蛋白質(zhì)工程制藥

04蛋白質(zhì)工程制藥S1蛋白質(zhì)工程制藥概述S2蛋白質(zhì)工程的基本技術(shù)S3蛋白質(zhì)工程制藥實(shí)例S1蛋白質(zhì)工程制藥概述從基因工程藥物到蛋白質(zhì)工程藥物蛋白質(zhì)工程的誕生、概念蛋白質(zhì)工程的基本過(guò)程蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)基因工程藥物蛋白質(zhì)工程藥物1982年第一個(gè)基因工程藥物：重組人胰島素重組蛋白存在問(wèn)題：1、穩(wěn)定性差：體內(nèi)半衰期短2、藥理活性不夠強(qiáng)：使用劑量偏大3、毒副作用大4、生產(chǎn)工藝復(fù)雜蛋白質(zhì)工程藥物蛋白質(zhì)工程的誕生1970S末，Smith等人建立了寡核苷酸點(diǎn)突變改變DNA序列的方法1982年，一些實(shí)驗(yàn)室用此技術(shù)來(lái)改造蛋白質(zhì)分子，研究蛋白質(zhì)的功能1983年，Ulmer發(fā)表了題為“ProteinEngineering”的專論目前已應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，并有多種產(chǎn)品上市已上市的蛋白質(zhì)工程藥物1、體內(nèi)半衰期短2、藥理活性不夠強(qiáng)3、毒副作用大4、生產(chǎn)工藝復(fù)雜已上市的蛋白質(zhì)工程藥物1、體內(nèi)半衰期短2、藥理活性不夠強(qiáng)3、毒副作用大4、生產(chǎn)工藝復(fù)雜已上市的蛋白質(zhì)工程藥物1、體內(nèi)半衰期短2、藥理活性不夠強(qiáng)3、毒副作用大4、生產(chǎn)工藝復(fù)雜蛋白質(zhì)工程的概念蛋白質(zhì)工程（ProteinEngineering）(第二代基因工程)是以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的知識(shí)為基礎(chǔ)，通過(guò)周密的分子設(shè)計(jì)以及DNA重組技術(shù)，把天然的蛋白質(zhì)改造成合乎人類(lèi)需要的新的突變蛋白質(zhì)(mutein)的一項(xiàng)技術(shù)。蛋白質(zhì)工程的概念內(nèi)涵：1、從DNA水平改變基因，改造蛋白質(zhì)2、一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基結(jié)構(gòu)域全新蛋白質(zhì)3、有目的地改造，獲得期望功能——強(qiáng)調(diào)分子設(shè)計(jì)4、結(jié)合DNA重組技術(shù)從不同尺度改造蛋白質(zhì)工程的基本過(guò)程蛋白質(zhì)工工程的基基本過(guò)程程1、分離離純化所所需改造造的目的的蛋白2、對(duì)蛋蛋白進(jìn)行行氨基酸酸序列測(cè)測(cè)定、X射線晶晶體衍射射分析、、核磁共共振分析析等———結(jié)構(gòu)和和功能信信息3、根據(jù)據(jù)結(jié)構(gòu)和和功能信信息、生生物信息息學(xué)信息息，運(yùn)用用蛋白質(zhì)質(zhì)分子預(yù)預(yù)測(cè)技術(shù)術(shù)提出蛋蛋白質(zhì)設(shè)設(shè)計(jì)方案案4、分離離克隆該該蛋白編編碼基因因，并進(jìn)進(jìn)行突變變改造5、插入入適當(dāng)?shù)牡妮d體表表達(dá)6、分離離純化表表達(dá)產(chǎn)物物，檢測(cè)測(cè)其生物物學(xué)功能能實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)三個(gè)基本本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)計(jì)的分類(lèi)類(lèi)蛋白質(zhì)從從頭設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)策略蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)的三個(gè)個(gè)基本條條件：1、蛋白白質(zhì)分子子的基本本知識(shí)：：理化性性質(zhì)、結(jié)結(jié)構(gòu)與功功能、構(gòu)構(gòu)象規(guī)律律2、對(duì)具具體改造造的蛋白白質(zhì)分子子必須有有一個(gè)系系統(tǒng)、全全面和深深入的了了解3、分子子設(shè)計(jì)的的基本工工具：高高性能的的計(jì)算機(jī)機(jī)硬件、、功能齊齊全的計(jì)計(jì)算機(jī)軟軟件——只有有在此基基礎(chǔ)上，，才能應(yīng)應(yīng)用蛋白白質(zhì)分子子預(yù)測(cè)技技術(shù)，提提出合理理的設(shè)計(jì)計(jì)方案三個(gè)基本本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)計(jì)的分類(lèi)類(lèi)蛋白質(zhì)從從頭設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)策略蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)的分類(lèi)類(lèi)1、小范范圍改造造：對(duì)已知結(jié)結(jié)構(gòu)的蛋蛋白質(zhì)進(jìn)進(jìn)行少數(shù)數(shù)幾個(gè)殘殘基的替替換、部部分片段段的缺失失，改善善蛋白質(zhì)質(zhì)的性質(zhì)質(zhì)和功能能。2、較大大程度的的改造：：根據(jù)需求求對(duì)來(lái)源源于不同同蛋白質(zhì)質(zhì)的結(jié)構(gòu)構(gòu)域進(jìn)行行拼接組組裝，或或在蛋白白質(zhì)分子子中進(jìn)行行大范圍圍肽鏈替替換、結(jié)結(jié)構(gòu)域替替換，獲獲得多功功能復(fù)合合體。3、蛋白白質(zhì)從頭頭設(shè)計(jì)（denovoproteindesign）三個(gè)基本本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)計(jì)的分類(lèi)類(lèi)蛋白質(zhì)從從頭設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)策略概念：從蛋白質(zhì)質(zhì)分子一一級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)出發(fā)，，設(shè)計(jì)制制造自然然界中不不存在的的全新蛋白白，使之具具有特定定的空間間結(jié)構(gòu)和和預(yù)期的的生物功功能。1、需要要扎實(shí)的的理論基基礎(chǔ)2、在分子設(shè)計(jì)計(jì)與試驗(yàn)驗(yàn)證證之間交互互進(jìn)行蛋白質(zhì)從從頭設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)三個(gè)基本本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)計(jì)的分類(lèi)類(lèi)蛋白質(zhì)從從頭設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)策略PDA循循環(huán)（ProteinDesignAutomation））1、設(shè)計(jì)模擬實(shí)驗(yàn)分析2、不斷斷循環(huán)：：一步步步的修正正最終獲獲得成功功蛋白質(zhì)從從頭設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)計(jì)算機(jī)模擬基因構(gòu)建突變蛋白質(zhì)產(chǎn)物功能分析三個(gè)基本本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)計(jì)的分類(lèi)類(lèi)蛋白質(zhì)從從頭設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)策略蛋白質(zhì)從從頭合成成的范例例凋亡誘導(dǎo)導(dǎo)肽：CNGRC-GGn-（KLAKLAK）2KLAKLAK：可形成典典型的兩兩親-螺旋結(jié)結(jié)構(gòu)，進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞胞后，可可破壞線線粒體膜膜引起細(xì)細(xì)胞凋亡亡NGR：：與新生血血管的內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞胞特異結(jié)結(jié)合，起起到靶向向彈頭的的作用蛋白質(zhì)從從頭設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)三個(gè)基本本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)計(jì)的分類(lèi)類(lèi)蛋白質(zhì)從從頭設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)策略利用NGR為彈頭，，將KLALAK肽特異地地導(dǎo)向腫腫瘤部位位的新血血管內(nèi)皮皮細(xì)胞，，通過(guò)抑抑制新血血管的生生成，從從而抑制制腫瘤的的形成，，且對(duì)其其他細(xì)胞胞沒(méi)有明明顯的毒毒性。300mol/L3mol/L蛋白質(zhì)從從頭合成成的范例例凋亡誘導(dǎo)導(dǎo)肽：CNGRC-GGn-（（KLAKLAK）2蛋白質(zhì)從從頭設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)三個(gè)基本本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)計(jì)的分類(lèi)類(lèi)蛋白質(zhì)從從頭設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)策略蛋白質(zhì)從從頭合成成的范例例凋亡誘導(dǎo)導(dǎo)肽：CNGRC-GGn-（（KLAKLAK）2蛋白質(zhì)從從頭設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)考慮的其其他因素素1、Gly-Gly接接頭：防止兩功功能部位位的立體體結(jié)構(gòu)相相互影響響。2、L-型氨基基酸（D-型））：防止蛋白白酶的降降解三個(gè)基本本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)計(jì)的分類(lèi)類(lèi)蛋白質(zhì)從從頭設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)策略蛋白質(zhì)從從頭合成成的范例例凋亡誘導(dǎo)導(dǎo)肽：CNGRC-GGn-（（KLAKLAK）2蛋白質(zhì)從從頭設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果果1、特異異地被激激活的新新生血管管內(nèi)皮細(xì)細(xì)胞內(nèi)吞吞，引起起凋亡2、在小小鼠腫瘤瘤模型中中，可抑抑制腫瘤瘤的生長(zhǎng)長(zhǎng)，明顯顯延長(zhǎng)治治療組小小鼠的存存活時(shí)間間3、對(duì)健健康小鼠鼠超劑量量使用時(shí)時(shí)，沒(méi)有有毒副作作用的產(chǎn)產(chǎn)生三個(gè)基本本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)計(jì)的分類(lèi)類(lèi)蛋白質(zhì)從從頭設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)策略1、順式式思維理理性化設(shè)設(shè)計(jì)——合理理化設(shè)計(jì)計(jì)2、基于于各種功功能篩選選平臺(tái)的的非理性性逆向改改造策略略——非理理性的體體外進(jìn)化化3、兩種種策略的的結(jié)合蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)的策略略蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)三個(gè)基本本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)計(jì)的分類(lèi)類(lèi)蛋白質(zhì)從從頭設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)策略1、順式思維維理性化化設(shè)計(jì)——合理理化設(shè)計(jì)計(jì)基于現(xiàn)有有知識(shí)信信息：蛋蛋白質(zhì)的的結(jié)構(gòu)與與功能；；因此，受受到已有有認(rèn)識(shí)水水平的制制約。蛋白質(zhì)從從頭設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)的策略略蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)三個(gè)基本本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)計(jì)的分類(lèi)類(lèi)蛋白質(zhì)從從頭設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)策略2、基于各種種功能篩篩選平臺(tái)臺(tái)的非理理性逆向向改造策策略——非理理性的體體外進(jìn)化化1）構(gòu)建建包含眾眾多突變變蛋白的的文庫(kù)：：隨機(jī)突變變、DNA改組組等2）篩選選文庫(kù)：：從功能入入手進(jìn)行行篩選所所需要的的蛋白3）進(jìn)行行蛋白質(zhì)質(zhì)基本結(jié)結(jié)構(gòu)、序序列信息息的分析析蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)的策略略蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)三個(gè)基本本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)計(jì)的分類(lèi)類(lèi)蛋白質(zhì)從從頭設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)策略3、兩種種策略的的結(jié)合非理性的的體外進(jìn)進(jìn)化：彌補(bǔ)合理理性化設(shè)設(shè)計(jì)應(yīng)用用中的局局限性，，并且迅迅速得到到大量有有功能的的目標(biāo)分分子，通通過(guò)分析析積累所所需的蛋蛋白質(zhì)結(jié)結(jié)構(gòu)與功功能相關(guān)關(guān)信息合理化設(shè)設(shè)計(jì)：對(duì)非理性性篩選出出的候選選分子進(jìn)進(jìn)行合理理化的分分子修正正，使之之進(jìn)一步步符合實(shí)實(shí)際需求求蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)的策略略蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)三個(gè)基本本條件蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)計(jì)的分類(lèi)類(lèi)蛋白質(zhì)從從頭設(shè)計(jì)計(jì)蛋白質(zhì)分分子設(shè)計(jì)計(jì)策略S2蛋蛋白質(zhì)工工程的基基本技術(shù)術(shù)定點(diǎn)突變技技術(shù)隨機(jī)突變技技術(shù)1、寡核苷苷酸引物介介導(dǎo)的定點(diǎn)突變變2、PCR介導(dǎo)的定定點(diǎn)突變3、盒式突突變4、易錯(cuò)PCR5、DNA改組技術(shù)術(shù)易錯(cuò)PCR連續(xù)易錯(cuò)PCR（sequentialerror-pronePCR））：經(jīng)以上上一次PCR突變的的基因很難難獲得滿意意的結(jié)果，，于是將前前一輪PCR擴(kuò)增得得到的有用用突變基因因作為下一一輪PCR的模板，，每次獲得得的突變累累積起來(lái)，，產(chǎn)生重要要的有益突突變?？蛇z傳的變變化只發(fā)生生在單一分分子內(nèi)部，，屬于無(wú)性進(jìn)化（asexualevolution）易錯(cuò)PCR（error-pronePCR））：利用缺缺乏修復(fù)功功能的Taq酶，并并設(shè)置容易易引起出錯(cuò)錯(cuò)的PCR反應(yīng)條件件，在擴(kuò)增增目的基因因的同時(shí)引引入堿基錯(cuò)錯(cuò)配，導(dǎo)致致目的基因因隨機(jī)突變變——完全隨隨機(jī)化易錯(cuò)PCR優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便易行不足：突變文庫(kù)規(guī)規(guī)模有限，，有益突變變少，后續(xù)續(xù)篩選工作作費(fèi)力、耗耗時(shí)，只適適用于較小小的基因片片段（<800bp）DNA改組組技術(shù)DNA改組組（DNAshuffling），又叫有性性PCR（sexual-PCR）等，將單一一基因隨機(jī)片段化化，這些片段段自配對(duì)PCR擴(kuò)增增，由于易錯(cuò)PCR而引入大量量隨機(jī)突變變，并在多多次循環(huán)中中重組，使使基因在體體外迅速進(jìn)進(jìn)化，從中中篩選到有有益重組。。優(yōu)點(diǎn)：體外定向進(jìn)進(jìn)化，快速速，高效（（蛋白質(zhì)、、酶、抗體體等）DNA改組組技術(shù)基因家族改改組DNA改組組的不足：：從單一基因出出發(fā)，得到的隨隨機(jī)點(diǎn)突變變率很低，，且有益突突變的積累累相對(duì)緩慢慢在自然界中中，不同物物種同源基基因本身就就是具有非非常豐富的的變異，如如果加以利利用，就可可以大大地地加速基因因在體外的的進(jìn)化速度度——基因家族改改組（DNAfamilyshuffling）基因家族改改組S3蛋白白質(zhì)工程制制藥實(shí)例蛋白質(zhì)工程程在新藥研研究中的應(yīng)應(yīng)用胰島素的蛋蛋白質(zhì)工程程研究蛋白質(zhì)工程程在新藥研研究中的應(yīng)應(yīng)用1、提高藥藥效活性2、提高靶靶向性3、提高穩(wěn)穩(wěn)定性、改改善藥代動(dòng)動(dòng)力學(xué)特性性4、提高工工業(yè)生產(chǎn)效效率5、降低蛋蛋白藥物引引起的免疫疫反應(yīng)6、獲得具具有新功能能的蛋白分分子7、獲得特特定蛋白的的拮抗物或或類(lèi)似物8、模擬原原型蛋白分分子結(jié)構(gòu)開(kāi)開(kāi)發(fā)小分子子模擬肽類(lèi)類(lèi)藥物胰島素的蛋蛋白質(zhì)工程程研究胰島素是治治療糖尿病病的特效藥藥1、糖尿病病I型糖尿病?。篒I型糖尿尿?。阂葝u素抵抗抗（IR））為主，伴伴胰島素相相對(duì)缺乏；；以及胰島島素分泌缺缺陷，伴IR由于細(xì)胞介介導(dǎo)的胰島島B細(xì)胞自自身免疫性性破壞，導(dǎo)導(dǎo)致胰島素素絕對(duì)缺乏乏胰島素的蛋蛋白質(zhì)工程程研究閉環(huán)系統(tǒng)：自調(diào)控競(jìng)爭(zhēng)解吸附作用胰島素的蛋蛋白質(zhì)工程程研究胰島素是治治療糖尿病病的特效藥藥1、糖尿病病中國(guó)4000萬(wàn)，全全球1.5億患者急性并發(fā)癥癥：酮癥酸中毒毒（I，昏昏迷、死亡亡）非酮癥高滲滲性昏迷（（II）低血糖反應(yīng)應(yīng)（心慌、、手抖、饑饑餓、出冷冷汗）胰島素的蛋蛋白質(zhì)工程程研究胰島素是治治療糖尿病病的特效藥藥1、糖尿病病中國(guó)4000萬(wàn)，全全球1.5億患者慢性并發(fā)癥癥（可遍及全全身各重要要器官）：：心血管疾病病、慢性腎腎病視網(wǎng)膜病變變、神經(jīng)病病變胰島素的蛋蛋白質(zhì)工程程研究胰島素是治治療糖尿病病的特效藥藥2、胰島素素胰島素的蛋蛋白質(zhì)工程程研究胰島素是治治療糖尿病病的特效藥藥2、胰島素素胰島素從豬豬、牛等動(dòng)動(dòng)物的胰腺腺中提取，，100Kg胰腺只能提提取4-5g的胰島素，，其產(chǎn)量之之低和價(jià)格格之高可想想而知。胰島素的蛋蛋白質(zhì)工程程研究胰島素是治治療糖尿病病的特效藥藥2、胰島素素1982年年，重組人人胰島素上上市——第一個(gè)個(gè)基因工程程藥物！第一個(gè)完成成序列測(cè)定定的蛋白質(zhì)質(zhì)（1958年年）第一個(gè)人工工合成的蛋蛋白質(zhì)（1965年年）Sanger

胰島素的蛋蛋白質(zhì)工程程研究胰島素是治治療糖尿病病的特效藥藥2、胰島素素每100L發(fā)酵液就能能產(chǎn)生5g胰島素，使使其價(jià)格降降低了30%-50%!提取4-5g胰島素需要要100Kg胰腺胰島素的蛋蛋白質(zhì)工程程研究胰島素在臨臨床應(yīng)用時(shí)時(shí)存在的問(wèn)問(wèn)題1、在正常常生理情況況下胰島素素在體內(nèi)是是不斷地分分泌的，但但不能連續(xù)續(xù)不斷地注注射胰島素素2、皮下注注射胰島素素時(shí)，吸收收得也很慢慢，注射后1.5-2小小時(shí)，體內(nèi)內(nèi)胰島素水水平還未能能達(dá)到高峰峰，這就會(huì)會(huì)導(dǎo)致高血血糖；3-5小時(shí)之之后胰島素素水平仍在在繼續(xù)上升升，這又會(huì)會(huì)導(dǎo)致低血血糖胰島素的蛋蛋白質(zhì)工程程研究胰島素在臨臨床應(yīng)用時(shí)時(shí)存在的問(wèn)問(wèn)題3、糖尿病病病人一般般需要每日日四次注射射給藥胰島素的蛋白白質(zhì)工程研究究蛋白質(zhì)工程技技術(shù)對(duì)胰島素素的改造1970S初初，英國(guó)的Hodgkin等、我國(guó)國(guó)的梁棟材等等，分別用X-射線晶體體衍射法進(jìn)行行了高分辨率率的三維結(jié)構(gòu)構(gòu)分析，胰島島素的蛋白質(zhì)質(zhì)工程研究奠奠定了基礎(chǔ)胰島素的蛋白白質(zhì)工程研究究蛋白質(zhì)工程技技術(shù)對(duì)胰島素素的改造1、速效胰島島素（可快速吸收收的單體胰島島素）2、長(zhǎng)效胰島島素3、高效胰島島素（與受體親和和力增加的胰胰島素突變體體）速效胰島素胰島素吸收慢慢的原因：二聚體、六聚聚體速效胰島素3D分析發(fā)現(xiàn)現(xiàn)：多聚體的的形成與B8、B9、、B12、B13、B16、B23-B28的氨基酸殘基基有關(guān)用蛋白質(zhì)工程程方法在多聚聚體接觸面上上某些氨基酸酸殘基換上帶帶負(fù)電的氨基基酸殘基B鏈Ser9Asp（-）），Thr27Glu（-））由于相同電荷荷互斥，減少少多聚體形成成，