真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略課件

微生物基因工程

李剛副教授微生物基因工程教學(xué)內(nèi)容一、PCR引物的設(shè)計與實驗操作技巧；

二、基因組文庫的建立與篩選；

三、定向進化技術(shù)在微生物酶制劑研究中的應(yīng)用；

四、原核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略；五、真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略。教學(xué)內(nèi)容一、PCR引物的設(shè)計與實驗操作技巧；

二、基因組文庫五、真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略

真核生物表達(dá)系統(tǒng)主要包括：

酵母表達(dá)系統(tǒng)、桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、

轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)、

杜氏鹽藻生物反應(yīng)器等五種表達(dá)系統(tǒng)。其中應(yīng)用最廣泛的是酵母表達(dá)系統(tǒng)。五、真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略真核生物表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點真核表達(dá)系統(tǒng)具有翻譯后的加工修飾體系,表達(dá)的外源蛋白更接近于天然蛋白質(zhì)。真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點真核表達(dá)系統(tǒng)具有翻譯后的加工修飾體系,表達(dá)酵母表達(dá)系統(tǒng)主要包括釀酒酵母、裂殖酵母、克魯維酵母、甲醇酵母等表達(dá)系統(tǒng)。其中甲醇酵母基因表達(dá)系統(tǒng)是一種最近發(fā)展迅速的外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)，也是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)。主要有H.polymorpha、CandidaBodinii、PichiaPastoris三種,其中PichiaPastoris作為基因表達(dá)系統(tǒng)使用得最多、最廣泛。由于它具有無可匹敵的高表達(dá)特性,已被認(rèn)為是最具有發(fā)展前景的生產(chǎn)蛋白質(zhì)的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。酵母表達(dá)系統(tǒng)主要包括釀酒酵母、裂殖酵母、克魯維酵母、甲醇酵母酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點①酵母長期廣泛應(yīng)用于釀酒和食品工業(yè),不會產(chǎn)生毒素,安全可靠;②酵母是真核生物,能進行一些表達(dá)產(chǎn)物的加工,有利于保持生物產(chǎn)品的活性和穩(wěn)定性;③外源基因在酵母中能分泌表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物分泌至胞外不僅有利于純化,而且避免了產(chǎn)物在胞內(nèi)大量蓄積對細(xì)胞的不利影響;④遺傳背景清楚,容易進行遺傳操作;⑤較為完善的表達(dá)控制系統(tǒng),如PMA1和PDR5等強啟動子可以介導(dǎo)目的蛋白高水平表達(dá),表達(dá)蛋白的豐度可以達(dá)到膜蛋白的10%;酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點①酵母長期廣泛應(yīng)用于釀酒和食品工業(yè),不會酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點此外,采用誘導(dǎo)表達(dá)啟動子可以在時間上嚴(yán)格控制目的蛋白的表達(dá),如GAL1-10(半乳糖誘導(dǎo))、PH05(胞外無機磷誘導(dǎo))和HSE(37℃溫度誘導(dǎo));⑥生長繁殖迅速,培養(yǎng)周期短,工藝簡單,生產(chǎn)成本低。酵母菌用于真核基因的表達(dá)、分析,既具有原核表達(dá)系統(tǒng)生長迅速、操作簡單、價格便宜等優(yōu)點,又具有類似哺乳動物細(xì)胞的翻譯后修飾過程,因而特別適用于大量生產(chǎn)真核重組蛋白,正是由于有這些優(yōu)點,使酵母功能基因組的研究得以走在生物功能基因組研究的前列,是應(yīng)用最為普遍的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點此外,采用誘導(dǎo)表達(dá)啟動子可以在時間上嚴(yán)格桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前國內(nèi)外十分推崇的真核表達(dá)系統(tǒng)。利用桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中多角體蛋白的強啟動子構(gòu)建的表達(dá)載體,可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表達(dá)。它具有真核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工功能,如二硫鍵的形成、糖基化及磷酸化等,使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白;其最高表達(dá)量可達(dá)昆蟲細(xì)胞蛋白總量的50%;可表達(dá)非常大的外源性基因(～200kD);具有在同一個感染昆蟲細(xì)胞內(nèi)同時表達(dá)多個外源基因的能力;對脊椎動物是安全的。由于病毒多角體蛋白在病毒總蛋白中的含量非常高,至今已有很多外源基因在此蛋白的強大啟動子作用下獲得高效表達(dá)。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前國內(nèi)外十分推崇的真哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與其他的真核表達(dá)體系相比,哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的蛋白與天然蛋白的結(jié)構(gòu)、糖基化類型和方式幾乎相同且能正確組裝成多亞基蛋白,但成本較高。近年來,研究者們主要通過改造宿主細(xì)胞和基因?qū)敕椒▉硖岣咄庠吹鞍椎谋磉_(dá)效率。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)常用的宿主細(xì)胞有CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3等。將外源基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞內(nèi)的方法,主要有化學(xué)法、電穿孔法、基因槍法和哺乳動物病毒載體系統(tǒng)等。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與其他的真核表達(dá)體系相比,哺乳動物細(xì)胞表轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)

轉(zhuǎn)基因植物是指利用一定的手段將外源性或內(nèi)源性的基因?qū)氲街参矬w內(nèi),使植物的遺傳性狀改變而產(chǎn)生的植物體。轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器已在藥物蛋白的生產(chǎn)中被廣泛使用,成功表達(dá)的藥用蛋白質(zhì)和多肽有:人的細(xì)胞因子、表皮生長因子、促紅細(xì)胞生成素、干擾素、生長激素、單克隆抗體等.煙草、馬鈴薯、大豆、香蕉、萵苣、羽扇豆等作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服疫苗,也得到了人們的廣泛關(guān)注。轉(zhuǎn)基因植物疫苗和藥用蛋白的表達(dá)系統(tǒng)主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、植物病毒瞬時高效表達(dá)載體和植物葉綠體高效表達(dá)系統(tǒng)。在研究成功的轉(zhuǎn)基因植物藥用蛋白中,80%是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)形成的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)。在重組藥物的多種表達(dá)體系中,轉(zhuǎn)基因植物是最經(jīng)濟的。同一種重組蛋白在植物中的生產(chǎn)成本是微生物發(fā)酵體系的2%-10%,是哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)的0.1%。轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)

轉(zhuǎn)基因植物是指利用一定的手段將外源性或杜氏鹽藻生物反應(yīng)器

杜氏鹽藻是一種單細(xì)胞真核藻類,沒有細(xì)胞壁，原生質(zhì)外僅有一層糖蛋白和神經(jīng)氨酸組成的外膜，具有一個杯狀、大型的葉綠體,體積約占細(xì)胞的一半。鹽藻是極其耐鹽的，可以在0.05-5mol/l氯化鈉的極端環(huán)境中生存。鹽藻屬于光和自養(yǎng)生物,能利用簡單的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，富含β胡蘿卜素、甘油、蛋白質(zhì)等。鹽藻作為新型的真核生物反應(yīng)器，除了具有轉(zhuǎn)錄和翻譯后的加工能力外，還具有經(jīng)濟廉價、簡單有效、安全可靠等特點。由于它能在高鹽條件下培養(yǎng)，所以不會污染其他的微生物，這點是哺乳動物細(xì)胞所不及的。外源基因在鹽藻中的表達(dá)主要是集中在cat、bar、gus和egfp等報告基因上,大多為瞬時表達(dá)。目前,只有乙肝表面抗原(HbsAg)和篩選標(biāo)記bar基因能夠在鹽藻中穩(wěn)定表達(dá)。鹽藻作為一種新型的生物反應(yīng)器,目前還不能真正生產(chǎn)外源性物質(zhì)。研究者們正從強啟動子的篩選、高效轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建、最佳轉(zhuǎn)化方法的確立等幾方面努力，目前已經(jīng)取得了一定的成果。杜氏鹽藻生物反應(yīng)器

杜氏鹽藻是一種單細(xì)胞真核藻類,沒有細(xì)胞壁巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)畢赤酵母能夠成功表達(dá)出多種外源蛋白,是由于畢赤酵母具有以下獨特的優(yōu)點:(1)能夠快速繁殖和進行高密度培養(yǎng);(2)具有強啟動子-乙醇氧化酶(AOX1)基因啟動子,并且能夠嚴(yán)格調(diào)控外源基因的表達(dá);(3)可以對外源蛋白進行類似真核的加工折疊和翻譯后修飾,產(chǎn)物從而具有天然蛋白的活性;(4)表達(dá)產(chǎn)量高,雜蛋白少,并且能夠胞外分泌表達(dá),容易分離提純;(5)培養(yǎng)條件簡單,成本低。畢赤酵母與最早研究的釀酒酵母相比,能夠高密度培養(yǎng),容易實現(xiàn)工業(yè)化,并且不存在釀酒酵母的過度糖基化問題,也不易產(chǎn)生免疫原性問題。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)畢赤酵母能夠成功表達(dá)出多種外源蛋白,是巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)

巴斯德畢赤酵母菌株：一般用于外源基因表達(dá)的Pichiapastoris菌株有Y211430,M2C10023,GS115,X-33，KM71,SMD1168等.根據(jù)利用甲醇的能力,可將巴斯德畢赤酵母分為3型:①Mut+型為甲醇快利用型,此型畢赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,絕大多數(shù)畢赤酵母為Mut+

表型。②Muts

型,此型畢赤酵母菌(如KM71)細(xì)胞AOX2基因編碼的醇氧化酶可產(chǎn)生15%AOX活性,為甲醇慢利用型。③Mut-型(如M2G10023),此型畢赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,為甲醇不利用型。研究發(fā)現(xiàn),蛋白酶缺陷型畢赤酵母,如SMD1163,SMD1165和SMD1168可有效降低外源目的蛋白的酶解。一般說來,蛋白胞內(nèi)表達(dá)時,優(yōu)先考慮用Muts

表型,對于分泌表達(dá),Mut+和Muts都可使用。甲醇慢利用型有時比Mut+型菌株能夠達(dá)到更高的表達(dá)量。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)

巴斯德畢赤酵母菌株：真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略Pichiapastoris表達(dá)載體

畢赤酵母表達(dá)載體包括自我復(fù)制型的游離載體和整合型載體，但以整合型載體為主。常見的整合載體又分為胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)2類。胞內(nèi)表達(dá)的載體有pPIC3、pPIC3K、pPIC3.5K、pHILD2、pPICZA、pPICZAB和pPICZAC等；分泌表達(dá)的載體有pPIC9、pPIC9K、pACO815、pPICZαA（B、C）和pHILS1等。通用的整合載體多含有AOX1啟動子，有一個外源基因表達(dá)框、多克隆位點（MCS）和一個從AOX1基因上拷貝下來的終止序列（TT），作為篩選標(biāo)記的his4

基因和在細(xì)菌中進行復(fù)制起始點和選擇標(biāo)記（如ColE1復(fù)制起始點和抗氨芐青霉素基因）以及AOX13’端的非編碼區(qū)序列，使外源基因能以同源重組的方式整合到染色體的AOX1部位。Pichiapastoris表達(dá)載體

畢赤酵母表達(dá)載體包括巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)與功能巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)與功能畢赤酵母表達(dá)載體的啟動子

Pichiapastoris含有兩個基因編碼醇氧化酶:AOX1和AOX2,二者序列有92%同源性,但是AOX1表達(dá)水平高于AOX2。AOX1啟動子的表達(dá)受甲醇嚴(yán)格調(diào)控。以甲醇為碳源生長時,約5%的mRNA由AOX1基因轉(zhuǎn)錄。PGAP(三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子)是最近在畢赤酵母中克隆到的一個組成型啟動子,GAP啟動子不需甲醇誘導(dǎo),發(fā)酵工藝更為簡單.。Vassilen利用GAP啟動子表達(dá)乙肝表面抗原獲得高表達(dá),Genzyme也利用GAP啟動子表達(dá)人幾丁質(zhì)酶,不僅獲得高表達(dá),而且還可以避免蛋白酶水解。此外，Phongdara在Hansenulapolymorpha克隆到酸性磷酸酶(pHO1)基因啟動子，這些啟動子豐富了甲醇酵母對啟動子的選擇。畢赤酵母表達(dá)載體的啟動子

Pichiapastoris含畢赤酵母表達(dá)載體上的選擇標(biāo)記

選擇標(biāo)記一般為對應(yīng)于營養(yǎng)缺陷型受體的野生型基因,常用his4,也可用來源于釀酒酵母的arg4基因和suc2基因.kanr基因和Shbler基因（Zeocin抗性基因）也能夠作為細(xì)菌和酵母菌的選擇標(biāo)記，并且攜帶這兩個標(biāo)記的表達(dá)載體較其他表達(dá)載體更易于篩選。畢赤酵母表達(dá)載體上的選擇標(biāo)記

選擇標(biāo)記一般為對應(yīng)于營養(yǎng)缺陷信號肽序列可供畢赤酵母選擇的信號肽有外源蛋白自身的信號肽和酵母本身的信號肽.有些蛋白的自身信號肽不能被畢赤酵母有效利用,可試用甲醇酵母信號肽。目前可供選擇的酵母信號肽有2交配因子的前導(dǎo)肽序列、酸性磷酸酶信號肽和蔗糖酶信號肽等。其中釀酒酵母

2交配因子前導(dǎo)肽序列的使用最為廣泛。酶切割位點周圍氨基酸序列及外源蛋白的3級結(jié)構(gòu)可以影響信號肽的加工效率。信號肽序列可供畢赤酵母選擇的信號肽有外源蛋白自身的信號肽和酵畢赤酵母表達(dá)載體的種類

Invitrogen公司開發(fā)出了若干系列的表達(dá)載體可供選擇。當(dāng)前常用的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體可分為2類.①胞內(nèi)表達(dá)載體。如pHIL2D2,pAO815,pPIC3K,PICZ,pHWO10,pGAPZ.②分泌表達(dá)載體。如pHIL2S1,pPIC9K,pPICZα,pGAPZα。目前主要采用酵母內(nèi)源性的信號肽來引導(dǎo)外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分泌,常用α2因子信號肽。許多蛋白的正確構(gòu)象和翻譯后加工(如糖基化等)都是在分泌途中完成的。畢赤酵母表達(dá)載體的種類

Invitrogen公司開發(fā)出了若真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略外源基因的轉(zhuǎn)化及整合

將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母中誘導(dǎo)表達(dá)，其常用的轉(zhuǎn)化方法是電轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體法,其中電轉(zhuǎn)化法最為方便,轉(zhuǎn)化效率最高,最容易產(chǎn)生多拷貝整合.Zeocin抑制細(xì)胞壁的形成,因此pPICZ系列不能使用原生質(zhì)體法進行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化時,載體DNA必須切成線狀才能與染色體進行同源重組,將整個載體連同外源基因整入宿主染色體.通常有以下幾種整合方式:①雙位點互換。發(fā)生在染色體AOX1位點和表達(dá)質(zhì)粒中的PAOX1及轉(zhuǎn)錄終止區(qū),產(chǎn)生的表達(dá)菌的表型為His+Mut-。②AOX1單位點互換。發(fā)生在染色體和表達(dá)質(zhì)粒的AOX1區(qū)。產(chǎn)生的表型是His+Mut+。③His單位點置換。發(fā)生在染色體His位點和表達(dá)質(zhì)粒的His位點,使得1個或多個表達(dá)單位插入在His位點,產(chǎn)生的表型也是His+Mut+。巴斯德畢赤酵母載體在宿主染色體上大多為單拷貝整合,由于PAOX1的強啟動性和整合后的穩(wěn)定性,所以單拷貝也能獲得較高的產(chǎn)量。外源基因的轉(zhuǎn)化及整合

將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母中重組蛋白翻譯后修飾

Pichiapastoris能進行與高等真核細(xì)胞相似的許多翻譯后修飾,包括二硫鍵形成、信號序列加工、折疊、O-連接和N-連接糖基化等。巴斯德畢赤酵母對分泌的外源蛋白的糖基化已成為研究的熱點。巴斯德畢赤酵母對外源目的蛋白的糖基化作用具有2個主要特征:①極少出現(xiàn)過度糖基化。一般情況下畢赤酵母能產(chǎn)生較釀酒酵母明顯要短的高甘露糖型寡糖鏈,且較均一,長度在8～14個之間,使產(chǎn)物更加穩(wěn)定。②糖鏈中不含具有潛在致敏作用的-1,3-甘露糖。重組蛋白翻譯后修飾

Pichiapastoris能進行與影響外源基因表達(dá)的因素

影響外源基因在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)的因素主要包括:外源基因自身的特性、外源基因整合的拷貝數(shù)、外源基因在染色體上的整合位點和方式、宿主菌的甲醇利用表型、分泌信號、產(chǎn)物穩(wěn)定性、翻譯后修飾以及培養(yǎng)條件等。影響外源基因表達(dá)的因素

影響外源基因在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)外源基因自身的特性

外源基因的特性是決定表達(dá)成敗的首要因素。特定的（A+T）富含區(qū)可作為多腺苷酸或轉(zhuǎn)錄終止信號，導(dǎo)致僅產(chǎn)生低水平或截短的mRNA。某些稀有密碼子，尤其是稀有密碼子密集區(qū)往往成為制約翻譯速率的因素。在某些情況下，可通過定點突變?nèi)コ墒烨敖K止結(jié)構(gòu)域和替換稀有密碼子。但在更極端的情況下，即基因中存在大量（A+T）富含區(qū)和稀有密碼子密集區(qū)時，往往需要進行全基因合成，使編碼序列符合畢赤酵母偏愛性密碼子用法和更高的（G+C）含量。外源基因自身的特性

外源基因的特性是決定表達(dá)成敗的首要因素。載體的構(gòu)建通過選擇添加前導(dǎo)肽,外源蛋白在畢赤酵母中可以胞內(nèi)表達(dá)也可以分泌到胞外。由于有些蛋白在胞內(nèi)表達(dá)會產(chǎn)生細(xì)胞毒性,或者因為產(chǎn)物濃度高引發(fā)細(xì)胞一些自發(fā)的調(diào)節(jié)抑制表達(dá),所以一般先嘗試胞外分泌表達(dá),同時可以減少下游的純化工序。如果采用胞外表達(dá)便需要在載體中使用信號肽。一般來說使用的都是來自釀酒酵母的α因子信號序列,含α因子的載體已經(jīng)實現(xiàn)商品化,很多外源蛋白能夠通過α因子成功胞外分泌表達(dá)。目前研究發(fā)現(xiàn)α因子信號序列的分泌能力在很多例子中比其他前導(dǎo)肽強,而且其他一些前導(dǎo)肽(如PHO1)只能分泌到膜周質(zhì),存在缺陷,而外源基因自帶的信號肽一般在畢赤酵母中表達(dá)效率很低甚至不分泌。載體的構(gòu)建通過選擇添加前導(dǎo)肽,外源蛋白在畢赤酵母中可以胞內(nèi)表載體的構(gòu)建但如果使用α因子時蛋白得不到表達(dá),應(yīng)裂菌后再次檢測目的蛋白。如果是前導(dǎo)肽的問題,就需要更換信號肽,如改用殺傷毒素的信號序列、菊粉酶的信號肽(ISP)序列。暫時沒有證據(jù)表明哪種信號肽對于具體哪一種蛋白的表達(dá)是最有效的,只能通過實驗來確定最后使用的信號肽。α因子信號序列的切割位點Kex2在AGA和GAG之間,如果表達(dá)的蛋白要求維持N端的天然序列,需要在AGA后面直接插入目的基因。有報道表明AGA后面的蛋白序列會對α因子信號序列的切割有影響,并且某些表達(dá)蛋白也會保護自身免受某些切割反應(yīng),通常當(dāng)Kex2位點后面的氨基酸殘基比較小時,對切割的影響不大。還有報導(dǎo)在目的產(chǎn)物前面加入全前導(dǎo)肽序列(pre-pro)提高了切割效率,從而提高分泌表達(dá)的產(chǎn)量。載體的構(gòu)建但如果使用α因子時蛋白得不到表達(dá),應(yīng)裂菌后再次檢測外源基因在染色體上的整合位點

巴斯德畢赤酵母中的穩(wěn)定高效表達(dá)主要通過整合性載體實現(xiàn)。整合性載體的表達(dá)盒穩(wěn)定,可以多位點整合而獲得多拷貝以及進行不同整合方式。AOX1和組氨酸脫氫酶(HIS4)基因位點都已被成功用于表達(dá)外源蛋白.Sreekrishna等認(rèn)為,由于表達(dá)框中his4染色體突變拷貝與完好的his4基因能夠發(fā)生基因轉(zhuǎn)換,所以首選Aox1位點作為整合位點。外源基因在染色體上的整合位點

巴斯德畢赤酵母中的穩(wěn)定高效表宿主菌的甲醇利用表型

原則上,如果是胞內(nèi)表達(dá),應(yīng)盡量用Mut-細(xì)胞,這樣得到的蛋白產(chǎn)物中醇氧化酶蛋白量較少而蛋白純化更易進行.。現(xiàn)在無需甲醇誘導(dǎo)的組成性表達(dá)載體pGAPZ和pGAPZα已經(jīng)構(gòu)建成功,它們常能生產(chǎn)比誘導(dǎo)型載體pPICZ和pPICZα更高的外源蛋白。Doring等研究表明,在生產(chǎn)哺乳動物膜轉(zhuǎn)運蛋白時,pGAP比pAOX1更理想。宿主菌的甲醇利用表型

原則上,如果是胞內(nèi)表達(dá),應(yīng)盡量用Mut多拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選

通常增多轉(zhuǎn)化子攜帶外源基因的拷貝數(shù)能夠在一定程度上提高表達(dá)量,因此篩選出多拷貝轉(zhuǎn)化子來提高產(chǎn)量是一個簡單容易實施的策略。常用的方法是使用帶有抗性標(biāo)記的載體,通過工程菌對抗生素的耐受力的不同來進行多拷貝篩選,耐受抗生素濃度越高意味攜帶的拷貝越多。商業(yè)化的抗性標(biāo)記有卡那霉素抗性基因(在酵母中耐受G418),細(xì)菌shble基因(在酵母中耐受Zeocin)。此外還可以使用攜帶多拷貝表達(dá)盒的載體進行轉(zhuǎn)化來獲得多拷貝轉(zhuǎn)化子。國外也有報導(dǎo)在大腸桿菌引入轉(zhuǎn)座子,在大腸桿菌階段利用抗生素濃度篩選攜帶多拷貝目的基因的質(zhì)粒。然而也有不少實驗表明,拷貝數(shù)越多并不一定意味表達(dá)量越大,如果要確定多拷貝策略對提高特定目的基因產(chǎn)量是否有效,需要同時篩選出單拷貝載體與多拷貝載體并對兩者進行產(chǎn)量對比才能得到影響結(jié)果。通常采取利用酵母轉(zhuǎn)化子耐受的最高抗生素濃度的方法快速粗略判定拷貝的數(shù)目。多拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選

通常增多轉(zhuǎn)化子攜帶外源基因的拷貝數(shù)能夠在基因劑量

一般來說,高拷貝整合可以提高表達(dá)量,如Jeffrey等發(fā)現(xiàn),重組CD40L的最高產(chǎn)量是在有8個以上拷貝的菌株中獲得。但許多實例表明,含單拷貝表達(dá)框的宿主菌足以得到最佳產(chǎn)量。個別情況下拷貝數(shù)增加對產(chǎn)量也會產(chǎn)生負(fù)效應(yīng),原因可能在于過高表達(dá)會對分泌途徑產(chǎn)生負(fù)反饋抑制。因此,高表達(dá)菌株的篩選只應(yīng)以表達(dá)的蛋白量為唯一標(biāo)準(zhǔn),基因劑量與表達(dá)水平的關(guān)系取決于特定的外源蛋白?；騽┝?/p>

一般來說,高拷貝整合可以提高表達(dá)量,如Jeffr分泌信號不適合的信號肽可導(dǎo)致信號肽加工不完全,或者蛋白分泌水平低,甚至不能分泌。嘗試不同的信號肽,對信號肽進行突變改造或人工全合成信號肽等策略可用于實現(xiàn)信號肽正確加工和提高分泌水平。.韋宇拓等利用菊粉酶的信號肽序列來構(gòu)建巴斯德畢赤酵母分泌載體并表達(dá)了B2葡聚糖酶,結(jié)果表明ISP信號肽序列分泌效率不低于利用α因子信號肽的表達(dá)載體pPIC9K。Singh等通過定向缺失誘變導(dǎo)致了含有天然N端的成熟干擾素的正確釋放,可以成為解決這一問題的一種好方法。分泌信號培養(yǎng)條件的優(yōu)化

畢赤酵母可以通過不同整合方式得到三個表型,其中Mut+能夠快速利用甲醇,MutS利用得慢,Mut-不能利用甲醇生長。表型的選擇一般由需要表達(dá)的蛋白而決定。由于畢赤酵母可以高密度培養(yǎng),外源蛋白對酵母沒有特別影響時通常酵母密度越大蛋白分泌量越大,因此一般使用Mut+型的轉(zhuǎn)化子,這樣在甲醇的誘導(dǎo)下也能利用甲醇來增殖。也有個別例子是MutS型的蛋白分泌量較大,這可能是由于MutS

型在誘導(dǎo)階段長得慢些,蛋白反而能夠正確折疊加工,也有些是因為外源蛋白有細(xì)胞毒性,濃度高會對畢赤酵母生長有不良影響,產(chǎn)生反饋抑制。誘導(dǎo)表達(dá)時甲醇的用量為發(fā)酵液總體積的0.5%～3%之間,甲醇濃度太高將會產(chǎn)生毒性?？梢圆扇∫欢〞r間內(nèi)補加甲醇的措施,彌補消耗掉的甲醇。大量的資料表明誘導(dǎo)時間在3d～5d之間最好,時間再長對蛋白的表達(dá)通常沒有什么幫助,因為前期分泌出來的蛋白有被降解的可能。培養(yǎng)條件的優(yōu)化

畢赤酵母可以通過不同整合方式得到三個表型,培養(yǎng)條件的優(yōu)化

畢赤酵母表達(dá)外源產(chǎn)物最合適pH通常是3.0～8.0，溫度在28℃～30℃之間,并且需要較快的搖瓶速度提供較多氧氣和傳遞發(fā)酵產(chǎn)生的熱量,同時接種量也需要控制在一定的范圍。雖然酵母的菌體密度越大越好,表達(dá)量也相應(yīng)的有一定提高,這也是畢赤酵母的突出優(yōu)點,但菌體的密度同時會受到供氧和營養(yǎng)供給及蛋白降解等限制,需要通過實驗來進行優(yōu)化。培養(yǎng)條件的優(yōu)化

畢赤酵母表達(dá)外源產(chǎn)物最合適pH通常是3.0～培養(yǎng)條件的優(yōu)化

長時間的誘導(dǎo)表達(dá),外源蛋白有可能被降解。在發(fā)酵罐大規(guī)模生產(chǎn)時,蛋白降解的影響更為嚴(yán)重,常需要采取不同的方法防止外源蛋白降解。一般有下面幾種方法:使用蛋白缺陷型菌株(如SMD1168),減少蛋白水解酶的影響;在培養(yǎng)基中添加蛋白胨或者酪蛋白水解產(chǎn)物來抑制水解;利用酵母可以在較寬的pH下生長的特點嘗試調(diào)節(jié)磷酸鹽緩沖液的pH以抑制水解。此外調(diào)整培養(yǎng)基的配料如氮源、在添加甲醇前徹底去除甘油以減少表達(dá)抑制、糖基化的優(yōu)化等措施都有相應(yīng)例子實現(xiàn)蛋白產(chǎn)量的提高。培養(yǎng)條件的優(yōu)化

長時間的誘導(dǎo)表達(dá),外源蛋白有可能被降解。在發(fā)thankyou!!!thankyou!!!微生物基因工程

李剛副教授微生物基因工程教學(xué)內(nèi)容一、PCR引物的設(shè)計與實驗操作技巧；

二、基因組文庫的建立與篩選；

三、定向進化技術(shù)在微生物酶制劑研究中的應(yīng)用；

四、原核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略；五、真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略。教學(xué)內(nèi)容一、PCR引物的設(shè)計與實驗操作技巧；

二、基因組文庫五、真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略

真核生物表達(dá)系統(tǒng)主要包括：

酵母表達(dá)系統(tǒng)、桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、

轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)、

杜氏鹽藻生物反應(yīng)器等五種表達(dá)系統(tǒng)。其中應(yīng)用最廣泛的是酵母表達(dá)系統(tǒng)。五、真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略真核生物表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點真核表達(dá)系統(tǒng)具有翻譯后的加工修飾體系,表達(dá)的外源蛋白更接近于天然蛋白質(zhì)。真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點真核表達(dá)系統(tǒng)具有翻譯后的加工修飾體系,表達(dá)酵母表達(dá)系統(tǒng)主要包括釀酒酵母、裂殖酵母、克魯維酵母、甲醇酵母等表達(dá)系統(tǒng)。其中甲醇酵母基因表達(dá)系統(tǒng)是一種最近發(fā)展迅速的外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)，也是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)。主要有H.polymorpha、CandidaBodinii、PichiaPastoris三種,其中PichiaPastoris作為基因表達(dá)系統(tǒng)使用得最多、最廣泛。由于它具有無可匹敵的高表達(dá)特性,已被認(rèn)為是最具有發(fā)展前景的生產(chǎn)蛋白質(zhì)的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。酵母表達(dá)系統(tǒng)主要包括釀酒酵母、裂殖酵母、克魯維酵母、甲醇酵母酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點①酵母長期廣泛應(yīng)用于釀酒和食品工業(yè),不會產(chǎn)生毒素,安全可靠;②酵母是真核生物,能進行一些表達(dá)產(chǎn)物的加工,有利于保持生物產(chǎn)品的活性和穩(wěn)定性;③外源基因在酵母中能分泌表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物分泌至胞外不僅有利于純化,而且避免了產(chǎn)物在胞內(nèi)大量蓄積對細(xì)胞的不利影響;④遺傳背景清楚,容易進行遺傳操作;⑤較為完善的表達(dá)控制系統(tǒng),如PMA1和PDR5等強啟動子可以介導(dǎo)目的蛋白高水平表達(dá),表達(dá)蛋白的豐度可以達(dá)到膜蛋白的10%;酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點①酵母長期廣泛應(yīng)用于釀酒和食品工業(yè),不會酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點此外,采用誘導(dǎo)表達(dá)啟動子可以在時間上嚴(yán)格控制目的蛋白的表達(dá),如GAL1-10(半乳糖誘導(dǎo))、PH05(胞外無機磷誘導(dǎo))和HSE(37℃溫度誘導(dǎo));⑥生長繁殖迅速,培養(yǎng)周期短,工藝簡單,生產(chǎn)成本低。酵母菌用于真核基因的表達(dá)、分析,既具有原核表達(dá)系統(tǒng)生長迅速、操作簡單、價格便宜等優(yōu)點,又具有類似哺乳動物細(xì)胞的翻譯后修飾過程,因而特別適用于大量生產(chǎn)真核重組蛋白,正是由于有這些優(yōu)點,使酵母功能基因組的研究得以走在生物功能基因組研究的前列,是應(yīng)用最為普遍的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點此外,采用誘導(dǎo)表達(dá)啟動子可以在時間上嚴(yán)格桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前國內(nèi)外十分推崇的真核表達(dá)系統(tǒng)。利用桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中多角體蛋白的強啟動子構(gòu)建的表達(dá)載體,可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表達(dá)。它具有真核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工功能,如二硫鍵的形成、糖基化及磷酸化等,使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白;其最高表達(dá)量可達(dá)昆蟲細(xì)胞蛋白總量的50%;可表達(dá)非常大的外源性基因(～200kD);具有在同一個感染昆蟲細(xì)胞內(nèi)同時表達(dá)多個外源基因的能力;對脊椎動物是安全的。由于病毒多角體蛋白在病毒總蛋白中的含量非常高,至今已有很多外源基因在此蛋白的強大啟動子作用下獲得高效表達(dá)。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前國內(nèi)外十分推崇的真哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與其他的真核表達(dá)體系相比,哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的蛋白與天然蛋白的結(jié)構(gòu)、糖基化類型和方式幾乎相同且能正確組裝成多亞基蛋白,但成本較高。近年來,研究者們主要通過改造宿主細(xì)胞和基因?qū)敕椒▉硖岣咄庠吹鞍椎谋磉_(dá)效率。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)常用的宿主細(xì)胞有CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3等。將外源基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞內(nèi)的方法,主要有化學(xué)法、電穿孔法、基因槍法和哺乳動物病毒載體系統(tǒng)等。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與其他的真核表達(dá)體系相比,哺乳動物細(xì)胞表轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)

轉(zhuǎn)基因植物是指利用一定的手段將外源性或內(nèi)源性的基因?qū)氲街参矬w內(nèi),使植物的遺傳性狀改變而產(chǎn)生的植物體。轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器已在藥物蛋白的生產(chǎn)中被廣泛使用,成功表達(dá)的藥用蛋白質(zhì)和多肽有:人的細(xì)胞因子、表皮生長因子、促紅細(xì)胞生成素、干擾素、生長激素、單克隆抗體等.煙草、馬鈴薯、大豆、香蕉、萵苣、羽扇豆等作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服疫苗,也得到了人們的廣泛關(guān)注。轉(zhuǎn)基因植物疫苗和藥用蛋白的表達(dá)系統(tǒng)主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、植物病毒瞬時高效表達(dá)載體和植物葉綠體高效表達(dá)系統(tǒng)。在研究成功的轉(zhuǎn)基因植物藥用蛋白中,80%是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)形成的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)。在重組藥物的多種表達(dá)體系中,轉(zhuǎn)基因植物是最經(jīng)濟的。同一種重組蛋白在植物中的生產(chǎn)成本是微生物發(fā)酵體系的2%-10%,是哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)的0.1%。轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)

轉(zhuǎn)基因植物是指利用一定的手段將外源性或杜氏鹽藻生物反應(yīng)器

杜氏鹽藻是一種單細(xì)胞真核藻類,沒有細(xì)胞壁，原生質(zhì)外僅有一層糖蛋白和神經(jīng)氨酸組成的外膜，具有一個杯狀、大型的葉綠體,體積約占細(xì)胞的一半。鹽藻是極其耐鹽的，可以在0.05-5mol/l氯化鈉的極端環(huán)境中生存。鹽藻屬于光和自養(yǎng)生物,能利用簡單的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，富含β胡蘿卜素、甘油、蛋白質(zhì)等。鹽藻作為新型的真核生物反應(yīng)器，除了具有轉(zhuǎn)錄和翻譯后的加工能力外，還具有經(jīng)濟廉價、簡單有效、安全可靠等特點。由于它能在高鹽條件下培養(yǎng)，所以不會污染其他的微生物，這點是哺乳動物細(xì)胞所不及的。外源基因在鹽藻中的表達(dá)主要是集中在cat、bar、gus和egfp等報告基因上,大多為瞬時表達(dá)。目前,只有乙肝表面抗原(HbsAg)和篩選標(biāo)記bar基因能夠在鹽藻中穩(wěn)定表達(dá)。鹽藻作為一種新型的生物反應(yīng)器,目前還不能真正生產(chǎn)外源性物質(zhì)。研究者們正從強啟動子的篩選、高效轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建、最佳轉(zhuǎn)化方法的確立等幾方面努力，目前已經(jīng)取得了一定的成果。杜氏鹽藻生物反應(yīng)器

杜氏鹽藻是一種單細(xì)胞真核藻類,沒有細(xì)胞壁巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)畢赤酵母能夠成功表達(dá)出多種外源蛋白,是由于畢赤酵母具有以下獨特的優(yōu)點:(1)能夠快速繁殖和進行高密度培養(yǎng);(2)具有強啟動子-乙醇氧化酶(AOX1)基因啟動子,并且能夠嚴(yán)格調(diào)控外源基因的表達(dá);(3)可以對外源蛋白進行類似真核的加工折疊和翻譯后修飾,產(chǎn)物從而具有天然蛋白的活性;(4)表達(dá)產(chǎn)量高,雜蛋白少,并且能夠胞外分泌表達(dá),容易分離提純;(5)培養(yǎng)條件簡單,成本低。畢赤酵母與最早研究的釀酒酵母相比,能夠高密度培養(yǎng),容易實現(xiàn)工業(yè)化,并且不存在釀酒酵母的過度糖基化問題,也不易產(chǎn)生免疫原性問題。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)畢赤酵母能夠成功表達(dá)出多種外源蛋白,是巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)

巴斯德畢赤酵母菌株：一般用于外源基因表達(dá)的Pichiapastoris菌株有Y211430,M2C10023,GS115,X-33，KM71,SMD1168等.根據(jù)利用甲醇的能力,可將巴斯德畢赤酵母分為3型:①Mut+型為甲醇快利用型,此型畢赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,絕大多數(shù)畢赤酵母為Mut+

表型。②Muts

型,此型畢赤酵母菌(如KM71)細(xì)胞AOX2基因編碼的醇氧化酶可產(chǎn)生15%AOX活性,為甲醇慢利用型。③Mut-型(如M2G10023),此型畢赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,為甲醇不利用型。研究發(fā)現(xiàn),蛋白酶缺陷型畢赤酵母,如SMD1163,SMD1165和SMD1168可有效降低外源目的蛋白的酶解。一般說來,蛋白胞內(nèi)表達(dá)時,優(yōu)先考慮用Muts

表型,對于分泌表達(dá),Mut+和Muts都可使用。甲醇慢利用型有時比Mut+型菌株能夠達(dá)到更高的表達(dá)量。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)

巴斯德畢赤酵母菌株：真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略Pichiapastoris表達(dá)載體

畢赤酵母表達(dá)載體包括自我復(fù)制型的游離載體和整合型載體，但以整合型載體為主。常見的整合載體又分為胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)2類。胞內(nèi)表達(dá)的載體有pPIC3、pPIC3K、pPIC3.5K、pHILD2、pPICZA、pPICZAB和pPICZAC等；分泌表達(dá)的載體有pPIC9、pPIC9K、pACO815、pPICZαA（B、C）和pHILS1等。通用的整合載體多含有AOX1啟動子，有一個外源基因表達(dá)框、多克隆位點（MCS）和一個從AOX1基因上拷貝下來的終止序列（TT），作為篩選標(biāo)記的his4

基因和在細(xì)菌中進行復(fù)制起始點和選擇標(biāo)記（如ColE1復(fù)制起始點和抗氨芐青霉素基因）以及AOX13’端的非編碼區(qū)序列，使外源基因能以同源重組的方式整合到染色體的AOX1部位。Pichiapastoris表達(dá)載體

畢赤酵母表達(dá)載體包括巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)與功能巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)與功能畢赤酵母表達(dá)載體的啟動子

Pichiapastoris含有兩個基因編碼醇氧化酶:AOX1和AOX2,二者序列有92%同源性,但是AOX1表達(dá)水平高于AOX2。AOX1啟動子的表達(dá)受甲醇嚴(yán)格調(diào)控。以甲醇為碳源生長時,約5%的mRNA由AOX1基因轉(zhuǎn)錄。PGAP(三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子)是最近在畢赤酵母中克隆到的一個組成型啟動子,GAP啟動子不需甲醇誘導(dǎo),發(fā)酵工藝更為簡單.。Vassilen利用GAP啟動子表達(dá)乙肝表面抗原獲得高表達(dá),Genzyme也利用GAP啟動子表達(dá)人幾丁質(zhì)酶,不僅獲得高表達(dá),而且還可以避免蛋白酶水解。此外，Phongdara在Hansenulapolymorpha克隆到酸性磷酸酶(pHO1)基因啟動子，這些啟動子豐富了甲醇酵母對啟動子的選擇。畢赤酵母表達(dá)載體的啟動子

Pichiapastoris含畢赤酵母表達(dá)載體上的選擇標(biāo)記

選擇標(biāo)記一般為對應(yīng)于營養(yǎng)缺陷型受體的野生型基因,常用his4,也可用來源于釀酒酵母的arg4基因和suc2基因.kanr基因和Shbler基因（Zeocin抗性基因）也能夠作為細(xì)菌和酵母菌的選擇標(biāo)記，并且攜帶這兩個標(biāo)記的表達(dá)載體較其他表達(dá)載體更易于篩選。畢赤酵母表達(dá)載體上的選擇標(biāo)記

選擇標(biāo)記一般為對應(yīng)于營養(yǎng)缺陷信號肽序列可供畢赤酵母選擇的信號肽有外源蛋白自身的信號肽和酵母本身的信號肽.有些蛋白的自身信號肽不能被畢赤酵母有效利用,可試用甲醇酵母信號肽。目前可供選擇的酵母信號肽有2交配因子的前導(dǎo)肽序列、酸性磷酸酶信號肽和蔗糖酶信號肽等。其中釀酒酵母

2交配因子前導(dǎo)肽序列的使用最為廣泛。酶切割位點周圍氨基酸序列及外源蛋白的3級結(jié)構(gòu)可以影響信號肽的加工效率。信號肽序列可供畢赤酵母選擇的信號肽有外源蛋白自身的信號肽和酵畢赤酵母表達(dá)載體的種類

Invitrogen公司開發(fā)出了若干系列的表達(dá)載體可供選擇。當(dāng)前常用的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體可分為2類.①胞內(nèi)表達(dá)載體。如pHIL2D2,pAO815,pPIC3K,PICZ,pHWO10,pGAPZ.②分泌表達(dá)載體。如pHIL2S1,pPIC9K,pPICZα,pGAPZα。目前主要采用酵母內(nèi)源性的信號肽來引導(dǎo)外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分泌,常用α2因子信號肽。許多蛋白的正確構(gòu)象和翻譯后加工(如糖基化等)都是在分泌途中完成的。畢赤酵母表達(dá)載體的種類

Invitrogen公司開發(fā)出了若真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略外源基因的轉(zhuǎn)化及整合

將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母中誘導(dǎo)表達(dá)，其常用的轉(zhuǎn)化方法是電轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體法,其中電轉(zhuǎn)化法最為方便,轉(zhuǎn)化效率最高,最容易產(chǎn)生多拷貝整合.Zeocin抑制細(xì)胞壁的形成,因此pPICZ系列不能使用原生質(zhì)體法進行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化時,載體DNA必須切成線狀才能與染色體進行同源重組,將整個載體連同外源基因整入宿主染色體.通常有以下幾種整合方式:①雙位點互換。發(fā)生在染色體AOX1位點和表達(dá)質(zhì)粒中的PAOX1及轉(zhuǎn)錄終止區(qū),產(chǎn)生的表達(dá)菌的表型為His+Mut-。②AOX1單位點互換。發(fā)生在染色體和表達(dá)質(zhì)粒的AOX1區(qū)。產(chǎn)生的表型是His+Mut+。③His單位點置換。發(fā)生在染色體His位點和表達(dá)質(zhì)粒的His位點,使得1個或多個表達(dá)單位插入在His位點,產(chǎn)生的表型也是His+Mut+。巴斯德畢赤酵母載體在宿主染色體上大多為單拷貝整合,由于PAOX1的強啟動性和整合后的穩(wěn)定性,所以單拷貝也能獲得較高的產(chǎn)量。外源基因的轉(zhuǎn)化及整合

將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母中重組蛋白翻譯后修飾

Pichiapastoris能進行與高等真核細(xì)胞相似的許多翻譯后修飾,包括二硫鍵形成、信號序列加工、折疊、O-連接和N-連接糖基化等。巴斯德畢赤酵母對分泌的外源蛋白的糖基化已成為研究的熱點。巴斯德畢赤酵母對外源目的蛋白的糖基化作用具有2個主要特征:①極少出現(xiàn)過度糖基化。一般情況下畢赤酵母能產(chǎn)生較釀酒酵母明顯要短的高甘露糖型寡糖鏈,且較均一,長度在8～14個之間,使產(chǎn)物更加穩(wěn)定。②糖鏈中不含具有潛在致敏作用的-1,3-甘露糖。重組蛋白翻譯后修飾

Pichiapastoris能進行與影響外源基因表達(dá)的因素

影響外源基因在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)的因素主要包括:外源基因自身的特性、外源基因整合的拷貝數(shù)、外源基因在染色體上的整合位點和方式、宿主菌的甲醇利用表型、分泌信號、產(chǎn)物穩(wěn)定性、翻譯后修飾以及培養(yǎng)條件等。影響外源基因表達(dá)的因素

影響外源基因在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)外源基因自身的特性

外源基因的特性是決定表達(dá)成敗的首要因素。特定的（A+T）富含區(qū)可作為多腺苷酸或轉(zhuǎn)錄終止信號，導(dǎo)致僅產(chǎn)生低水平或截短的mRNA。某些稀有密碼子，尤其是稀有密碼子密集區(qū)往往成為制約翻譯速率的因素。在某些情況下，可通過定點突變?nèi)コ墒烨敖K止結(jié)構(gòu)域和替換稀有密碼子。但在更極端的情況下，即基因中存在大量（A+T）富含區(qū)和稀有密碼子密集區(qū)時，往往需要進行全基因合成，使編碼序列符合畢赤酵母偏愛性密碼子用法和更高的（G+C）含量。外源基因自身的特性

外源基因的特性是決定表達(dá)成敗的首要因素。載體的構(gòu)建通過選擇添加前導(dǎo)肽,外源蛋白在畢赤酵母中可以胞內(nèi)表達(dá)也可以分泌到胞外。由于有些蛋白在胞內(nèi)表達(dá)會產(chǎn)生細(xì)胞毒性,或者因為產(chǎn)物濃度高引發(fā)細(xì)胞一些自發(fā)的調(diào)節(jié)抑制表達(dá),所以一般先嘗試胞外分泌表達(dá),同時可以減少下游的純化工序。如果采用胞外表達(dá)便需要在載體中使用信號肽。一般來說使用的都是來自釀酒酵母的α因子信號序列,含α因子的載體已經(jīng)實現(xiàn)商品化,很多外源蛋白能夠通過α因子成功胞外分泌表達(dá)。目前研究發(fā)現(xiàn)α因子信號序列的分泌能力在很多例子中比其他前導(dǎo)肽強,而且其他一些前導(dǎo)肽(如PHO1)只能分泌到膜周質(zhì),存在缺陷,而外源基因自帶的信號肽一般在畢赤酵母中表達(dá)效率很低甚至不分泌。載體的構(gòu)建通過選擇添加前導(dǎo)肽,外源蛋白在畢赤酵母中可以胞內(nèi)表載體的構(gòu)建但如果使用α因子時蛋白得不到表達(dá),應(yīng)裂菌后再次檢測目的蛋白。如果是前導(dǎo)肽的問題,就需要更換信號肽,如改用殺傷毒素的信號序列、菊粉酶的信號肽(ISP)序列。暫時沒有證據(jù)表明哪種信號肽對于具體哪一種蛋白的表達(dá)是最有效的,只能通過實驗來確定最后使用的信號肽。α因子信號序列的切割位點Kex2在AGA和GAG之間,如果表達(dá)的蛋白要求維持N端的天然序列,需要在AGA后面直接插入目的基因。有報道表明AGA后面的蛋白序列會對α因子信號序列的切割有影響,并且某些表達(dá)蛋白也會保護自身免受某些切割反應(yīng),通常當(dāng)Kex2位點后面的氨基酸殘基比較小時,對切割的影響不大。還有報導(dǎo)在目的產(chǎn)物前面加入全前導(dǎo)肽序列(pre-pro)提高了切割效率,從而提高分泌表達(dá)的產(chǎn)量。載體的構(gòu)建但如果使用α因子時蛋白得不到表達(dá),應(yīng)裂菌后再次檢測外源基因在染色體上的整合位點

巴斯德畢赤酵母中的穩(wěn)定高效表達(dá)主要通過整合性載體實現(xiàn)。整合性載體的表達(dá)盒穩(wěn)定,可以多位點整合而獲得多拷貝以及進行不同整合方式。AOX1和組氨酸脫氫酶(HIS4)基因位點都已被成功用于表達(dá)外源蛋白.Sreekrishna等認(rèn)為,由于表達(dá)框中his4染色體突變拷貝與完好的his4基因能夠發(fā)生基因轉(zhuǎn)換,所以首選Aox1位點作為整合位點。外源基因在染色體上的整合位點

巴斯德畢赤酵母中的穩(wěn)定高效表宿主菌的甲醇利用表型

原則上,如果是胞內(nèi)表達(dá),應(yīng)盡量用Mut-細(xì)胞,這樣得到的蛋白產(chǎn)物中醇氧化酶蛋白量較少而蛋白純化更易進行.。現(xiàn)在無需甲醇誘導(dǎo)的組成性表達(dá)載體pGAPZ和pGAPZα已經(jīng)構(gòu)建成功,它們常能生產(chǎn)比誘導(dǎo)型載體pPICZ和pPICZα更高的外源蛋白。Doring等研究表明,在生產(chǎn)哺乳動物膜轉(zhuǎn)運蛋白時,pGAP比pAOX1更理想。宿主菌的甲醇利用表型

原則上,如果是胞內(nèi)表達(dá),應(yīng)盡量用Mut多拷貝轉(zhuǎn)化子的