植物組織培養(yǎng)

第九章植物細(xì)胞、組織及器官的超低溫保存

植物種質(zhì)資源是植物育種的基礎(chǔ)，種質(zhì)資源的保存方式有原生境保存和非原生境保存，非原生境保存包括移地保存（種質(zhì)圃或植物園保存）、種質(zhì)（種子）庫保存、離體保存等。其中種質(zhì)資源的離體自20世紀(jì)60年代逐漸得到廣泛應(yīng)用。種質(zhì)資源的離體保存是對(duì)離體培養(yǎng)的小植株、器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體等材料，采用限制生長、延緩或停止其生長的處理使之保存，在需要時(shí)可以重新恢復(fù)其生長，并再生植株的方法。離體保存又分為限制生長保存和超低溫保存。限制生長保存是利用限制離體培養(yǎng)物的生長速度來保存種質(zhì)的方法，是離體保存的常用方法。限制離體培養(yǎng)物生長速度的方法主要有：（1）低溫保存法（2）高滲透壓保存法（3）生長抑制劑保存法（4）降低氧分壓保存法（5）干燥保存法而超低溫保存是將要保存的材料經(jīng)過適當(dāng)處理后，保存在液氮中（-196℃），植物細(xì)胞生長停止，但細(xì)胞活力和形態(tài)發(fā)生潛能得到了保存。

1949年P(guān)olge發(fā)現(xiàn)甘油具有保存特性，標(biāo)志著低溫生物學(xué)的形成；

1980年開始進(jìn)行玻璃化保存，開展超低溫保存研究。動(dòng)物細(xì)胞、組織、胚胎---植物細(xì)胞、組織、器官一、超低溫種質(zhì)保存的發(fā)展歷史：保持細(xì)胞培養(yǎng)物的遺傳穩(wěn)定性；2.長期保存植物的種質(zhì)資源;長期保存農(nóng)作物的優(yōu)良品種及其育種親本材料的種質(zhì)；建立長期保存的莖尖分生組織種質(zhì)庫及無病毒的原種；5.保存實(shí)驗(yàn)材料，防止再培養(yǎng)中遺傳變異。二、超低溫保存的作用及意義

在低于-700C的超低溫條件下，有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止。因此采取適當(dāng)?shù)姆椒▽⑸锊牧辖抵脸蜏兀纯墒股顒?dòng)固定在某一階段而不衰老死亡。當(dāng)以適當(dāng)?shù)姆椒▽龃娴纳锊牧匣謴?fù)至常溫時(shí)，其內(nèi)部的生化反應(yīng)可恢復(fù)正常。三、超低溫保存的原理及理論依據(jù)

所謂冷凍保存，就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-700C的超低溫條件），并在此溫度下對(duì)其長期保存的過程。而復(fù)蘇就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過程。不論是微生物、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進(jìn)行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。

水在低于零度的條件下會(huì)結(jié)冰。如果將細(xì)胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)結(jié)冰，所形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞而引起細(xì)胞死亡。這種因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷。

如果將細(xì)胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低，細(xì)胞外部的水分會(huì)首先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高。如果將細(xì)胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時(shí)間過長，細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子會(huì)受到損壞，細(xì)胞便發(fā)生滲漏，在復(fù)溫時(shí)，大量水分會(huì)因此進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞死亡。這種因保存溶液中溶質(zhì)濃度升高而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為溶質(zhì)損傷或稱溶液損傷。

當(dāng)溫度進(jìn)一步下降，細(xì)胞內(nèi)外都結(jié)冰，產(chǎn)生冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護(hù)劑，則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑容易同溶液中的水分子結(jié)合，從而降低冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，并且通過其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷，細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。在復(fù)蘇時(shí)，一一般以很快的的速度升溫，，1-2分鐘內(nèi)內(nèi)即恢復(fù)到常常溫，細(xì)胞內(nèi)內(nèi)外不會(huì)重新新形成較大的的冰晶，也不不會(huì)暴露在高高濃度的電解解質(zhì)溶液中過過長的時(shí)間，，從而無冰晶晶損傷和溶質(zhì)質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍存的細(xì)胞胞經(jīng)復(fù)蘇后仍仍保持其正常常的結(jié)構(gòu)和功功能。冷凍保保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞胞的冷凍保護(hù)護(hù)效果還與冷凍速率、冷冷凍溫度和復(fù)復(fù)溫速率有關(guān)。而且不不同的冷凍保保護(hù)劑其冷凍凍保護(hù)效果也也不一樣。1.主要儀儀器設(shè)備(1)用于于組織和細(xì)胞胞培養(yǎng)的全套套設(shè)備；(2)普通通電冰箱；(3)-70℃--80℃的低低溫冰箱；(4)程序序降溫器；四、超低溫保保存的基本設(shè)設(shè)備和程序(5)玻璃璃或塑料試管管（5ml或或10m1），封蓋蓋嚴(yán)密，不進(jìn)進(jìn)液氮；(6)液氮氮;(7)光學(xué)學(xué)顯微鏡和紫紫外熒光顯微微鏡；(8)分光光光度計(jì)。2.基本本程序(1)材料料的準(zhǔn)備與選選擇。(2)預(yù)處處理。(3)將材材料裝入試管管，并隨即插插入冰浴中。。(4)加入入0℃預(yù)冷的的冰保護(hù)劑，，在0℃(冰冰浴中)放置置30一45分鐘。(5)降溫溫冰凍。(6)保存存后的化凍：：一般在37—40℃℃溫水浴中快快速化凍。(7)活力力測定,通通常采用TTC法(氯化化三苯四氮唑唑還原法)。。如果是單細(xì)細(xì)胞或原生質(zhì)質(zhì)體，可采用用活性熒光素素染色法，顯顯示活細(xì)胞，，統(tǒng)計(jì)存活率率。(8)再培培養(yǎng)，觀察組組織細(xì)胞恢復(fù)復(fù)生長的速度度、存活率、、植株的再生生能力。(9)遺傳傳性狀的分析析：如植株的的形態(tài)特征、、生長發(fā)育狀狀況、染色體體、同工酶及及抗逆性等。。1．材料的特特性；基因型、抗凍凍性、器官組組織和細(xì)胞年年齡、生理狀狀態(tài)。2．預(yù)處理目的：A.增增加細(xì)胞分分裂和同步化化；B.減少細(xì)細(xì)胞內(nèi)自由水水的含量；C.增強(qiáng)細(xì)細(xì)胞的抗寒性性。五、影響超低低溫保存效果果的主要因素素預(yù)處理方法：：(1)細(xì)胞、、組織繼代培培養(yǎng)中．細(xì)胞胞分裂分化同同步化的調(diào)控控，增加指數(shù)數(shù)生長期細(xì)胞胞。(2)預(yù)培養(yǎng)養(yǎng)，增加培養(yǎng)養(yǎng)基中的糖濃濃度，提高滲滲透壓；或在在預(yù)培養(yǎng)基中中加入誘導(dǎo)抗抗寒力的物質(zhì)質(zhì)或冰凍保護(hù)護(hù)劑，如脫落落酸(ABA)，山梨糖糖醇、脯氨酸酸及二甲基亞亞砜(DMSO)等。(3)低溫鍛鍛煉：如香石石竹莖尖經(jīng)4℃低溫預(yù)處處理14天，，不僅提高了了存活率．而而且分化率從從30％增加加到60％。。3．冰凍保護(hù)護(hù)劑迄今，已經(jīng)報(bào)報(bào)道了多種類類型的冰凍保保護(hù)劑。常用用的是二甲基基亞砜(DMSO)、甘甘油、糖和糖糖醇類物質(zhì)、、氨基酸、多多肽及聚乙二二醇等。但作為冰凍保保護(hù)劑的物質(zhì)質(zhì)應(yīng)該具備以以下特性：（（1）易溶于水水；（2）在適當(dāng)當(dāng)濃度下對(duì)細(xì)細(xì)胞無毒；（3）化凍后容易從從組織細(xì)胞中中去除。冷凍保護(hù)劑的的作用：(1)降低低冰點(diǎn)，促進(jìn)進(jìn)過冷卻和““玻璃態(tài)化””的形成；(2)提高高溶液的粘滯滯性，阻止冰冰晶的生長，，(3)DMSO可使膜膜物質(zhì)分子重重新分布，增增加細(xì)胞膜的的透性，在溫溫度降低時(shí)，，加速細(xì)胞內(nèi)內(nèi)的水流到細(xì)細(xì)胞外結(jié)冰，，防止細(xì)胞內(nèi)內(nèi)結(jié)冰的傷害害；(4)穩(wěn)定定細(xì)胞內(nèi)的大大分子結(jié)構(gòu)，，特別是膜結(jié)結(jié)構(gòu)，阻止低低溫傷害，非非透性保護(hù)劑劑的主要作用用在質(zhì)膜上。。4．降溫冰凍方方法(1)快速速冰凍法：將將材料從0℃℃，或者其他他預(yù)處理溫度度(如木木本植物的冬冬芽在-3℃℃一-10℃℃預(yù)處理20天)直接投投入液氮。其其降溫速度在在每分鐘l000℃以上上。植物體內(nèi)的水水分在降溫冰冰凍過程中，，從-10℃到到-140℃℃是冰晶形成成和增長的危危險(xiǎn)溫度區(qū)，，在-140℃以下，冰冰晶不再增生生。因此，快快速冰凍法成成功的關(guān)鍵在在于，利用超超速冷凍，使使細(xì)胞內(nèi)的水水分迅速通過過冰晶生長的的危險(xiǎn)溫度區(qū)區(qū)，即細(xì)胞內(nèi)內(nèi)的水分還未未來得及形成成冰晶中心，，就降到了-196℃的的安全溫度，，從而避免了了細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰冰的危險(xiǎn)。(2)慢速冰冰凍法：通常常成熟的植物物細(xì)胞都具有有大的液泡，，含有大量水水分。對(duì)大多多數(shù)植物材料料說來，不適適宜采用快速速冰凍法，而而需要在冰凍凍保護(hù)劑存在在的條件下，，采用慢速冰冰凍法。以每分鐘0.1-10℃的降溫速速度(一般1—2℃／分分較好)。降降到—70℃℃左右，隨即浸入液氮氮，或者以此此種速度連續(xù)續(xù)降到一196℃。在這這種降溫速度度下，可以使使細(xì)胞內(nèi)的水水分有充足的的時(shí)間不斷流流到細(xì)胞外結(jié)結(jié)冰，從而使使細(xì)胞內(nèi)的水水分減少到最最低限度，達(dá)達(dá)到良好的脫脫水效應(yīng)，避避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)結(jié)冰。(3)兩步冰冰凍法：這種種方法是慢凍凍法和快凍法法的結(jié)合，或或者說，是一一種改良的慢慢凍法。第第一步是是用慢速降溫溫法從0℃降降到一定的預(yù)預(yù)凍溫度，使使細(xì)胞達(dá)到適適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)性性脫水；第第二步，投入入液氮中迅速速冰凍。(4)逐級(jí)冰冰凍法：此方方法是制備不不同等級(jí)溫度度的冰浴，如如—10℃，，—15℃，，—23℃，，—35℃，，或—40℃℃等。保存材材料經(jīng)冰凍保保護(hù)劑在0℃℃預(yù)處理后，，逐步通過這這些溫度，樣樣品在每級(jí)溫溫度上停留一定時(shí)時(shí)間(4—6分鐘)，然然后浸入液氮氮。5．化凍方法法實(shí)驗(yàn)證據(jù)證實(shí)實(shí)，植物的凍害常常發(fā)生在冰涼涼和化凍兩個(gè)個(gè)過程。因此要使植物物種質(zhì)的超低低溫保存獲得得成功，不僅僅要求有一個(gè)個(gè)合適的降溫溫冰凍程序，，而且還要求求采取合適的的化凍方法，，以避免在化化凍過程中產(chǎn)產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)的的次生結(jié)冰，，并應(yīng)防止在在化凍吸水過過程中水的滲滲透沖擊對(duì)細(xì)細(xì)胞膜體系的的破壞。通常采用快速速化凍方法，，即將液氮保保存后的材料料在37—40℃的溫水水浴中化凍。。因?yàn)槌蜏販乇鶅霾牧匣瘍鰰r(shí)，再次次結(jié)冰的危險(xiǎn)險(xiǎn)溫度區(qū)域大大約是—50℃至—10℃。從理論論上說，借助助迅速的化凍凍速度通過此此溫度區(qū)，從從而避免細(xì)胞胞內(nèi)次生結(jié)冰冰。6．光照對(duì)恢恢復(fù)生長的影影響黑暗條件下有有利于超低溫溫保存培養(yǎng)物物的恢復(fù)生長長。顯示細(xì)跑活力力的TTC法法(氯化三苯苯四氮唑還原原法)，，反映脫氫酶酶活力。2．顯顯示細(xì)細(xì)胞存存活率率的二二醋酸酸酯熒熒光素素(FDA)染染色法法，反反映酯酯酶的的脫脂脂化作作用，，或采采用中中性紅紅染色色法。。3.再再培培養(yǎng)新新鮮培培養(yǎng)基基上培培養(yǎng)。。存在在停滯滯期。。六、超超低溫溫保存存后細(xì)細(xì)胞活活力、、存活活率及及遺傳傳特性性的觀觀測4.遺遺傳傳性狀狀的分分析：：1)細(xì)細(xì)胞全全能性性的保保持：：形態(tài)態(tài)發(fā)生生能力力的表表達(dá)情情況。。2)后后代的的形態(tài)態(tài)特征征及生生長發(fā)發(fā)育狀狀況。。3)后后代染染色體體的分分析。。4)同同工酶酶譜的的分析析。5)特特殊產(chǎn)產(chǎn)物的的分析析。6)抗抗逆性性的分分析。。1.已已進(jìn)進(jìn)行超超低溫溫保存存的植植物：：目前已已超過過30種種植物物成功進(jìn)進(jìn)行了了愈傷傷組織織及懸懸浮細(xì)細(xì)胞超超低溫溫保存存。保保存后后的材材料表表現(xiàn)出出較高高的存存活率率。七、愈愈傷組組織及及懸浮浮培養(yǎng)養(yǎng)細(xì)胞胞的超超低溫溫保存存2．組組織和和細(xì)胞胞超低低溫保保存實(shí)實(shí)驗(yàn)程程序(1)將培培養(yǎng)5一7天的的懸浮浮培養(yǎng)養(yǎng)細(xì)胞胞，或或培養(yǎng)養(yǎng)10一15天天的愈愈傷組組織收集于于保存存試管管中，，每管管0.5-1.0ml。。(2)將盛盛有材材料的的試管管插入冰冰浴中中，待溫度度平衡衡后，，加入0℃預(yù)預(yù)冷的的冰凍凍保護(hù)護(hù)劑(10％DMSO+0.5mo1／L山山梨糖糖醇)，使保護(hù)護(hù)劑稍稍淹過過保存存材料料。在在0℃℃放置置30分鐘鐘。(3)以1℃／／分的的降溫溫速度度從0℃降降到-10℃，輕輕輕搖動(dòng)動(dòng)試管管，使使試管管內(nèi)的的溶液液結(jié)冰冰。停停留15－－20分鐘鐘。然然后以以同樣樣降溫溫進(jìn)度度降到到-30℃℃－-40℃，，停留留2小小時(shí)，，然后后浸入入液氮氮中。。(4)在液液氮中中貯存存一定定時(shí)期期后，，取出出材料料在37——40℃溫溫水浴浴迅速速化凍凍，化凍后后立即即轉(zhuǎn)移移到20℃℃水浴浴中。。(5)化凍凍后，，用含3％％蔗糖糖的液液體培培養(yǎng)基基洗滌滌3次次，為減輕輕和避避免滲滲透沖沖擊的的傷害害，培培養(yǎng)液液應(yīng)逐逐步加加入。。(6)洗滌滌后立立即轉(zhuǎn)移到到新鮮鮮培養(yǎng)養(yǎng)基上上進(jìn)行行再培培養(yǎng)：或者者不經(jīng)經(jīng)洗滌滌，直直接轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到到半固固體培培養(yǎng)基基上，，或漂漂浮于于液體體培養(yǎng)養(yǎng)基的的濾紙紙上培培養(yǎng)。。先置置于黑黑暗條條件下下培養(yǎng)養(yǎng)15—30天天，然然后轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到到光照照下培培養(yǎng)。。(7)待恢恢復(fù)生生長后后，統(tǒng)計(jì)存存活率率。此外，，在化化凍洗洗滌后后，可可采TTC法和和FDA熒熒光染染色法法觀測細(xì)細(xì)胞的的活力力和存存活率率。(8)當(dāng)愈愈傷組組織長長到良良好狀狀態(tài)時(shí)時(shí)，轉(zhuǎn)移到到分化化培養(yǎng)養(yǎng)基上上，檢檢驗(yàn)形形態(tài)發(fā)發(fā)生能能力的保持持情況況。(9)植株株形態(tài)特特征、、生長長發(fā)育育及遺遺傳性性狀的觀察察和分分析．．1、莖莖尖超超低溫溫保存存植物物種類類：八、芽芽及及莖尖尖分生生組織織的超超低溫溫保存存2.莖莖尖分分生組組織的的超低低溫保保存程程序：：（1））種子消消毒滅滅菌，種子子經(jīng)70％％酒精精迅速速漂洗洗，10％％漂白白粉溶溶液消消毒20分分鐘，，無菌菌水洗洗滌4次．．(2)在無菌條條件下下播種種于具潤潤濕濾濾紙的的滅菌菌培養(yǎng)養(yǎng)瓶或或培養(yǎng)養(yǎng)皿內(nèi)內(nèi)。置置于25——28℃培培養(yǎng)箱箱中黑黑暗培培養(yǎng)。。(3)萌發(fā)發(fā)生長4—5天后后，在在無菌菌條件件下切切取莖莖尖的的分生生組織織，0.3一0.5mm長，第1對(duì)葉葉原基基。在在實(shí)體體解副副鏡下下進(jìn)行行操作作。(4)將切切取的的莖尖分分生組組織接接種于于固體體B5培養(yǎng)養(yǎng)基上上，內(nèi)內(nèi)含0.5pmol／LBA及及5%DMSO，光照照16小時(shí)時(shí)，溫溫度20℃℃／15℃℃預(yù)培培養(yǎng)48小小時(shí)。。(5)預(yù)培培養(yǎng)后后，將將培養(yǎng)養(yǎng)瓶浸浸入冰浴中中2小小時(shí)。(6)將莖莖尖分分生組組織轉(zhuǎn)移到到在冰冰浴中中預(yù)冷冷的具具有1m1液體體B5培養(yǎng)養(yǎng)基的的離心心管中。(7)逐步步加入等等體積積的預(yù)預(yù)冷的的10％DMSO，，在30分分鐘內(nèi)內(nèi)加完完，使使DMSO的最最終濃濃度為為5%，然后再再放置置10一30分分鐘．．(8)密封封離心心管口口，以每分分鐘降降低0.6℃的的速度度慢速速降溫溫到——40℃，，然后后浸入入液氮氮中(—196℃)。(9)在液液氮中中貯存存—定定時(shí)期期后，，取出材材料在在27℃水水浴中中迅速速化凍凍。化凍凍后．．立即即將試試管轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到到冰浴浴中．．(10)用用等體體積B5培培養(yǎng)基基在30分分鐘鐘內(nèi)內(nèi)，，分分6次次逐逐步步加加入入試試管管中中。。(11)吸吸去去混混合合液液，，并并用用B5培培養(yǎng)養(yǎng)基基洗洗滌滌4次次。。然然后后將將莖尖尖分分生生組組織織轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移到到固固體體B5分分化化培培養(yǎng)養(yǎng)基基上。。3周周后后可可分分化化成成苗苗。。植植株株的的再再生生率率達(dá)達(dá)70％％以以上上，，已已有有的的試試驗(yàn)驗(yàn)表表明明，，貯貯存存2年年多多仍仍能能存存活活。。Sakai(1990)和和Yamada(1991)建建立立了了一一種種莖莖尖尖分分生生組組織織的的超超低低溫溫保保存存簡簡便便方方法法，，該該技技術(shù)術(shù)的的關(guān)關(guān)鍵鍵是是，，在冰冰凍凍前前，，用用高高濃濃度度的的冰冰凍凍保保護(hù)護(hù)劑劑使使保保存存材材料料脫脫水水，，以以致致不不需需要要慢慢速速程程序序降降溫溫，，從從室室溫溫直直接接浸浸入入液液氯氯，，即可可獲獲得得很很高高的的存存活活率率。。保存存程程序序：：(1)從從試試管管苗苗中中切切取取莖莖尖尖分分生生組組織織。。(2)在在含含1．．2mo1／／L山山梨梨糖糖醇醇的的B5培培養(yǎng)養(yǎng)基基上上4℃℃預(yù)預(yù)培培養(yǎng)養(yǎng)2天天。。(3)將將預(yù)預(yù)培培養(yǎng)養(yǎng)后后分分生生組組織織放放入入試試管管，，然后后加加入入高高濃濃度度的的冰冰凍凍保保護(hù)護(hù)劑劑。。在在含含0。。4mo1／／L蔗蔗糖糖的的B5培培養(yǎng)養(yǎng)基基中中溶溶解解30％％(w／／v)甘甘油油，，35％％(W／／v)乙乙二二醇醇和和15％％(w／／V)DMSO，，在在25℃℃停停留留5分分鐘鐘，，或或者者在在0℃℃停停留留15分分鐘鐘，，期期間間更更換換2次次溶溶液液。。(4)直直接接浸浸入入液液氮氮保保存存。。(5)貯貯存存一一定定時(shí)時(shí)間間后后，，在25℃℃水水浴浴中中快快速速化化凍凍，，為280℃℃／／分分。。(6)化化凍凍后后，，倒倒出出保保護(hù)護(hù)劑劑，，將材材料料放放入入含含1.2moI／／L蔗蔗糖糖的的B5培培養(yǎng)養(yǎng)基基中中，，25℃℃10分分鐘鐘。。(7)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移到到固固體體B5培培養(yǎng)養(yǎng)基基上上的的滅滅菌菌濾濾紙紙上上。。1天天后后，，再再轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移到到新新鮮鮮的的同同樣樣培培養(yǎng)養(yǎng)基基濾濾紙紙上上，，25℃℃、、l4小小時(shí)時(shí)光光照照下下培培養(yǎng)養(yǎng)。。3天天內(nèi)內(nèi)恢恢復(fù)復(fù)生生長長，，3周周后后產(chǎn)產(chǎn)生生成成苗苗，，成成苗苗率率(存存活活率率)達(dá)達(dá)80——90％％。。該方方法法也也適適用用于于愈愈傷傷組組織織及及懸懸浮浮培培養(yǎng)養(yǎng)細(xì)細(xì)胞胞。。2010年年12月月14日日9、靜夜四無無鄰，荒居居舊業(yè)貧。。。12月-2212月-22Sunday,December25,202210、雨中黃葉葉樹，燈下下白頭人。。。01:12:0801:12:0801:1212/25/20221:12:08AM11、以我獨(dú)沈沈久，愧君君相見頻。。。12月-2201:12:0801:12Dec-2225-Dec-2212、故人江江海別，，幾度隔隔山川。。。01:12:0801:12:0801:12Sunday,December25,202213、乍見翻翻疑夢，，相悲各各問年。。。12月-2212月-2201:12:0801:12:08December25,202214、他鄉(xiāng)生生白發(fā)，，舊國見見青山。。。25十二月月20221:12:08上午01:12:0812月-2215、比不了得就就不比，得不不到的就不要要。。。十二月221:12上上午12月-2201:12December25,202216、行動(dòng)動(dòng)出成成果，，工作作出財(cái)財(cái)富。。。2022/12/251:12:0801:12:0825December202217、做前前，能能夠環(huán)環(huán)視四四周；；做時(shí)時(shí)，你你只能能或者者最好好沿著著以腳腳為起起點(diǎn)的的射線線向前前。。。1:12:08上上午1:12上上午午01:12:0812月月-229、沒有有失敗敗，只只有暫暫時(shí)停停止成成功?。?。12月月-2212月月-22Sunday,December25,202210、很很多多事事情情努努力力了了未未必必有有結(jié)結(jié)果果，，但但是是不不努努力力卻卻什什么么改改變變也也沒沒有有。。。。01:12:0801:12:0801:1212/25/20221:12:08AM11、成功就就是日復(fù)復(fù)一日那那一點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)小小努努力的積積累。。。12月-2201:12:0801:12Dec-2225-Dec-2212、世間成事，，不求其絕對(duì)對(duì)圓滿，留一一份不足，可可得無限完美美。。01:12:0801:12:0801:12Sunday,December25,202213、不知香積寺寺，數(shù)里入云云峰。。12月-2212月-2201:12:0801:12:08December25,202214、意志堅(jiān)強(qiáng)強(qiáng)的人能把把世界放在在手中像泥泥塊一樣任任意揉捏。。25十二二月20221:12:08上上午01:12:0812月-2215、楚塞三湘湘接，荊門門九派通。。。。十二月221:12上上午12月-2201:12