(fā)病時間延緩10年，白內(nèi)障手術(shù)的數(shù)量就會減少45%[1]。所以，一些學(xué)者認(rèn)為通過預(yù)防白內(nèi)障發(fā)生或延緩其發(fā)展的途徑征服白內(nèi)障已成為一項全球性的社會和社會經(jīng)濟問題[2]。老年性白內(nèi)障是與年齡相關(guān)的疾病，隨著年齡的79

但是目前我們對老年性白內(nèi)障發(fā)病機理的認(rèn)識還不十分清楚。多年以來許多學(xué)者的研究結(jié)果證實晶狀體上皮細胞在老年性白內(nèi)障發(fā)生中起重要的作用，但對其中進一步的基因調(diào)控知之甚少。如果從參與老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞變化的相關(guān)基因入手，研究基因的生物學(xué)功能，有可能抓住引起白內(nèi)障發(fā)生、發(fā)展的主要環(huán)節(jié)。據(jù)此，本研究擬利用改良的消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)準(zhǔn)確、全面、快速的特點，以晶狀體上皮細胞為研究對象，一次性篩選出老年性白內(nèi)障全部有差異表達的基因，從中再篩選出與白內(nèi)障相關(guān)基因，并著重對其功能進行研究，從基因水平闡明白內(nèi)障的發(fā)病機制，為防治白內(nèi)障提供新思路和理論依據(jù)。但是目前我們對老年性白內(nèi)障發(fā)病機理的認(rèn)識還80

2、國內(nèi)外現(xiàn)狀分析（與綜述的區(qū)別）

存在問題：A、低水平重復(fù)：不了解最新進展，對國內(nèi)外現(xiàn)狀缺乏真正了解，提出的問題別人已解決。B、文獻復(fù)習(xí)不全：檢索文獻方法不當(dāng)、選擇關(guān)鍵詞不妥，甚至人為縮小檢索范圍。C、總結(jié)表達不夠：對國內(nèi)外現(xiàn)狀缺乏歸納分析，只是簡單羅列，缺乏邏輯性和針對性。

D、對方法原理理解不夠：對研究方法不熟悉，簡單移植或夸大其作用，缺乏實際應(yīng)用的可行性。2、國內(nèi)外現(xiàn)狀分析（與綜述的區(qū)別）81

撰寫方法：要緊緊圍繞本次申請項目的主題。A、從領(lǐng)域切入，簡要論述國內(nèi)外研究成果，并引出當(dāng)前的熱點研究方向。B、從研究方向展開，較詳細地分析國內(nèi)外的研究

進展，闡明在該方向上存在的問題。C、圍繞存在的問題，結(jié)合國內(nèi)外以往的研究結(jié)果、

當(dāng)前的現(xiàn)狀及今后的發(fā)展趨勢，詳細論述和分析這些問題產(chǎn)生的原因，提出該方面的空白點、未知數(shù)、以及研究的難點、焦點，從而為自己申請項目確立研究目標(biāo)奠定充分的立論基礎(chǔ)。

82

D、對擬采用的技術(shù)方法進行介紹和分析。

成熟的方法重點介紹可以應(yīng)用于本研究的理論依據(jù)和實驗依據(jù)。

新方法在詳細介紹其原理的基礎(chǔ)上，闡明可以應(yīng)用于本研究的理論依據(jù)和實驗依據(jù)。

需特別注意的問題：必須對所運用的技術(shù)方法的原理、流程尤其是在實際運用中可能出現(xiàn)的問題要十分清楚，絕不能是一種簡單的移植。例如：抗體+功能基團，理論上可以實現(xiàn)融合，但存在“活性、表達載體選擇、純化等問題。E、提出本項目的研究設(shè)想。D、對擬采用的技術(shù)方法進行介紹和分析。83

防治白內(nèi)障必須針對其發(fā)病的主要環(huán)節(jié)。多年以來，國內(nèi)外學(xué)者從不同的角度探討白內(nèi)障的發(fā)生機理。就致病的環(huán)境因素講，氧化因子、紫外線輻射、晶狀體周圍環(huán)境中離子濃度改變及一些生長因子、細胞因子的改變均與老年性白內(nèi)障的發(fā)生有關(guān)。就研究的部位分，晶狀體中皮質(zhì)與核的蛋白質(zhì)改變及晶狀體纖維的改變與白內(nèi)障的形成有關(guān)，而位于晶狀體前囊膜下單層的晶狀體上皮細胞在白內(nèi)障的形成中的變化更引人關(guān)注。

防治白內(nèi)障必須針對其發(fā)病的主要環(huán)節(jié)。多年84

因為晶狀體上皮細胞是晶狀體中唯一有分裂活性、數(shù)量相對穩(wěn)定的細胞，它們分裂、分化出晶狀體纖維細胞、產(chǎn)生晶體蛋白，終生不停息，形成了晶狀體均一、對稱的結(jié)構(gòu)，對維持晶狀體的透明起重要作用。不僅如此，晶狀體上皮細胞還是晶狀體中受外來刺激影響較早的部位，已有研究證實老年性白內(nèi)障的晶狀體上皮細胞還發(fā)生退行性變、細胞膜通透性增加、細胞內(nèi)酶活性改變、細胞數(shù)量減少、凋亡細胞增多等改變，與單純老化的晶狀體之間存在差異[3-5]。因為晶狀體上皮細胞是晶狀體中唯一有分裂活性85

體外實驗也證實多種因素(H2O2、UV-B、晶狀體蛋白的自身抗體)誘發(fā)的白內(nèi)障模型中晶狀體上皮的損傷是晶狀體混濁的主要環(huán)節(jié)[6-8]。因此，從晶狀體上皮細胞的變化入手探討白內(nèi)障的成因，有可能抓住揭示白內(nèi)障發(fā)病機理的主要環(huán)節(jié)。而晶狀體上皮細胞變化的基因調(diào)控機制是問題的關(guān)鍵所在，也是有待我們深入研究的問題。體外實驗也證實多種因素(H2O2、UV-B、晶86

白內(nèi)障的形成與晶狀體的老化密不可分，是晶狀體老化的極端表現(xiàn)。晶狀體的老化是多種因素相互作用的結(jié)果，包括基因的和非基因的隨機變化的不斷積累，也有程序性的、非隨機性的組織特異性多種基因表達的改變。目前，國內(nèi)外對白內(nèi)障相關(guān)基因的研究主要以下三方面：

白內(nèi)障的形成與晶狀體的老化密不可分，是晶87

一是對體外培養(yǎng)的晶狀體白內(nèi)障模型及上皮細胞的研究。UV-B輻射作用誘導(dǎo)的白內(nèi)障中晶狀體上皮細胞是主要的靶細胞，其Na-K-ATP酶的活性增加，蛋白質(zhì)的合成和分泌增加；上皮細胞的凋亡增加，其中有c-fos基因的表達增加；還有組蛋白H4、H3的低表達`和蛋白酶C、β-肌動蛋白、γ-肌動蛋白基因的高表達[9-12]。Carper等[13]利用RT-PCR-DD(reversetranscription-polymerasechainreactiondifferentialdisplay)技術(shù)研究H2O2誘導(dǎo)的晶體上皮細胞的基因差異性表達結(jié)果顯示NADH脫氫酶4亞基、細胞色素b、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶基因表達減少以及細胞因子的核蛋白、替代拼接因子2（alternativesplicingfactor）、β-三羥基異丁酰輔酶A水解酶基因表達的增加。一是對體外培養(yǎng)的晶狀體白內(nèi)障模型及上皮88

二是利用轉(zhuǎn)基因動物的研究。波形纖維蛋白基因（vimentin）、雜交的Ⅲ型中間纖維蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出白內(nèi)障，而且有隨小鼠年齡增加白內(nèi)障加重的趨勢。晶狀體改變的共同特點是晶狀體纖維細胞分化受抑制[14,15]。Gong等[16]報告晶狀體的細胞膜蛋白連接蛋白α3（α3Connexin）基因敲除小鼠（knockoutmouse）在晶狀體形成的早期及纖維細胞分化早期不受影響，其后出現(xiàn)與晶狀體蛋白溶解有關(guān)的核性白內(nèi)障。雖然體外實驗和白內(nèi)障轉(zhuǎn)基因小鼠都提示我們一些基因的變化與白內(nèi)障有關(guān)，但是，這些變化的基因是否與老年性白內(nèi)障形成有關(guān)，目前尚缺乏進一步的報告。

二是利用轉(zhuǎn)基因動物的研究。波形纖維蛋白基89

三是對人老年性白內(nèi)障晶體上皮的研究。Lee[17]利用RT-PCR技術(shù)研究顯示前極性白內(nèi)障與核性白內(nèi)障上皮細胞中纖維連接蛋白、I型膠原纖維、α-平滑肌蛋白、TGF-β1、TGF-β2、TGF-βⅡ型受體、結(jié)締組織生長因子的基因表達有差異。Kantorow等[18]利用RT-PCR-DD研究老年性白內(nèi)障與正常晶狀體上皮的基因差異性表達的初步結(jié)果是老年性白內(nèi)障有三個高表達基因和12個低表達的基因。但就DD-PCR技術(shù)來講，在實驗中難以解決假陰性、假陽性以及克隆全長cDNA的問題。

三是對人老年性白內(nèi)障晶體上皮的研究。Le90

上述三方面的研究均取得了不同程度的研究結(jié)果，但由于當(dāng)時技術(shù)條件的限制都未能全面闡明與白內(nèi)障相關(guān)的基因及其功能。尋找白內(nèi)障時晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞間差異表達的基因有可能揭示白內(nèi)障的發(fā)病機理。上述三方面的研究均取得了不同程度的研究結(jié)果，91

尋找差異表達基因的經(jīng)典方法是消減雜交技術(shù)（subtractivehybridization,SH），它是……，但是實驗操作復(fù)雜。

經(jīng)過改進后的抑制性消減雜交（suppressionsubtractivehybridization,SSH是Diatchenko等1996年建立的方法）……簡化了實驗操作，但仍然問題很多。我校生化教研室建立了改良消減雜交技術(shù)[19，20]，其特點是：簡便易行，能夠獲得目的細胞特異表達的全長基因，對低豐度基因也能有效分離。

尋找差異表達基因的經(jīng)典方法是消減雜交技術(shù)（92

該方法的建立者已利用這一技術(shù)從脂多糖刺激前后的人牙髓細胞的差異表達的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達的基因，其中5個為新基因。同理，利用此方法也能快速、有效地獲得白內(nèi)障晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞間差異表達的基因，并克隆到全長cDNA，為進一步的結(jié)構(gòu)和功能研究打下基礎(chǔ)。該方法的建立者已利用這一技術(shù)從脂多糖刺激前后的93基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)，使檢測差異表達基因和未知DNA分子變得更快捷、準(zhǔn)確、高效?；蛐酒窃?996年被提出并開始研制的，該技術(shù)是將成千上萬的DNA探針集中到1厘米見方的基片上，利用堿基互補原理，DNA探針中的已知堿基序列與被測定的未知DNA分子雜交后由標(biāo)記分子標(biāo)記雜交體，經(jīng)自動閱讀設(shè)備分析雜交結(jié)果，從而對檢測基因進行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析，確定未知DNA分子?；蛐酒夹g(shù)的出現(xiàn)，使檢測差異表達基因和未知DN94

由于目前尚沒有針對白內(nèi)障研究的現(xiàn)成基因芯片，根據(jù)本研究的需要，我們將篩選到的差異表達的所有基因建立cDNA文庫，再利用基因芯片技術(shù)制備成基因芯片，以此檢測多個樣本中白內(nèi)障晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞間差異表達的基因，從中進一步篩選出白內(nèi)障特異的基因，它們中可能有已知基因，也可能有未知基因。通過以上兩種技術(shù)的有機結(jié)合，我們能更快捷、有效、準(zhǔn)確地得到白內(nèi)障相關(guān)基因。由于目前尚沒有針對白內(nèi)障研究的現(xiàn)成基因芯片95

綜上所述，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為研究白內(nèi)障發(fā)生過程中的功能基因及特異調(diào)控基因提供了有利武器。本項目從晶狀體上皮細胞入手，利用改良的消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)系統(tǒng)研究與白內(nèi)障相關(guān)的基因，并采用對體外培養(yǎng)細胞和在體晶狀體上皮細胞的基因轉(zhuǎn)染，探討它們在晶狀體上皮細胞變化和白內(nèi)障形成中的作用，可望闡明白內(nèi)障晶狀體上皮細胞變化的分子生物學(xué)機制，為防治白內(nèi)障提供新的思路和理論依據(jù)。綜上所述，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為研究白內(nèi)障963、參考文獻

A、文獻類別要全：以英文文獻為主，同時也要引用

中文文獻---國內(nèi)同行中知名專家的文獻。

B、引文信息要全：文章題目、作者姓名、具體出處

（包括期刊名、年份、卷期、頁碼等）。

C、文獻年代要新：主要是近五年的文獻，最好能有

07年的最新文獻。

3、參考文獻

A、文獻類別要全：以英文文獻為97三、研究方案

1、研究目標(biāo)

撰寫要求：有限目標(biāo)，與研究內(nèi)容相呼應(yīng)

如：明確……關(guān)系，揭示……規(guī)律，闡明……原理（機制），建立……方法等舉例：篩選出與老年性白內(nèi)障相關(guān)的基因，明確部分基因在白內(nèi)障形成中的作用，從晶狀體上皮變化的角度闡明白內(nèi)障的發(fā)生機理，為防治白內(nèi)障提供線索。三、研究方案1、研究目標(biāo)如：明確……關(guān)系98

2、研究內(nèi)容：

存在問題：內(nèi)容過多，一個研究周期難以完成內(nèi)容分散，不能集中闡明研究目標(biāo)撰寫要求：內(nèi)容要適當(dāng)—確保研究周期內(nèi)完成為目標(biāo)服務(wù)—與目標(biāo)相輔相成要重點闡述—注意與技術(shù)路線區(qū)別

2、研究內(nèi)容：99舉例：

（1）篩選白內(nèi)障相關(guān)基因：采用改良的消減雜交技術(shù)，獲得人老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞和正常晶狀體上皮細胞差異表達的基因片段，建立cDNA文庫。制備差異表達基因的基因芯片，利用基因芯片技術(shù)從多個標(biāo)本的老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞中篩選出白內(nèi)障相關(guān)基因。舉例：100

（2）研究白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)：……

（3）研究白內(nèi)障相關(guān)基因在晶狀體上皮細胞變化中的作用：……觀察指標(biāo)如下：

①存活細胞數(shù)；②光鏡、透射電鏡下細胞形態(tài)的變化；③細胞凋亡檢測：用原位末端標(biāo)記和連接酶介導(dǎo)PCR方法，從形態(tài)和DNA水平分析細胞凋亡；④細胞增殖的檢測：……；⑤細胞骨架蛋白的檢測：……；⑥晶狀體蛋白的檢測：（2）研究白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)：……101

3、擬解決的關(guān)鍵問題：

存在問題：抓不住關(guān)鍵問題或抓得不準(zhǔn)。什么是關(guān)鍵問題？

--研究過程中對達預(yù)期目標(biāo)有重要影響的某些研究內(nèi)容或因素。--為達預(yù)期目標(biāo)所必須掌握的關(guān)鍵技術(shù)或研究手段。撰寫要求：找出關(guān)鍵問題，提出解決辦法。3、擬解決的關(guān)鍵問題：102舉例：

（1）建立差異表達的cDNA文庫：建立差異cDNA文庫是篩選老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的前提。為使差異cDNA文庫具有代表性，我們采取以下解決方案：①選擇各種類型老年性白內(nèi)障晶狀體的前囊膜、取足夠大量的標(biāo)本（擬取50例標(biāo)本）作為建庫的mRNA的來源。②利用改良的消減雜交技術(shù)可快速、有效地獲得差異表達的完整cDNA片段。此技術(shù)是本課題組成員主要的研究成果，在應(yīng)用此項技術(shù)中已積累了較豐富的實驗經(jīng)驗。舉例：103（2）制備基因芯片：制備用于本研究的芯片是篩選老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。制備基因芯片的關(guān)鍵是在1平方厘米的基片上放上成百上千的不同基因探針而不使它們發(fā)生任何混淆。在制作基因芯片時做到：①嚴(yán)格按操作程序進行；②在標(biāo)本的處理及RNA提取時避免污染，否則即會造成嚴(yán)重的損失。只要嚴(yán)格按操作程序進行操作就可以避免發(fā)生差錯。

（2）制備基因芯片：104（3）在體基因轉(zhuǎn)染：在體基因轉(zhuǎn)染是進行白內(nèi)障相關(guān)基因功能研究的關(guān)鍵。在體的晶狀體上皮細胞大部分處在靜息狀態(tài)，只有位于赤道前區(qū)的少量細胞具有分裂活性，而且晶狀體表面有一層膠原性質(zhì)的囊膜包裹。在體晶狀體的基因轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵是如何使大量分裂后細胞轉(zhuǎn)染，如何使病毒穿過晶狀體的囊膜，針對以上問題我們擬采取下列方法解決：①選用反轉(zhuǎn)錄病毒的慢病毒載體（lentiviralvector），它克服了一般反轉(zhuǎn)錄病毒只能轉(zhuǎn)染有分裂能力細胞的局限性，對分裂后細胞也能有效的轉(zhuǎn)染。這對在體晶狀體的基因轉(zhuǎn)染有很大的優(yōu)越性。②采用直徑1-2μm玻璃微管在顯微鏡下將病毒載體注入晶狀體的前囊膜下，既不破壞晶狀體的完整性，又可使病毒接觸到囊膜下的上皮細胞。（3）在體基因轉(zhuǎn)染：105

4、研究方法

存在問題：過于簡單：在方案中只有方法名稱而無具體步驟。過于繁雜：大量羅列一些常規(guī)的實驗方法。撰寫要求：以研究項目的需求為前提，盡量采用最適合的方法和手段，并將其操作步驟和關(guān)鍵環(huán)節(jié)體現(xiàn)在技術(shù)路線當(dāng)中。4、研究方法106

5、技術(shù)路線

存在問題：不清楚，不詳細，不可行。

撰寫要求：清晰、詳細、注意邏輯性。

撰寫方法：—以時間順序為主線設(shè)計技術(shù)路線—以研究內(nèi)容為主線設(shè)計技術(shù)路線—分大小標(biāo)題，突出邏輯關(guān)系?！敿毜貙懬宄總€具體步驟。5、技術(shù)路線107

（1）人晶狀體上皮細胞的獲得：老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞取自白內(nèi)障患者手術(shù)中取出的前囊膜（晶狀體上皮細胞緊貼于前囊膜），直徑約5mm。正常晶狀體上皮細胞取自角膜移植供體眼的晶狀體，在顯微鏡下撕下前囊膜，直徑約8mm。按文獻提供的方法去除晶狀體纖維細胞，仔細清洗以去除血細胞污染。

（2）建立差異cDNA文庫：從50例白內(nèi)障手術(shù)患者的前囊膜上取下的晶狀體上皮細胞作為實驗組，從25例正常晶狀體前囊膜上取下的晶狀體上皮細胞作為對照組，利用改良的消減雜交技術(shù)[19，20]，獲得差異表達的cDNA，并建立文庫。主要的實驗流程如下：（1）人晶狀體上皮細胞的獲得：老年性白內(nèi)障晶108

正常晶狀體上皮細胞白內(nèi)障晶狀體上皮細胞

PromegaPolyATtract?System1000

mRNA分離 mRNA分離

oligo-dT18反轉(zhuǎn)錄ntechCap-finder方法反轉(zhuǎn)錄 cDNA

Biotin-21-dUTPpending-cDNA隨機引物PCR雜交

SephacrylS-400柱正常晶狀體上皮細胞白內(nèi)障晶狀體上皮109

除鹽及小片段

鏈親和素-生物素磁性分離

除去雜交體及過量正常晶狀體上皮細胞cDNA“長距離”PCR

目的cDNA的特異擴增

克隆、鑒定、轉(zhuǎn)化建立差異基因文庫

110（3）制備基因芯片篩選白內(nèi)障相關(guān)基因：

①基因芯片的制備：………②白內(nèi)障相關(guān)基因的篩選：……（4）白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)分析：①序列測定：......②序列的計算機分析：......③獲得全長基因：......（5）基因轉(zhuǎn)染：

①培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞的轉(zhuǎn)染：……②在體晶狀體的轉(zhuǎn)染：……（3）制備基因芯片篩選白內(nèi)障相關(guān)基因：111

6、可行性分析

對實驗方案設(shè)計的分析理論分析研究手段方法分析預(yù)實驗結(jié)果分析對相關(guān)條件的分析所用特殊實驗材料（試劑）的分析對所具備的實驗條件進行分析對項目組成員搭配及其運用技術(shù)方法的能力分析6、可行性分析112(1)關(guān)于建立差異cDNA文庫：老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞與正常晶狀體上皮細胞是處在不同狀態(tài)下的細胞，細胞基因表達的改變是細胞蛋白功能等改變的基礎(chǔ)。尋找這些有差異的基因是探索細胞功能、狀態(tài)變化原因的突破口。利用的消減雜交技術(shù)是篩選差異表達基因的有效方法。改良的消減雜交技術(shù)是我們研究組成員建立的方法，應(yīng)用此方法已經(jīng)從脂多糖刺激前后的人牙髓細胞的差異表達的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達的基，其中5個為新基因，這一研究成果進一步證實了該方法的可操作性，而且我們在運用此方法過程中也積累了較豐富的經(jīng)驗，因此，本研究利用這一方法從兩種狀態(tài)的晶狀體上皮細胞中篩選差異表達的基因并建立cDNA文庫是可行的。(1)關(guān)于建立差異cDNA文庫：113

7、創(chuàng)新性

存在問題：對創(chuàng)新點提煉不夠把運用新技術(shù)、新方法理解為創(chuàng)新與研究目標(biāo)、研究內(nèi)容相混淆

對創(chuàng)新的理解：原始創(chuàng)新：填補空白或修改傳統(tǒng)的理論發(fā)明創(chuàng)造新技術(shù)、新方法

跟蹤創(chuàng)新：補充、完善現(xiàn)有理論修改、完善現(xiàn)有技術(shù)方法（1＋1＞2）提煉方法：用逆向思維方法提煉創(chuàng)新點7、創(chuàng)新性114

（1）基因篩選方法上的創(chuàng)新：首次采用改良的消減雜交技術(shù)建立白內(nèi)障晶狀體上皮細胞差異表達基因文庫，并制備相應(yīng)的基因芯片，利用此基因芯片篩選出老年性白內(nèi)障相關(guān)基因。上述兩種方法的有機結(jié)合使我們能快速、準(zhǔn)確、定性、定量地獲得多個白內(nèi)障相關(guān)基因。通過分析這些基因的結(jié)構(gòu)、研究它們的功能，揭示老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞變化的分子生物學(xué)機制，為防治白內(nèi)障提供新的思路。

（2）基因功能研究上的創(chuàng)新：......（1）基因篩選方法上的創(chuàng)新：115

8、年度研究計劃及預(yù)期研究結(jié)果

年度研究計劃：按年度列出研究內(nèi)容及其階段目標(biāo)擬組織的重要學(xué)術(shù)交流活動、國際合作與交流計劃

預(yù)期研究結(jié)果：

理論成果：建立/豐富/補充/填補......技術(shù)方法：建立/完善…...專利：可望獲得……論文：國際、國內(nèi)人才培養(yǎng)：青年科技骨干、博碩研究生

8、年度研究計劃及預(yù)期研究結(jié)果116四、研究基礎(chǔ)

1、研究工作積累

存在問題：內(nèi)容過簡；與申請項目無關(guān)。

撰寫要求：介紹與申請項目直接相關(guān)的預(yù)實驗研究結(jié)果；提供相關(guān)的研究論文、成果及專利等材料；以往應(yīng)用與申請項目有關(guān)的技術(shù)方法的經(jīng)歷；工作積累也要包括項目組成員的所有信息。四、研究基礎(chǔ)117

（1）有關(guān)消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)的工作基礎(chǔ):本研究所用的基因篩選技術(shù)主要是改良的消減雜交技術(shù)，此技術(shù)是我們研究組成員主要參與建立的，并利用此技術(shù)從脂多糖刺激前后的人牙髓細胞的差異表達的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達的基因，其中5個為新基因，有關(guān)此技術(shù)的研究論文有：......

（2）有