實(shí)驗(yàn)二 禽病剖檢與家禽傳染病的診斷與分析解疑

實(shí)驗(yàn)二禽病剖檢與家禽傳染病的診斷與分析華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病教研室剖檢在禽病診斷中的作用。掌握病禽剖檢方法和程序。了解病料處理和接種的原則及程序。了解病原分離鑒定的方法。了解雞胚的基本結(jié)構(gòu)與功能及常用的雞胚接種方法。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩⒓膊〉脑\斷依據(jù)疾病的臨床癥狀和病理變化進(jìn)行初步診斷。對(duì)大多數(shù)傳染病而言，確診需要進(jìn)行病原微生物的分離鑒定，是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。可以通過對(duì)組織、分泌物和拭子等樣品進(jìn)行適當(dāng)處理后通過快速檢測(cè)方法直接檢測(cè)，也可以對(duì)病原微生物的分離純化后通過血清學(xué)方法進(jìn)行鑒定。雞胚為活的動(dòng)物機(jī)體，組織分化程度低，病毒易于增殖，可選擇不同的日齡和接種途徑，感染病毒的組織和液體中含大量病毒。1.病料的涂片染色、鏡檢：出?。ò褪希⒋竽c桿菌病。2.病原分離和鑒定：細(xì)菌、霉形體、真菌可以在人工培養(yǎng)基上生長；病毒只能在活體動(dòng)物、組織器官或細(xì)胞中生長繁殖。3.血清學(xué)的檢查：瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、平板（試管）凝聚、免疫熒光、HA、HI、ELISA、病毒中和（VN）試驗(yàn)等。

特點(diǎn)：微量、準(zhǔn)確、快速、自動(dòng)化。實(shí)驗(yàn)室診斷其它診斷方法

1.PCR、RT-PCR、核酸探針（雜交）、基因芯片等分子生物學(xué)手段。

2.物理化學(xué)分析：飼料成份檢查，鈣、磷、氟、懷疑毒物分析。

3.人工發(fā)病試驗(yàn)：用分離到的病原是否能復(fù)制出與臨床病例相同的癥狀？

主要診斷步驟包括病料的采集、保存和送檢，病料涂片鏡檢，病原的分離與培養(yǎng)，對(duì)已分離病原體的毒力和生物學(xué)特性的鑒定等。1.病原學(xué)診斷

2.血清學(xué)診斷

常用的血清學(xué)診斷方法包括血凝試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫試驗(yàn)、免疫熒光抗體技術(shù)，以及免疫放射技術(shù)等。可用已知的血清檢驗(yàn)?zāi)┲牟≡?、也可用已知的病原檢驗(yàn)未知的血清，可根據(jù)需要和可能選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行檢驗(yàn)（ELISA、HI和瓊擴(kuò)）。3.分子生物學(xué)診斷

分子生物學(xué)診斷技術(shù)是20世紀(jì)七、八十年代發(fā)展起來的診斷方法，具有特異性強(qiáng)、敏感性和快速等優(yōu)點(diǎn)，例如PCR、RFLP、核酸探針技術(shù)和基因序列分析等?？筛鶕?jù)需要和條件選擇合適的方法進(jìn)行診斷。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-timePCR）三、方法與步驟3.1細(xì)菌分離無菌操作切取病變組織1-2g，涂于平皿的1/4區(qū)，然后用接種針分區(qū)涂開，置37℃溫箱培養(yǎng)。3.2病料處理（組織）無菌操作取病變組織1-2g，用剪刀剪碎后移入勻漿器，加入5ml生理鹽水用勻漿器研磨均勻。取出1ml研磨的懸液，加入到1.5ml的EP管中，1000rpm離心10min，取上清500μl（加入雙抗1-5%）。3.3細(xì)胞單層接種取分離的組織上清200μl接種到培養(yǎng)好的單層細(xì)胞，并在細(xì)胞單層中加入抗生素以免細(xì)菌污染。置37℃溫箱培養(yǎng)24-48h，觀察有無細(xì)胞病變的出現(xiàn)。3.4雞胚接種取分離的組織上清200μl，根據(jù)疑似疾病選擇不同日齡的雞胚進(jìn)行合適途徑的接種，雞胚繼續(xù)培養(yǎng)觀察有無預(yù)期的雞胚病變的出現(xiàn)。3.5樣品檢測(cè)對(duì)處理后拭子、分泌物和組織樣品，可以用膠體金試紙條、ELISA、HA、HI、PCR或RT-PCR進(jìn)行病原檢測(cè)。1、卵殼上有細(xì)孔，進(jìn)行氣體交換

2、殼膜使氣體和液體分子在內(nèi)外兩方面進(jìn)行交換。

雞胚的結(jié)構(gòu)與功能附：3、氣室呼吸和調(diào)節(jié)壓力

4、絨毛尿囊膜起胚胎呼吸器官的功能，氧氣的交換是在膜的血管內(nèi)通過卵殼孔而進(jìn)行的。5、尿囊腔胚胎的排泄器官，內(nèi)含有尿囊液，初為透明液體，以后尿囊液中尿酸鹽迅速增加，胚胎發(fā)育到第12-13天后，尿囊液開始變得混濁。6、羊膜與羊膜腔其中盛有羊水，胎體浸泡于其中

7、卵黃在胚胎發(fā)育早期供給雞胚營養(yǎng)。

8、卵白在胚胎發(fā)育晚期供給雞胚營養(yǎng)。1、最好是來自SPF雞群，以降低母源抗體的影響

2、受精卵的殼最好是白色的

3、受精卵必須新鮮，保存在5-20℃不要超過10天，保存一個(gè)月的受精卵，孵化率將近于零。

受精卵的選擇

孵育

1、孵卵箱內(nèi)的溫度應(yīng)保持在37.5-38.5℃

2、相對(duì)濕度：50%-60%

3、必須保證具有充分的新鮮空氣流通，特別是在孵化5-6天以后

4、從孵育后第3天開始，每天翻卵一次

檢卵

自孵育后的第4天開始檢卵，每天一次。

孵育4-5日后即可于檢卵燈上檢查雞胚受精與否及發(fā)育情況。

未受精卵：只見模糊的卵黃陰影，不見血管和雞胚痕跡

活胚：具有清晰的血管和雞胚暗影，較大雞胚還可見到胚動(dòng)，但孵育14、15天以后胎動(dòng)不明顯，甚至無胎動(dòng)。

死胚：血管昏暗模糊，沒有胚動(dòng)

接種前處理

1、用檢卵燈再次檢查雞胚活力，用鉛筆畫出氣室和胚胎的位置，并在將要接種的部位做好記號(hào)。

2、對(duì)雞胚上將要接種的部位進(jìn)行消毒（先用碘酊消毒再用酒精消毒）。

接種途徑1、絨毛尿囊膜接種（法氏囊）

2、尿囊腔接種（禽流感、新城疫）

3、卵黃囊接種（EDS-76）

4、羊膜腔接種正粘病毒和副粘病毒

尿囊腔接種

主要用于正粘V和副粘V，如流感V、新城疫V的分離和增殖。1、選用9-11日齡的雞胚，畫出氣室和胚位

2、在氣室接近胚體處用碘酊和酒精進(jìn)行消毒3、用打孔器穿一小孔，將注射器沿小孔插入0.5-1.0cm，注入0.1-0.2ml接種物4、用石蠟封口，并置孵卵箱中孵育，每天翻卵并檢卵一次，24h內(nèi)死亡者廢棄。

收毒

收毒前將雞胚直立放置于4℃冰箱半小時(shí)以上，凍死胚胎，防止出血。

根據(jù)接種途徑的不同，收獲相應(yīng)的材料

1、絨毛尿囊膜接種收獲接種部位絨毛尿囊膜

2、尿囊腔接種收獲尿囊液（5-8ml）

3、卵黃囊接種收獲卵黃囊或胚體

4、羊膜腔接種收獲羊水（0.5-1ml）四、結(jié)果觀察和檢測(cè)24-48h后觀察細(xì)胞病變。細(xì)菌菌落形態(tài)，革蘭氏染色，生化鑒定等。

收獲雞胚尿囊液，HA、HI或RT-PCR檢測(cè)。雞解剖實(shí)驗(yàn)材料發(fā)病雞手套、酒精棉球、碘酒棉球剪刀、鑷子托盤（雞）、廢液桶消毒液、肥皂塑料盆（血液、羽毛和離體組織）塑料桶（浸濕尸體和羽毛）實(shí)驗(yàn)方法外部檢查采血處死和消毒打開胸腹腔暴露內(nèi)臟記錄病變1.外部檢查精神狀態(tài)羽毛、皮膚眼睛、眼結(jié)膜耳、鼻和口腔泄殖腔2.翼下靜脈采血3.處死和消毒口腔處死法:將雞的兩翼和后肢保定，再將上下頜骨打開，然后用剪刀向沿腭骨深處剪下，就會(huì)剪斷上頜動(dòng)脈而致死；用消毒液浸濕尸體和羽毛。4.打開胸腹腔股骨脫臼在腿腹間切開皮膚，用力握股骨向前、向下、再向外折去剪開皮膚通過胸骨的腹尖打開體腔剪開胸骨改變方向5.暴露內(nèi)臟取出肝臟、牽出腸道卵巢和輸卵管心臟、肺臟和腎臟氣管和喉頭腦的暴露取出肝臟牽出腸道肝外膜呈灰白色渾濁，附有纖維性滲出物福建毒株病理變化：肺臟嚴(yán)重充血出血,呈黑褐色腺胃和肌胃交界處肌肉和粘膜出血法氏囊腫脹，有出血點(diǎn)法氏囊彌漫性出血，粘膜上附有干酪樣物質(zhì)盲腸腫大土黃色干酪樣栓塞物盲腸內(nèi)常有干酪物質(zhì)喉頭氣管出血干酪樣的滲出物氣管和喉頭切開顱骨除去顱骨腦的暴露縱切腦組織取出腦組織五、結(jié)果與分析