分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件

第一章RNA的提取和cDNA的合成第一章RNA的提取和cDNA的合成1RT-PCR原理及應(yīng)用提取總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNAPCR作模板獲得目的基因應(yīng)用：基因檢測、基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的分析、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)RT-PCR原理及應(yīng)用提取總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNAPCR作模板2一、RNA的提取RNA易降解，在提取過程中要嚴(yán)格防止RNA酶的污染，并設(shè)法抑制其活性。RNA酶穩(wěn)定，并廣泛存在，如各種組織、人的皮膚、手指、試劑、容器等。一、RNA的提取RNA易降解，在提取過程中要嚴(yán)格防止RNA酶3采取的措施：1、全部實(shí)驗(yàn)過程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換（使用一次性手套）。2、所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小時(shí)以上。3、不能用高溫烘烤的材料如塑料容器、試劑等可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理，然后高壓滅菌以消除殘存的DEPC

。

采取的措施：4注意事項(xiàng)：1、DEPC與氨水溶液混合會(huì)產(chǎn)生致癌物。2、DEPC能與胺和巰基反應(yīng)，因而含Tris和DTT（二硫蘇糖醇）的試劑不能用DEPC處理。3、Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。4、配制的溶液如不能高壓滅菌，可用DEPC處理水配制，并盡可能用未曾開封的試劑。

注意事項(xiàng)：5總RNA提取方法（試劑盒）：異硫氰酸胍－苯酚法（Trizol法）原理：首先用強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍裂解細(xì)胞，同時(shí)使核蛋白復(fù)合體中的蛋白變性，釋放出核酸。釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH時(shí)溶解度不同，分別位于整個(gè)體系中的中間相和水相，從而使DNA和RNA分離開來。進(jìn)一步通過有機(jī)溶劑來抽提沉淀RNA，就可以得到純凈的RNA。

總RNA提取方法（試劑盒）：6二、cDNA的合成二、cDNA的合成7分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件8反轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNA的DNA聚合酶種類：兩種1、禽類成髓細(xì)胞病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶包括兩個(gè)多肽亞基（最適溫度42℃）

活性：依賴于RNA的DNA合成，依賴于DNA的DNA合成以及對DNA:RNA雜交體的RNA部分進(jìn)行內(nèi)切降解(RNA酶H活性)。反轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNA的DNA聚合酶92、鼠白血病病毒(MLV)反轉(zhuǎn)錄酶

只有單個(gè)多肽亞基（最適溫度37℃）

活性：依賴于RNA和依賴于DNA的DNA合成活性，但降解RNA:DNA雜交體中的RNA的能力較弱，且對熱的穩(wěn)定性較AMV反轉(zhuǎn)錄酶差。MLV反轉(zhuǎn)錄酶能合成較長的cDNA(如大于2-3kb)。

2、鼠白血病病毒(MLV)反轉(zhuǎn)錄酶10cDNA引物種類：1、隨機(jī)六聚體引物：不特異的引物體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴(kuò)增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。

cDNA引物112、Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的引物絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物（12-18核苷酸）與其配對，僅mRNA可被反轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體引物得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。

2、Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的引物123、特異性引物

用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增。3、特異性引物13第二章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）第二章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）14一、PCR基本步驟三個(gè)步驟：1、變性(Denature)：雙鏈DNA目的片段在94℃下解鏈。2、退火(Anneal)：兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對。3、延伸(Extension)：在TaqDNA聚合酶合成DNA的最適溫度(72℃左右)下，以目的DNA為模板進(jìn)行合成。

一、PCR基本步驟三個(gè)步驟：15分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件16二、PCR反應(yīng)中的主要成分二、PCR反應(yīng)中的主要成分17引物：好壞是PCR成敗的關(guān)鍵。

設(shè)計(jì)原則：1、引物長度約為16-30bp

2、引物中G+C含量通常為40%-60%，粗略估計(jì)引物的解鏈溫度Tm＝4(G+C)+2(A+T)，且接近72℃最好。

3、四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3'端不存在連續(xù)3個(gè)G或C，因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)引發(fā)錯(cuò)誤。引物：好壞是PCR成敗的關(guān)鍵。184、引物3‘-端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應(yīng)，以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對。5、在引物內(nèi)，尤其在3‘-端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu)，且3’-端盡量不用T，尤應(yīng)避免連續(xù)2個(gè)或2個(gè)以上T，因?yàn)門引發(fā)錯(cuò)配的幾率高。4、引物3‘-端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核196、兩引物之間尤其在3‘-端不能互補(bǔ)，以防出現(xiàn)引物二聚體，減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。7、引物5'-端對擴(kuò)增特異性影響不大，可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)等，通常應(yīng)在5'-端限制酶位點(diǎn)外再加1-2個(gè)保護(hù)堿基。

6、兩引物之間尤其在3‘-端不能互補(bǔ)，以防出現(xiàn)引物二聚體，減208、引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)。引物濃度：一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0μmol/L。引物過多會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體，過低則降低產(chǎn)量。8、引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)。214種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)：dNTP原液一般配成2.5-10mmol/L分裝，-20℃貯存。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20-200μmol/L。當(dāng)dNTP終濃度大于50mmol/L時(shí)可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4種dNTP的濃度應(yīng)該相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入。

4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)：22Mg2+：

Mg2+濃度對TaqDNA聚合酶影響很大，它可影響酶的活性和真實(shí)性，影響引物退火和解鏈溫度，影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+濃度范圍為0.5-2mmol/L。對于一種新的PCR反應(yīng)，可以用0.1-5mmol/L的遞增濃度的Mg2+進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)，選出最適的Mg2+濃度。

Mg2+：23在PCR反應(yīng)混合物中，應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán)，例如磷酸基團(tuán)或EDTA等可能影響Mg2+濃度的物質(zhì)，以保證最適Mg2+濃度。

模板：PCR中模板DNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子，可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴(kuò)增效果稍好)。在PCR反應(yīng)混合物中，應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán)，例24就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度。一般反應(yīng)中模板量為102-105個(gè)拷貝。擴(kuò)增單拷貝基因，需要0.1μg的人基因組DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大腸桿菌DNA。多拷貝基因擴(kuò)增用量更少。模板過多可能增加非特異性產(chǎn)物。DNA中的雜質(zhì)也會(huì)影響PCR的效率。就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度。25TaqDNA聚合酶：一般TaqDNA聚合酶活性半衰期為92.5℃130min，95℃40min，97℃5min。TaqDNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃30min，摻入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。TaqDNA聚合酶的一個(gè)致命弱點(diǎn)是它的出錯(cuò)率，一般PCR中出錯(cuò)率為2×10-4核苷酸/每輪循環(huán)，在利用PCR克隆和進(jìn)行序列分析時(shí)尤應(yīng)注意。

TaqDNA聚合酶：26所用的酶量適當(dāng)。酶量過多會(huì)使產(chǎn)物非特異性增加，過少則使產(chǎn)量降低。反應(yīng)結(jié)束后，需要滅活TaqDNA聚合酶。滅活TaqDNA聚合酶的方法有：(1)PCR產(chǎn)物經(jīng)酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。(2)加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+。(3)99-100℃加熱10min。目前已有直接純化PCR產(chǎn)物的Kit可用。

所用的酶量適當(dāng)。酶量過多會(huì)使產(chǎn)物非特異性增加，過少則使產(chǎn)量降27反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液一般含10-50mmol/LTris·Cl(20℃下pH8.3-8.8)，50mmol/LKCl和適當(dāng)濃度的Mg2+。50mmol/L的KCl有利于引物的退火。

加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，可穩(wěn)定酶活性；加入T4噬菌體的基因32蛋白對擴(kuò)增較長DNA片段有利。各種TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的緩沖液。反應(yīng)緩沖液：28三、PCR反應(yīng)參數(shù)三、PCR反應(yīng)參數(shù)29變性在第一輪循環(huán)前，在94℃下變性5-10min非常重要，它可使模板DNA完全解鏈。變性不完全，往往使PCR失敗，因?yàn)槲醋冃酝耆腄NA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，減少DNA產(chǎn)量。一般變性溫度與時(shí)間為94℃1min。變性30在變性溫度下，雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全，所耗時(shí)間主要是為使反應(yīng)體系完全達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟?。對于富含GC的序列，可適當(dāng)提高變性溫度。但變性溫度過高或時(shí)間過長都會(huì)導(dǎo)致酶活性的損失。在變性溫度下，雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全，所耗時(shí)間主要31退火引物退火的溫度和所需時(shí)間的長短取決于引物的堿基組成、引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度。一般當(dāng)引物中G、C含量高，長度長并與模板完全配對時(shí)，應(yīng)提高退火溫度。退火溫度越高，所得產(chǎn)物的特異性越高。

退火32實(shí)際使用的退火溫度比擴(kuò)增引物的Tm值約低5℃。通常退火溫度和時(shí)間為37℃-55℃，1-2min。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成，反應(yīng)中所需時(shí)間主要是為使整個(gè)反應(yīng)體系達(dá)到合適的溫度。實(shí)際使用的退火溫度比擴(kuò)增引物的Tm值約低5℃。33延伸延伸反應(yīng)通常為72℃，接近于TaqDNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度75℃。實(shí)際上，引物延伸在退火時(shí)即已開始，因?yàn)門aqDNA聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃。延伸時(shí)間的長短取決于目的序列的長度和濃度。在一般反應(yīng)體系中，TaqDNA聚合酶每分鐘約可合成2kb長的DNA。

延伸34延伸時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。但對很低濃度的目的序列，則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時(shí)間。一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，都需要一步較長時(shí)間(10-30min)的延伸反應(yīng)，以獲得盡可能完整的產(chǎn)物，這對以后進(jìn)行克隆或測序反應(yīng)尤為重要。

延伸時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。35循環(huán)參數(shù)一般而言，25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多，會(huì)使PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)25-30輪循環(huán)后，反應(yīng)中Taq酶已經(jīng)不足。如果此時(shí)產(chǎn)物量仍不夠，需要進(jìn)一步擴(kuò)增，可將擴(kuò)增的DNA樣品稀釋103-105倍作為模板，重新加入各種反應(yīng)底物進(jìn)行擴(kuò)增，這樣經(jīng)60輪循環(huán)后，擴(kuò)增水平可達(dá)109-1010。循環(huán)參數(shù)36在擴(kuò)增后期，由于產(chǎn)物積累，使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線，產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升，這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)，減少非特異性產(chǎn)物。

在擴(kuò)增后期，由于產(chǎn)物積累，使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲37四、PCR產(chǎn)物的純化酚/氯仿法Kit法酚:氯仿:異戊醇抽提2次

PCR產(chǎn)物加TE100μl混勻回收水相沉淀DNA無水乙醇沉淀純化DNA75％乙醇洗滌沉淀ddH2O溶解DNA四、PCR產(chǎn)物的純化酚/氯仿法酚:氯仿:異戊醇抽提2次PC38五、PCR產(chǎn)物的克隆利用T-Vector克隆TaqDNA聚合酶會(huì)在3’-端加上多余的非模板依賴堿基，而且對A優(yōu)先聚合，所以PCR產(chǎn)物末端的多余堿基大部分都是A。利用這一特點(diǎn)，可以經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的平末端用酶加上dT或ddT，使載體與PCR產(chǎn)物末端互補(bǔ)并進(jìn)行連接。

五、PCR產(chǎn)物的克隆利用T-Vector克隆39粘性末端連接

利用引物中附加在5’端的限制酶位點(diǎn)，直接將PCR產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈詈螽a(chǎn)生粘性末端，與載體連接，產(chǎn)生重組DNA。如果上、下游兩個(gè)引物中含有兩個(gè)不同的限制酶位點(diǎn)，經(jīng)酶切后定向克隆到載體中。

粘性末端連接40第三章DNA酶切及凝膠電泳第三章DNA酶切及凝膠電泳41一、DNA的限制性內(nèi)切酶分析Ⅱ類限制性內(nèi)切酶識別長度為4至6個(gè)核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列。Ⅱ類酶切割位點(diǎn)在識別序列中，有的在對稱軸處切割，產(chǎn)生平末端的DNA片段。如，SmaⅠ：5‘-CCC↓GGG-3’一、DNA的限制性內(nèi)切酶分析Ⅱ類限制性內(nèi)切酶42有的切割位點(diǎn)在對稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端。如，EcoRⅠ切割識別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3'→5'…GAATTC…3‘3'…CTTAA↑G…5'→3'…CTTAAG…5'有的切割位點(diǎn)在對稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱43酶切反應(yīng)單酶切：各種酶緩沖液、反應(yīng)溫度不同如，BamHⅠ反應(yīng)溫度為30℃雙酶切：緩沖液不同，反應(yīng)溫度為37℃。若需要不同的鹽濃度，則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用，隨后調(diào)節(jié)鹽濃度，再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。

酶切時(shí)保護(hù)堿基的個(gè)數(shù)酶切反應(yīng)44二、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。

瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度200bp至50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場下電泳。

二、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂45在電場中，帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由多種因素決定：DNA的分子大小線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

在電場中，帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由多種因素決46瓊脂糖濃度

一個(gè)給定大小的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。

瓊脂糖濃度47DNA分子的構(gòu)象

相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的，超螺旋DNA移動(dòng)最快，而線狀雙鏈DNA移動(dòng)最慢。電源電壓在低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。電壓增加時(shí)，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。DNA分子的構(gòu)象48離子強(qiáng)度影響在沒有離子時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠)，電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動(dòng)。在高離子強(qiáng)度時(shí)(如誤加10×電泳緩沖液配制凝膠)，則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件49第四章其它工具酶第四章其它工具酶50一、連接酶（連接反應(yīng)）類型與用途1、T4DNA連接酶催化相鄰DNA鏈的5’-P末端和3’-OH末端之間形成磷酸二酯鍵。它不僅可以催化粘性末端DNA之間的連接，也可以催化平滑末端DNA之間的連接。用途：（1）DNA片斷和載體DNA的連接。（2）DNA片斷和LinkerDNA的連接。

一、連接酶（連接反應(yīng)）類型與用途512、大腸桿菌DNA連接酶

催化相鄰DNA鏈的5’-P末端和3’-OH末端之間形成磷酸二酯鍵。一般只能催化突出末端DNA之間的連接，如果要催化平滑末端DNA之間的連接反應(yīng)，需要有PEG及高濃度一價(jià)陽離子的存在。用途：（1）DNA片斷和載體DNA的連接。（2）DNA片斷和LinkerDNA的連接。

2、大腸桿菌DNA連接酶52連接要求與結(jié)果連接要求與結(jié)果53反應(yīng)體系（20μl）載體DNA1μl外源DNA3μl10×T4DNALigationBuffer2μlT4DNALigase1μlddH2O13μl載體DNA與外源DNA的摩爾比通常為1﹕3左右。反應(yīng)條件：16℃8-14h，通常過夜即可。

反應(yīng)體系（20μl）54二、堿性磷酸酶（去磷酸化反應(yīng)）類型：SAP（蝦的堿性磷酸酶）、BAP（大腸桿菌C75堿性磷酸酶）、CIAP（小牛腸堿性磷酸酶），其中BAP、CIAP應(yīng)用最廣泛。

用途：去除載體DNA5’-末端的磷酸基團(tuán)，防止自身環(huán)化反應(yīng)。

二、堿性磷酸酶（去磷酸化反應(yīng)）類型：55反應(yīng)體系（50μl）載體DNA20μl10×AlkalinePhosphateBuffer5μlAlkalinePhosphatase2μlddH2O23μl反應(yīng)條件：5’-突出端37℃30min，對于平末端及5’-凹端使用BAP應(yīng)在55－60℃條件下反應(yīng)。

反應(yīng)體系（50μl）56三、DNA聚合酶（補(bǔ)平反應(yīng)）類型與用途1、KlenowFragment（大腸桿菌DNA聚合酶I大片斷）具有5’→3’的DNA聚合酶活性，對于單鏈DNA具有3’→5’的外切核酸酶活性，但較弱。用途：雙鏈DNA5’-突出端的平滑化。三、DNA聚合酶（補(bǔ)平反應(yīng)）類型與用途572、T4DNA聚合酶具有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的外切核酸酶活性，且后者比KlenowFragment外切核酸酶活性高100－1000倍。用途：雙鏈DNA5’-突出端和雙鏈DNA3’-突出端的平滑化。2、T4DNA聚合酶58反應(yīng)體系：（20μl）DNA5’-突出端12μl10×Buffer2μlKlenowFragment1μldNTPs0.5μlddH2O4.5μl雙鏈DNA3’-突出端的平滑化反應(yīng)不需加dNTPs即可。反應(yīng)條件：37℃30min

反應(yīng)體系：（20μl）59第五章感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化第五章感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化60受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入其體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法，CaCl2，KCl等化學(xué)試劑法)的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenentcells)。受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，它可以容忍外源DNA61轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。為了提高轉(zhuǎn)化效率，要考慮幾個(gè)重要因素：1、細(xì)胞生長狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于4℃的培養(yǎng)菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。

轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受62細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600來控制。DH5α菌株的OD600為0.5時(shí)，細(xì)胞密度在5×107個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同)，這時(shí)比較合適。密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。

細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD632、質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度：

用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%。2、質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度：643、試劑的質(zhì)量：所用的試劑，如CaCl2等均需是最高純度的(GR.或AR.)，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。4、防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，tip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌。

3、試劑的質(zhì)量：65第六章質(zhì)粒DNA的提取第六章質(zhì)粒DNA的提取66質(zhì)粒載體的特性質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的不相容性：利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中共同存在。質(zhì)粒載體的特性質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳67理想的克隆載體的特性：1、分子量小、多拷貝、松馳控制型2、具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點(diǎn)3、能插入較大的外源DNA片段4、具有容易操作的檢測表型。

常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb至10kb之間，如pBR322、pUC系列、PGEM系列和pBluescript（簡稱pBS）等。理想的克隆載體的特性：68質(zhì)粒分離的基本步驟1、培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增2、收集和裂解細(xì)胞

采用溶菌酶可破壞菌體細(xì)胞壁，SDS和TritonX-100可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)處理后，細(xì)菌染色體DNA會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上，同時(shí)由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多，易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。

質(zhì)粒分離的基本步驟1、培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增69

當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線性染色體DNA變性，而共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條鏈不會(huì)相互分開，當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體DNA片段難以復(fù)性，而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起，而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。

3、分離和純化質(zhì)粒DNA當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線性染色體DNA變性，而70在提取質(zhì)粒過程中，除了超螺旋DNA外，還會(huì)產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松馳型的環(huán)狀分子，稱開環(huán)DNA。如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂，則形成線狀DNA。在提取質(zhì)粒過程中，除了超螺旋DNA外，還會(huì)產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒71質(zhì)粒的提取（堿裂解法）試劑配制：溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高壓滅菌15分鐘，儲(chǔ)存于4℃冰箱。

溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(臨用前用10mol/LNaOH母液稀釋)，1%SDS。

質(zhì)粒的提?。▔A裂解法）試劑配制：72溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高壓滅菌。溶液終濃度為：K+3mol/L，Acˉ5mol/L。酚:氯仿:異戊醇＝25:24:1RNA酶A母液：將RNA酶A溶于10mmol/LTris·Cl(pH7.5)，15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加熱15分鐘，使混有的DNA酶失活。

溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5m73操作步驟：1、取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5mleppendorf管中，4℃下12000g離心30秒。2、棄上清，將eppendorf管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘，使液體流盡。3、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩)，室溫下放置5-10分鐘。操作步驟：744、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次，以混勻內(nèi)容物(千萬不要振蕩)，冰浴5分鐘。5、加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒，使沉淀混勻，冰浴中5-10分鐘，4℃下12000g離心5-10分鐘。

4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，蓋緊管口，快速溫和顛倒ep756、上清液移入干凈eppendorf管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)，振蕩混勻，4℃下12000g離心5分鐘。7、將水相移入干凈eppendorf管中，加入2倍體積的無水乙醇，振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。6、上清液移入干凈eppendorf管中，加入等體積的酚/氯76精品課件！精品課件！77精品課件！精品課件！788、棄上清，將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入1ml75%乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g離心5-10分鐘。9、吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，真空干燥10分鐘或室溫干燥。10、將沉淀溶于20μlTE緩沖液(pH8.0，含20μg/mlRNase)中，儲(chǔ)于-20℃冰箱中。

8、棄上清，將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入1m79第一章RNA的提取和cDNA的合成第一章RNA的提取和cDNA的合成80RT-PCR原理及應(yīng)用提取總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNAPCR作模板獲得目的基因應(yīng)用：基因檢測、基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的分析、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)RT-PCR原理及應(yīng)用提取總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNAPCR作模板81一、RNA的提取RNA易降解，在提取過程中要嚴(yán)格防止RNA酶的污染，并設(shè)法抑制其活性。RNA酶穩(wěn)定，并廣泛存在，如各種組織、人的皮膚、手指、試劑、容器等。一、RNA的提取RNA易降解，在提取過程中要嚴(yán)格防止RNA酶82采取的措施：1、全部實(shí)驗(yàn)過程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換（使用一次性手套）。2、所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小時(shí)以上。3、不能用高溫烘烤的材料如塑料容器、試劑等可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理，然后高壓滅菌以消除殘存的DEPC

。

采取的措施：83注意事項(xiàng)：1、DEPC與氨水溶液混合會(huì)產(chǎn)生致癌物。2、DEPC能與胺和巰基反應(yīng)，因而含Tris和DTT（二硫蘇糖醇）的試劑不能用DEPC處理。3、Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。4、配制的溶液如不能高壓滅菌，可用DEPC處理水配制，并盡可能用未曾開封的試劑。

注意事項(xiàng)：84總RNA提取方法（試劑盒）：異硫氰酸胍－苯酚法（Trizol法）原理：首先用強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍裂解細(xì)胞，同時(shí)使核蛋白復(fù)合體中的蛋白變性，釋放出核酸。釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH時(shí)溶解度不同，分別位于整個(gè)體系中的中間相和水相，從而使DNA和RNA分離開來。進(jìn)一步通過有機(jī)溶劑來抽提沉淀RNA，就可以得到純凈的RNA。

總RNA提取方法（試劑盒）：85二、cDNA的合成二、cDNA的合成86分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件87反轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNA的DNA聚合酶種類：兩種1、禽類成髓細(xì)胞病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶包括兩個(gè)多肽亞基（最適溫度42℃）

活性：依賴于RNA的DNA合成，依賴于DNA的DNA合成以及對DNA:RNA雜交體的RNA部分進(jìn)行內(nèi)切降解(RNA酶H活性)。反轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNA的DNA聚合酶882、鼠白血病病毒(MLV)反轉(zhuǎn)錄酶

只有單個(gè)多肽亞基（最適溫度37℃）

活性：依賴于RNA和依賴于DNA的DNA合成活性，但降解RNA:DNA雜交體中的RNA的能力較弱，且對熱的穩(wěn)定性較AMV反轉(zhuǎn)錄酶差。MLV反轉(zhuǎn)錄酶能合成較長的cDNA(如大于2-3kb)。

2、鼠白血病病毒(MLV)反轉(zhuǎn)錄酶89cDNA引物種類：1、隨機(jī)六聚體引物：不特異的引物體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴(kuò)增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。

cDNA引物902、Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的引物絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物（12-18核苷酸）與其配對，僅mRNA可被反轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體引物得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。

2、Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的引物913、特異性引物

用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增。3、特異性引物92第二章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）第二章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）93一、PCR基本步驟三個(gè)步驟：1、變性(Denature)：雙鏈DNA目的片段在94℃下解鏈。2、退火(Anneal)：兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對。3、延伸(Extension)：在TaqDNA聚合酶合成DNA的最適溫度(72℃左右)下，以目的DNA為模板進(jìn)行合成。

一、PCR基本步驟三個(gè)步驟：94分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件95二、PCR反應(yīng)中的主要成分二、PCR反應(yīng)中的主要成分96引物：好壞是PCR成敗的關(guān)鍵。

設(shè)計(jì)原則：1、引物長度約為16-30bp

2、引物中G+C含量通常為40%-60%，粗略估計(jì)引物的解鏈溫度Tm＝4(G+C)+2(A+T)，且接近72℃最好。

3、四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3'端不存在連續(xù)3個(gè)G或C，因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)引發(fā)錯(cuò)誤。引物：好壞是PCR成敗的關(guān)鍵。974、引物3‘-端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應(yīng)，以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對。5、在引物內(nèi)，尤其在3‘-端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu)，且3’-端盡量不用T，尤應(yīng)避免連續(xù)2個(gè)或2個(gè)以上T，因?yàn)門引發(fā)錯(cuò)配的幾率高。4、引物3‘-端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核986、兩引物之間尤其在3‘-端不能互補(bǔ)，以防出現(xiàn)引物二聚體，減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。7、引物5'-端對擴(kuò)增特異性影響不大，可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)等，通常應(yīng)在5'-端限制酶位點(diǎn)外再加1-2個(gè)保護(hù)堿基。

6、兩引物之間尤其在3‘-端不能互補(bǔ)，以防出現(xiàn)引物二聚體，減998、引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)。引物濃度：一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0μmol/L。引物過多會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體，過低則降低產(chǎn)量。8、引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)。1004種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)：dNTP原液一般配成2.5-10mmol/L分裝，-20℃貯存。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20-200μmol/L。當(dāng)dNTP終濃度大于50mmol/L時(shí)可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4種dNTP的濃度應(yīng)該相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入。

4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)：101Mg2+：

Mg2+濃度對TaqDNA聚合酶影響很大，它可影響酶的活性和真實(shí)性，影響引物退火和解鏈溫度，影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+濃度范圍為0.5-2mmol/L。對于一種新的PCR反應(yīng)，可以用0.1-5mmol/L的遞增濃度的Mg2+進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)，選出最適的Mg2+濃度。

Mg2+：102在PCR反應(yīng)混合物中，應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán)，例如磷酸基團(tuán)或EDTA等可能影響Mg2+濃度的物質(zhì)，以保證最適Mg2+濃度。

模板：PCR中模板DNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子，可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴(kuò)增效果稍好)。在PCR反應(yīng)混合物中，應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán)，例103就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度。一般反應(yīng)中模板量為102-105個(gè)拷貝。擴(kuò)增單拷貝基因，需要0.1μg的人基因組DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大腸桿菌DNA。多拷貝基因擴(kuò)增用量更少。模板過多可能增加非特異性產(chǎn)物。DNA中的雜質(zhì)也會(huì)影響PCR的效率。就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度。104TaqDNA聚合酶：一般TaqDNA聚合酶活性半衰期為92.5℃130min，95℃40min，97℃5min。TaqDNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃30min，摻入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。TaqDNA聚合酶的一個(gè)致命弱點(diǎn)是它的出錯(cuò)率，一般PCR中出錯(cuò)率為2×10-4核苷酸/每輪循環(huán)，在利用PCR克隆和進(jìn)行序列分析時(shí)尤應(yīng)注意。

TaqDNA聚合酶：105所用的酶量適當(dāng)。酶量過多會(huì)使產(chǎn)物非特異性增加，過少則使產(chǎn)量降低。反應(yīng)結(jié)束后，需要滅活TaqDNA聚合酶。滅活TaqDNA聚合酶的方法有：(1)PCR產(chǎn)物經(jīng)酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。(2)加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+。(3)99-100℃加熱10min。目前已有直接純化PCR產(chǎn)物的Kit可用。

所用的酶量適當(dāng)。酶量過多會(huì)使產(chǎn)物非特異性增加，過少則使產(chǎn)量降106反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液一般含10-50mmol/LTris·Cl(20℃下pH8.3-8.8)，50mmol/LKCl和適當(dāng)濃度的Mg2+。50mmol/L的KCl有利于引物的退火。

加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，可穩(wěn)定酶活性；加入T4噬菌體的基因32蛋白對擴(kuò)增較長DNA片段有利。各種TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的緩沖液。反應(yīng)緩沖液：107三、PCR反應(yīng)參數(shù)三、PCR反應(yīng)參數(shù)108變性在第一輪循環(huán)前，在94℃下變性5-10min非常重要，它可使模板DNA完全解鏈。變性不完全，往往使PCR失敗，因?yàn)槲醋冃酝耆腄NA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，減少DNA產(chǎn)量。一般變性溫度與時(shí)間為94℃1min。變性109在變性溫度下，雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全，所耗時(shí)間主要是為使反應(yīng)體系完全達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟?。對于富含GC的序列，可適當(dāng)提高變性溫度。但變性溫度過高或時(shí)間過長都會(huì)導(dǎo)致酶活性的損失。在變性溫度下，雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全，所耗時(shí)間主要110退火引物退火的溫度和所需時(shí)間的長短取決于引物的堿基組成、引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度。一般當(dāng)引物中G、C含量高，長度長并與模板完全配對時(shí)，應(yīng)提高退火溫度。退火溫度越高，所得產(chǎn)物的特異性越高。

退火111實(shí)際使用的退火溫度比擴(kuò)增引物的Tm值約低5℃。通常退火溫度和時(shí)間為37℃-55℃，1-2min。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成，反應(yīng)中所需時(shí)間主要是為使整個(gè)反應(yīng)體系達(dá)到合適的溫度。實(shí)際使用的退火溫度比擴(kuò)增引物的Tm值約低5℃。112延伸延伸反應(yīng)通常為72℃，接近于TaqDNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度75℃。實(shí)際上，引物延伸在退火時(shí)即已開始，因?yàn)門aqDNA聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃。延伸時(shí)間的長短取決于目的序列的長度和濃度。在一般反應(yīng)體系中，TaqDNA聚合酶每分鐘約可合成2kb長的DNA。

延伸113延伸時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。但對很低濃度的目的序列，則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時(shí)間。一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，都需要一步較長時(shí)間(10-30min)的延伸反應(yīng)，以獲得盡可能完整的產(chǎn)物，這對以后進(jìn)行克隆或測序反應(yīng)尤為重要。

延伸時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。114循環(huán)參數(shù)一般而言，25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多，會(huì)使PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)25-30輪循環(huán)后，反應(yīng)中Taq酶已經(jīng)不足。如果此時(shí)產(chǎn)物量仍不夠，需要進(jìn)一步擴(kuò)增，可將擴(kuò)增的DNA樣品稀釋103-105倍作為模板，重新加入各種反應(yīng)底物進(jìn)行擴(kuò)增，這樣經(jīng)60輪循環(huán)后，擴(kuò)增水平可達(dá)109-1010。循環(huán)參數(shù)115在擴(kuò)增后期，由于產(chǎn)物積累，使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線，產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升，這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)，減少非特異性產(chǎn)物。

在擴(kuò)增后期，由于產(chǎn)物積累，使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲116四、PCR產(chǎn)物的純化酚/氯仿法Kit法酚:氯仿:異戊醇抽提2次

PCR產(chǎn)物加TE100μl混勻回收水相沉淀DNA無水乙醇沉淀純化DNA75％乙醇洗滌沉淀ddH2O溶解DNA四、PCR產(chǎn)物的純化酚/氯仿法酚:氯仿:異戊醇抽提2次PC117五、PCR產(chǎn)物的克隆利用T-Vector克隆TaqDNA聚合酶會(huì)在3’-端加上多余的非模板依賴堿基，而且對A優(yōu)先聚合，所以PCR產(chǎn)物末端的多余堿基大部分都是A。利用這一特點(diǎn)，可以經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的平末端用酶加上dT或ddT，使載體與PCR產(chǎn)物末端互補(bǔ)并進(jìn)行連接。

五、PCR產(chǎn)物的克隆利用T-Vector克隆118粘性末端連接

利用引物中附加在5’端的限制酶位點(diǎn)，直接將PCR產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈詈螽a(chǎn)生粘性末端，與載體連接，產(chǎn)生重組DNA。如果上、下游兩個(gè)引物中含有兩個(gè)不同的限制酶位點(diǎn)，經(jīng)酶切后定向克隆到載體中。

粘性末端連接119第三章DNA酶切及凝膠電泳第三章DNA酶切及凝膠電泳120一、DNA的限制性內(nèi)切酶分析Ⅱ類限制性內(nèi)切酶識別長度為4至6個(gè)核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列。Ⅱ類酶切割位點(diǎn)在識別序列中，有的在對稱軸處切割，產(chǎn)生平末端的DNA片段。如，SmaⅠ：5‘-CCC↓GGG-3’一、DNA的限制性內(nèi)切酶分析Ⅱ類限制性內(nèi)切酶121有的切割位點(diǎn)在對稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端。如，EcoRⅠ切割識別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3'→5'…GAATTC…3‘3'…CTTAA↑G…5'→3'…CTTAAG…5'有的切割位點(diǎn)在對稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱122酶切反應(yīng)單酶切：各種酶緩沖液、反應(yīng)溫度不同如，BamHⅠ反應(yīng)溫度為30℃雙酶切：緩沖液不同，反應(yīng)溫度為37℃。若需要不同的鹽濃度，則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用，隨后調(diào)節(jié)鹽濃度，再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。

酶切時(shí)保護(hù)堿基的個(gè)數(shù)酶切反應(yīng)123二、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。

瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度200bp至50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場下電泳。

二、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂124在電場中，帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由多種因素決定：DNA的分子大小線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

在電場中，帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由多種因素決125瓊脂糖濃度

一個(gè)給定大小的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。

瓊脂糖濃度126DNA分子的構(gòu)象

相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的，超螺旋DNA移動(dòng)最快，而線狀雙鏈DNA移動(dòng)最慢。電源電壓在低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。電壓增加時(shí)，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。DNA分子的構(gòu)象127離子強(qiáng)度影響在沒有離子時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠)，電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動(dòng)。在高離子強(qiáng)度時(shí)(如誤加10×電泳緩沖液配制凝膠)，則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件128第四章其它工具酶第四章其它工具酶129一、連接酶（連接反應(yīng)）類型與用途1、T4DNA連接酶催化相鄰DNA鏈的5’-P末端和3’-OH末端之間形成磷酸二酯鍵。它不僅可以催化粘性末端DNA之間的連接，也可以催化平滑末端DNA之間的連接。用途：（1）DNA片斷和載體DNA的連接。（2）DNA片斷和LinkerDNA的連接。

一、連接酶（連接反應(yīng)）類型與用途1302、大腸桿菌DNA連接酶

催化相鄰DNA鏈的5’-P末端和3’-OH末端之間形成磷酸二酯鍵。一般只能催化突出末端DNA之間的連接，如果要催化平滑末端DNA之間的連接反應(yīng)，需要有PEG及高濃度一價(jià)陽離子的存在。用途：（1）DNA片斷和載體DNA的連接。（2）DNA片斷和LinkerDNA的連接。

2、大腸桿菌DNA連接酶131連接要求與結(jié)果連接要求與結(jié)果132反應(yīng)體系（20μl）載體DNA1μl外源DNA3μl10×T4DNALigationBuffer2μlT4DNALigase1μlddH2O13μl載體DNA與外源DNA的摩爾比通常為1﹕3左右。反應(yīng)條件：16℃8-14h，通常過夜即可。

反應(yīng)體系（20μl）133二、堿性磷酸酶（去磷酸化反應(yīng)）類型：SAP（蝦的堿性磷酸酶）、BAP（大腸桿菌C75堿性磷酸酶）、CIAP（小牛腸堿性磷酸酶），其中BAP、CIAP應(yīng)用最廣泛。

用途：去除載體DNA5’-末端的磷酸基團(tuán)，防止自身環(huán)化反應(yīng)。

二、堿性磷酸酶（去磷酸化反應(yīng)）類型：134反應(yīng)體系（50μl）載體DNA20μl10×AlkalinePhosphateBuffer5μlAlkalinePhosphatase2μlddH2O23μl反應(yīng)條件：5’-突出端37℃30min，對于平末端及5’-凹端使用BAP應(yīng)在55－60℃條件下反應(yīng)。

反應(yīng)體系（50μl）135三、DNA聚合酶（補(bǔ)平反應(yīng)）類型與用途1、KlenowFragment（大腸桿菌DNA聚合酶I大片斷）具有5’→3’的DNA聚合酶活性，對于單鏈DNA具有3’→5’的外切核酸酶活性，但較弱。用途：雙鏈DNA5’-突出端的平滑化。三、DNA聚合酶（補(bǔ)平反應(yīng)）類型與用途1362、T4DNA聚合酶具有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的外切核酸酶活性，且后者比KlenowFragment外切核酸酶活性高100－1000倍。用途：雙鏈DNA5’-突出端和雙鏈DNA3’-突出端的平滑化。2、T4DNA聚合酶137反應(yīng)體系：（20μl）DNA5’-突出端12μl10×Buffer2μlKlenowFragment1μldNTPs0.5μlddH2O4.5μl雙鏈DNA3’-突出端的平滑化反應(yīng)不需加dNTPs即可。反應(yīng)條件：37℃30min

反應(yīng)體系：（20μl）138第五章感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化第五章感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化139受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入其體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法，CaCl2，KCl等化學(xué)試劑法)的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenentcells)。受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，它可以容忍外源DNA140轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。為了提高轉(zhuǎn)化效率，要考慮幾個(gè)重要因素：1、細(xì)胞生長狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于4℃的培養(yǎng)菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。

轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受141細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600來控制。DH5α菌株的OD600為0.5時(shí)，細(xì)胞密度在5×107個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同)，這時(shí)比較合適。密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。

細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD1422、質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度：

用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%。2、質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度：