基因工程第章 DNA重組的操作

Review第三部分目的基因的分離目的序列已知：一般采用PCR技術(shù)或分子雜交技術(shù)分離克隆目的基因目的序列未知：差異表達(dá)序列無差異表達(dá)的目的序列，可采用文庫篩選法、功能蛋白分離法、序列克隆法一、目的基因的功能克隆根據(jù)蛋白質(zhì)的基本生化特性這一功能信息，在獲知基因的功能后克隆其具體作法是:在純化相應(yīng)的編碼蛋白后構(gòu)建cDNA文庫或基因組文庫，然后從文庫中篩選目的基因(1)將純化的蛋白質(zhì)進行氨基酸測序，據(jù)此合成寡核苷酸探針從cDNA庫或基因組文庫中篩選編碼基因(2)將相應(yīng)的編碼蛋白制成相應(yīng)抗體探針，從cDNA表達(dá)文庫中篩選相應(yīng)克隆。二、序列克隆法根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基因采用核酸探針雜交篩選或用PCR技術(shù)進行分離三、差別雜交法適用范圍：組織特異性表達(dá)或特定發(fā)育階段表達(dá)的基因受生長因子調(diào)節(jié)的基因經(jīng)特殊處理誘導(dǎo)表達(dá)的基因應(yīng)用前提：基因在兩種不同的細(xì)胞群體中的差異性表達(dá)（一個細(xì)胞群體中正常表達(dá)，另一個細(xì)胞群體中目的基因不表達(dá)）?；具^程制備兩種細(xì)胞群體的的mRNA提取物以兩種總mRNA或cDNA為探針以表達(dá)目的基因的細(xì)胞群體構(gòu)建cDNA文庫有目的基因表達(dá)的mRNA探針，重組體菌落陽性反應(yīng)目的基因不表達(dá)的mRNA探針，除目的基因之外，其余菌落都為陽性反應(yīng)比較底片，對照原板，可挑選出含選目的基因的菌落cDNA文庫母板目的基因有表達(dá)目的基因無表達(dá)無有無有說明含目的基因說明含目的基因四、減法雜交技術(shù)又稱差減雜交、扣除雜交、減數(shù)雜交、消減雜交本質(zhì)：盡量去除兩種樣品中普遍共同存在的基因序列，從而使目的基因序列得到有效的富集，從而提高基因篩選分離的敏感性兩種策略：mRNA減法雜交基因組減法雜交mRNA減法雜交提取表達(dá)目的基因的細(xì)胞mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA提取不表達(dá)目的基因的細(xì)胞mRNA過量雜交兩種組織中均表達(dá)的基因產(chǎn)物形成cDNA/mRNA雜交分子特異mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA片段仍保持單鏈減數(shù)雜交技術(shù)分離差異表達(dá)基因DNA/RNA雜交分子可結(jié)合在羥基磷灰石柱上，而游離的單鏈cDNA則過柱流出?；厥盏腸DNA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA后克隆倒適當(dāng)?shù)妮d體中，就成為一個減數(shù)文庫。五、mRNA差別顯顯示技術(shù)又稱為差別別顯示反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄PCR（DDRT-PCR）目的序列未未知，1992年由由美國哈佛佛大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)分校Dena-Farber研究所所的兩位科科學(xué)家Liang和和Pardee首次次提出的，，并運用這這種方法來來分離一對對培養(yǎng)的哺哺乳動物細(xì)細(xì)胞中差別別表達(dá)的基基因。至今今，運用mRNA差差別顯示技技術(shù)分離、、鑒定的差差別表達(dá)基基因大約有有300多多個。3’端錨錨定引物錨定引物的的通式是oligo(dT)12MN，其中中M為A、、C、G中中的任意一一種，N為為A、C、、G或T中中的任意一一種，所以以共有12種種oligo(dT)12MN引物，，用這12種引物分分別對同一一總RNA樣品進行行cDNA合成，即進行12次不同同的反轉(zhuǎn)錄錄反應(yīng)，每每一種3’’端錨定定引物，都都能夠把總總mRNA群體的1／12分分子反轉(zhuǎn)錄錄成mRNA-cDNA雜交交分子。這樣可以將將整個mRNA群體體在cDNA水平上上，分成大大致相等但但序列結(jié)構(gòu)構(gòu)不同的12份亞群群體。這一一過程叫做做差異顯示反反轉(zhuǎn)錄，即DDRT。5’端隨機機引物另外，還需需要另外一一種由10個核核苷酸組成成的5’端端隨機引物物。這種5’’隨機引物物可以同特特定細(xì)胞類類型的總mRNA群群體中的一一部分分子子發(fā)生雜交交作用，而而且雜交部部位是隨機機地分布在在距每條新新合成的cDNA鏈鏈3’端的的不同位置置上。用3’端端錨定引物物和5’’隨機引物物組成的引引物對，以以mRNA/cDNA為模板板進行PCR擴增，，然后經(jīng)過過2～3h的變性聚聚丙烯酰胺胺凝膠電泳泳，可以顯顯示出在100～500bp之間的DNA條帶帶20種5’端隨機機引物12種3’端錨定定引物240組引引物，進行行PCRPCR過程程中加入放放射性標(biāo)記記變型聚丙烯烯酰氨凝膠膠電泳放射自顯影影顯示差異異表達(dá)條帶帶對差異表達(dá)達(dá)條帶進行行割膠回收收并制備成成探針，從從文庫中篩篩選差別顯示分分析基本流流程基本程序提取兩種細(xì)細(xì)胞的總mRNA,反轉(zhuǎn)錄后后成為2種種cDNA以一定的引引物作隨機機聚合酶鏈鏈反應(yīng)通過擴增產(chǎn)產(chǎn)物的電泳泳分析,分分離出不同同樣品間的的差異條帶帶將差異DNA做成探探針在cDNA文庫或基基因組文庫庫中篩選基基因并作功功能分析優(yōu)點：幾乎可檢測測細(xì)胞表達(dá)達(dá)的所有基基因可同時比較較多種細(xì)胞胞類型可同時展現(xiàn)現(xiàn)所有差異異用量少，操操作簡單，，快速高效效缺點：12種錨定定引物和20種隨機機引物，240次PCR聚丙烯酰胺胺凝膠電泳泳分離片段段小于500bp有些差別條條帶成簇出出現(xiàn)，造成成假陽性缺乏定量分分析手段，，判斷差異異條帶有難難度第六章DNA重組組的操作第一節(jié)受受體細(xì)胞胞易于重組DNA分子子的導(dǎo)入能使重組DNA分子子穩(wěn)定存在在于細(xì)胞中中便于重組體體的篩選遺傳穩(wěn)定性性高安全性高有利于外源源基因的高高效分泌表表達(dá)在遺傳密碼碼的應(yīng)用上上無偏倚性性具有較好的的轉(zhuǎn)譯后加加工機制有較高的應(yīng)應(yīng)用價值1、原核生物細(xì)細(xì)胞是較為理想想的受體細(xì)細(xì)胞大多原核生生物沒有堅堅硬的細(xì)胞胞壁沒有核膜，，有利于外外源片斷重重組基因組簡單單，便于對對外源基因因進行遺傳傳分析多為單細(xì)胞胞生物，繁繁殖迅速，，過程簡單單缺陷：以原核生物物表達(dá)真核核生物基因因存在問題題，很多真真核生物基基因不能在在E.coli中表達(dá)具生生物活性的的功能蛋白白。缺乏乏真真核核生生物物蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)折折疊疊復(fù)復(fù)性性系系統(tǒng)統(tǒng)缺乏蛋蛋白質(zhì)質(zhì)加工工系統(tǒng)統(tǒng)原核生生物內(nèi)內(nèi)源蛋蛋白易易降解解空間間構(gòu)象象不正正確的的異源源蛋白白，造造成表表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物不不穩(wěn)定定常用受受體菌菌：大腸桿桿菌人人胰島島素、、生長長素、、干擾擾素等等枯草桿桿菌人人ββ干擾擾素、、白細(xì)細(xì)胞介介素乙肝病病毒核核心抗抗原等等藍(lán)藻易易于于表達(dá)達(dá)植物物基因因2、真真菌細(xì)細(xì)胞低等真真核生生物酵母菌菌：以以芽殖殖或裂裂殖方方式進進行無無性繁繁殖的的單細(xì)細(xì)胞真真核微微生物物，易易于表表達(dá)外外源真真核基基因基因結(jié)結(jié)構(gòu)最最為簡簡單的的真核核生物物之一一具有真真核生生物蛋蛋白翻翻譯后后修飾飾加工工系統(tǒng)統(tǒng)不含有有特異異性病病毒，，不產(chǎn)產(chǎn)生毒毒素培養(yǎng)簡簡單可將外外源基基因表表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物分分泌至至胞外外3、植植物細(xì)細(xì)胞堅硬的的細(xì)胞胞壁纖維素素酶處處理－－原生生質(zhì)體體攝取外外源片片斷全能性性：在在合適適的培培養(yǎng)條條件下下，一一個分分離的的活細(xì)細(xì)胞可可分化化成植植株。。水稻，棉花花，玉米，，馬鈴薯，，煙草等4、動物細(xì)細(xì)胞早期：生殖殖細(xì)胞、受受精卵細(xì)胞胞或胚細(xì)胞胞現(xiàn)在：體細(xì)細(xì)胞培養(yǎng)動物：豬豬、羊、牛牛、魚、鼠鼠、猴等生產(chǎn)天然狀狀態(tài)的復(fù)雜雜蛋白質(zhì)動物疫苗動物品種的的遺傳改良良人類疾病的的基因治療療第二節(jié)重重組體體導(dǎo)入受體體細(xì)胞2.1重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化化大腸桿菌菌轉(zhuǎn)化（transformation）定義轉(zhuǎn)化微生物物的種類感受態(tài)細(xì)胞胞P139轉(zhuǎn)化過程供體（donor）：提供DNA的生生物受體（recipientorhost）：獲得DNA的生生物1.定義轉(zhuǎn)化：受體菌直接吸收供體菌的DNA片斷斷而獲得后后者部分遺遺傳性狀的的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化子（transformant）：通過轉(zhuǎn)化方式式而形成的雜雜種后代。2.轉(zhuǎn)化微生生物的種類首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象肺肺炎炎鏈球菌（（Griffith,1928）嗜血桿菌屬屬、芽孢桿桿菌屬、奈奈瑟氏球菌菌屬、根瘤瘤菌屬、葡葡萄球菌屬屬、假單胞胞菌屬、黃黃單胞菌屬屬等。3.感受態(tài)（competence）感受態(tài)：指指受體細(xì)胞胞最易接受受外源DNA片斷并并能實現(xiàn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化的一種種生理狀態(tài)態(tài)。感受態(tài)是細(xì)細(xì)菌的一種種遺傳特性性，而且也也受生長階階段、培養(yǎng)養(yǎng)條件的影影響。肺炎鏈球菌菌對對數(shù)生長后后期芽孢桿菌屬屬指指數(shù)期末和和穩(wěn)定期大腸桿菌剛剛進入對對數(shù)期DH5α菌菌株的OD600為為0.5時,細(xì)胞胞密度在5×107個/ml左左右大腸桿菌革蘭氏陰性性菌細(xì)胞表面的的結(jié)構(gòu)和組組成與革蘭蘭氏陽性菌菌不同轉(zhuǎn)化因子的的吸收較為為困難人工制備感感受態(tài)細(xì)胞胞4.轉(zhuǎn)化化過程大腸桿菌的的轉(zhuǎn)化方法法：Ca2＋誘導(dǎo)大腸桿桿菌轉(zhuǎn)化法法電穿孔轉(zhuǎn)化化法三親本雜交交接合轉(zhuǎn)化化大腸桿菌菌1、Ca2＋誘導(dǎo)大腸桿桿菌轉(zhuǎn)化法法培養(yǎng)生命活動旺旺盛的菌體體菌種分純活活化，擴大大培養(yǎng)，處處于對數(shù)生生長期沉淀菌體冰水浴中預(yù)預(yù)冷10分分鐘，4℃離心心化合物處理理含CaCl2無菌預(yù)冷緩沖液液處理DNA分子子轉(zhuǎn)化感受受態(tài)細(xì)胞制備感受態(tài)態(tài)細(xì)胞的注注意事項1.細(xì)胞胞生長狀態(tài)態(tài)和密度:不要用經(jīng)過過多次轉(zhuǎn)接接或儲于４４℃的培養(yǎng)養(yǎng)菌，最好好從－70℃℃或－－20℃℃甘油保保存的菌菌種中直接轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)接用于于制備感感受態(tài)細(xì)細(xì)胞的菌菌液。細(xì)胞生長長密度以以剛進入入對數(shù)生長長期時為好，，可通過過監(jiān)測培培養(yǎng)液的的OD600來來控制制。DH5αα菌株的的OD600為為0.5時,細(xì)胞密密度在5×107個/ml左右(不同的的菌株情情況有所所不同)，這時時比較合合適。密密度過高高或不足足均會影影響轉(zhuǎn)化化效率。。2.質(zhì)質(zhì)粒的質(zhì)質(zhì)量和濃濃度:用于轉(zhuǎn)化化的質(zhì)粒粒DNA應(yīng)主要要是超螺螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率率與外源源DNA的濃度度在一定定范圍內(nèi)內(nèi)成正比比,但當(dāng)當(dāng)加入的的外源DNA的的量過多多或體積積過大時時,轉(zhuǎn)化化效率就就會降低低。1ng的的cccDNA即可使使50μμl的的感受態(tài)態(tài)細(xì)胞達(dá)達(dá)到飽和和。一般般情況下下,DNA溶液液的體積積不應(yīng)超超過感受受態(tài)細(xì)胞胞體積的的5％。3.試試劑的質(zhì)質(zhì)量:所用的試試劑,如如CaCl2等等均需需是最高高純度的的(GR.或AR.)，并用用超純水水配制，，最好分分裝保存存于干燥燥的冷暗暗處。4.防防止雜菌菌和雜DNA的的污染：：整個操作作過程均均應(yīng)在無菌條件件下進行行，所用器器皿，如如離心管管，tip頭等等最好是是新的，，并經(jīng)高高壓滅菌菌處理，，所有有的的試試劑劑都都要要滅滅菌菌，且且注注意意防防止止被被其其它它試試劑劑、、DNA酶酶或或雜雜DNA所所污污染染，，否否則則均均會會影影響響轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化效效率率或或雜雜DNA的的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入入，，為為以以后后的的篩篩選選、、鑒鑒定定帶帶來來不不必必要要的的麻麻煩煩。。感受受態(tài)態(tài)細(xì)細(xì)胞胞的的制制備備1、、挑挑取取平平板板上上的的大大腸腸桿桿菌菌單單菌菌落落接接種種于于2mLLB液液體體培培養(yǎng)養(yǎng)基基中中，，37℃℃振振蕩蕩培培養(yǎng)養(yǎng)過過夜夜2、、按按1％％的的接接種種量量接接種種于于3mL新新鮮鮮LB培培養(yǎng)養(yǎng)液液，，37℃℃劇劇烈烈振振蕩蕩培培養(yǎng)養(yǎng)至至OD600為0.4-0.6(可可見見霧霧狀狀)3、、倒倒至至1.5mL的的eppendorf管管中中,4℃℃下下12,000rpm離離心心1min，，倒倒出出培培養(yǎng)養(yǎng)液液，，用用無無菌菌濾濾紙紙盡盡量量吸吸干干4、、加加入入1mL預(yù)預(yù)冷冷的的無無菌菌0.1mol··L-1CaCl2溶液液渦渦旋旋，，4℃℃下下12,000rpm離離心心30秒秒,盡盡量量去去除除上上清清5、、沉沉淀淀以以50-100μμL預(yù)預(yù)冷冷的的0.1mol··L-1CaCl2重懸懸，，4℃℃保保存存?zhèn)鋫溆糜茫?d內(nèi)內(nèi)可可用用。。細(xì)胞胞的的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化2ul重重組組DNA50ul感感受受態(tài)態(tài)細(xì)細(xì)胞胞混混勻勻＋↓冰浴浴30min42℃℃熱熱激激90～～120S↓↓冰浴浴2min復(fù)蘇蘇：：加加入入450ul液液態(tài)態(tài)LB培培養(yǎng)養(yǎng)基基，，37℃℃輕輕緩緩振振蕩蕩培培養(yǎng)養(yǎng)（（150rpm）），，1.5～～2h↓→取30～～50ul，，涂涂布布在在含含相相應(yīng)應(yīng)抗抗生生素素的的培培養(yǎng)養(yǎng)基基上上，，平平板板培培養(yǎng)養(yǎng)挑取取單單菌菌落落，，于于含含相相應(yīng)應(yīng)抗抗生生素素的的液液態(tài)態(tài)培培養(yǎng)養(yǎng)基基培培養(yǎng)養(yǎng)后后，，取取一一定定量量提提取取質(zhì)質(zhì)粒粒，，進進行行鑒鑒定定（（酶酶切切、、雜雜交交、、測測序序等等））↑CaCl2的誘誘導(dǎo)導(dǎo)原原因因：：在0℃℃的的CaCl2低滲滲溶溶液液中中，，細(xì)細(xì)菌菌細(xì)細(xì)胞胞發(fā)發(fā)生生膨膨脹脹，，Ca2＋使細(xì)胞膜膜磷脂層層形成液液晶結(jié)構(gòu)構(gòu)，促使使細(xì)胞外外膜與內(nèi)內(nèi)膜間隙隙中部分分核酸酶酶解離，，誘導(dǎo)形形成感受受態(tài)Ca2＋能與加入入的DNA分子子結(jié)合，，形成抗抗脫氧核核糖核酸酸酶的羥羥基－磷磷酸鈣復(fù)復(fù)合物，，黏附在在胞膜的的外表面面；42℃熱熱激處理理，細(xì)胞胞膜的液液晶結(jié)構(gòu)構(gòu)發(fā)生擾擾動，出出現(xiàn)間隙隙。提高轉(zhuǎn)化化效率的的因素：：MgCl2與CaCl2共同處理理二甲基亞亞楓（DMSO）、、二硫蘇蘇糖醇（（DTT）提高100～1000倍，易易污染RbCl、MnCl2、LiCl和KCl等等與CaCl2多鹽處理理對照處理理：DNA對對照處理理：無菌水代代替感受受態(tài)細(xì)胞胞，檢驗驗DNA溶液感受態(tài)細(xì)細(xì)胞對照照處理：：NTE緩緩沖液代代替DNA溶液液，檢驗驗感受態(tài)態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)細(xì)胞有效效性對照照處理：：加入已知知的容易易轉(zhuǎn)化的的質(zhì)粒DNA原因：轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化處理過過程中，，可能感感染雜菌菌，導(dǎo)致假陽陽性2、電穿穿孔轉(zhuǎn)化化法（P140）基本原理理：利用高高壓電脈脈沖作用用，在大大腸桿菌菌細(xì)胞膜膜上進行行電穿孔孔，形成成可逆的的瞬間通道道，促進外外源DNA的有有效吸收收。影響因素素：電場強度度，電脈脈沖時間間，外源源DNA濃度菌體制備備冷卻，離離心，洗洗滌（降降低離子子強度））10％甘甘油重懸懸細(xì)胞，，-70℃貯貯存低溫下（（0－4℃））進行電電穿孔轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化3、三親親本雜交交接合轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化大腸腸桿菌根據(jù)非接接合質(zhì)粒粒的遷移作用用而建立，，目前常常用的載載體多是是在非接接合型質(zhì)質(zhì)?；蛉比鄙倭私咏雍限D(zhuǎn)移移基因的的接合型型質(zhì)粒的的基礎(chǔ)上上而構(gòu)建建的。待轉(zhuǎn)化的的受體菌菌含有要轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化的重重組質(zhì)粒粒的供體體菌含有廣泛泛宿主的的輔助質(zhì)質(zhì)粒的輔輔助菌（（如：輔助菌株株E.coli(pRK2013)）4、轉(zhuǎn)化化率：DNA分分子轉(zhuǎn)化化受體菌菌獲得轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化子的的效率以轉(zhuǎn)化子子數(shù)與用用于轉(zhuǎn)化化處理的的DNA分子數(shù)數(shù)或質(zhì)量量的比率率表示以轉(zhuǎn)化子子數(shù)與用用于轉(zhuǎn)化化處理的的受體細(xì)細(xì)胞數(shù)的的比率表表示P150影響轉(zhuǎn)化化率的因因素：重組DNA分子質(zhì)量量較小，，親和性性強，雙雙螺旋閉閉合結(jié)構(gòu)構(gòu)受體細(xì)胞胞受體細(xì)胞胞的選擇擇非常重重要轉(zhuǎn)化手段段電穿孔法法>Ca誘導(dǎo)法法>三親親本雜交交法2.2重組λDNA分分子轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)大腸桿桿菌轉(zhuǎn)染：將重組λDNA分子直接導(dǎo)入受體體細(xì)胞的的過程。。轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過λ噬噬菌體顆粒感染宿主主細(xì)胞的途途徑把外外源DNA分子子轉(zhuǎn)移到到受體細(xì)細(xì)胞內(nèi)的的過程。。P142轉(zhuǎn)化:1392.3重重組DNA分分子導(dǎo)入入植物細(xì)細(xì)胞(P144)（1）農(nóng)農(nóng)桿菌介介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒粒載體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法革蘭氏陰陰性菌作用機制制：將待轉(zhuǎn)移移的目的的基因組組入農(nóng)桿桿菌中的的Ti質(zhì)質(zhì)粒載體體農(nóng)桿菌識識別敏感感植物，，將Ti質(zhì)粒的的T-DNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到植植物細(xì)胞胞內(nèi)部選擇合適的外外植體根據(jù)受體細(xì)胞胞的轉(zhuǎn)化能力力來決定農(nóng)桿菌的接種種操作（接種到損傷傷切面，使農(nóng)農(nóng)桿菌與外植植體共培養(yǎng)）洗菌并篩選培培養(yǎng)（無菌水清洗洗共培養(yǎng)后的的外植體，無無菌濾紙吸干干后轉(zhuǎn)移到篩篩選培養(yǎng)基上上，殺死或抑抑制附著于表表面的農(nóng)桿菌菌）農(nóng)桿菌介導(dǎo)外外源基因轉(zhuǎn)化化植物的基本本程序：創(chuàng)傷植株感染染法（植株接種共轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法）共培養(yǎng)感染法法葉盤轉(zhuǎn)化法植物愈傷組織織共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化化法植物懸浮細(xì)胞胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化化法原生質(zhì)體共培培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法常用方法：創(chuàng)傷植株感染染法

（植株接種共轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法）在整體植株上上造成創(chuàng)傷農(nóng)桿菌接種在在創(chuàng)傷表面或或針頭注射農(nóng)農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌以天然然的感染過程程在植株體內(nèi)內(nèi)