試驗原理微核micronucleus微核試驗課件

小鼠骨髓細(xì)胞微核實驗環(huán)境毒理學(xué)實驗——小鼠骨髓細(xì)胞微核實驗環(huán)境毒理學(xué)實驗——1.1

環(huán)境毒理學(xué)1.引言

研究環(huán)境污染物，特別是化學(xué)污染物對生物有機(jī)體，尤其是對人體的損害作用及其機(jī)理的科學(xué)。新興科學(xué)發(fā)展迅速1.1環(huán)境毒理學(xué)1.引言研究環(huán)境污染物，特別是化學(xué)藻類生長抑制實驗魚類急性毒性實驗經(jīng)口急性毒性實驗小鼠骨髓細(xì)胞微核實驗一般毒性特殊毒性1.2

環(huán)境毒理學(xué)實驗——環(huán)境毒理學(xué)的研究方法水生脊椎動物浮游植物哺乳類嚙齒動物藻類生長抑制實驗魚類急性毒性實驗經(jīng)口急性毒性實驗小鼠骨髓細(xì)胞1.3遺傳毒性研究突變(mutation)：遺傳物質(zhì)發(fā)生的可改變生殖細(xì)胞或體細(xì)胞中的遺傳信息并產(chǎn)生新的表型效應(yīng)的變化。環(huán)境致突變作用化學(xué)物質(zhì)及其他環(huán)境因素導(dǎo)致生物體遺傳機(jī)構(gòu)的改變，可以導(dǎo)致人類的某些遺傳性疾病且與癌癥的發(fā)生有關(guān)自發(fā)突變誘發(fā)突變化學(xué)因素物理因素生物因素

環(huán)境化學(xué)誘變物藥品：抗癌藥物環(huán)磷酰胺、氨苯喋啶等農(nóng)藥：DDT,敵敵畏，谷硫磷等工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用和產(chǎn)生的污染物亞硝胺類，多環(huán)芳烴類，甲醛，苯，砷，鉛……1.3遺傳毒性研究突變(mutation)：遺傳物質(zhì)發(fā)生的1.4

致突變試驗評定外源化合物對生殖細(xì)胞及體細(xì)胞的致突變性對遺傳危害性做出初步評價用于環(huán)境誘變劑污染的監(jiān)測及評價有價值的工具用來評價誘發(fā)癌癥的可能性1.4致突變試驗遺傳毒性研究新技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)單細(xì)胞凝膠電泳試驗熒光原位雜交轉(zhuǎn)基因小鼠突變試驗基因芯片技術(shù)常用經(jīng)典方法Ames試驗微核試驗染色體畸變分析SCE試驗顯性致死試驗試驗原理微核micronucleus微核試驗課件根據(jù)檢測的遺傳學(xué)終點，可將致突變實驗分為基因突變試驗、染色體損傷試驗、非整備體試驗和DNA損傷試驗。根據(jù)檢測的遺傳學(xué)終點，可將致突變實驗分為基因突變試驗、染色體2.1

實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握小鼠骨髓細(xì)胞微核實驗方法和嗜多染紅細(xì)胞(PCE)微核測定方法了解微核測試的原理和遺傳毒理學(xué)在實際生活與工作中的應(yīng)用范圍及意義2.小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗2.1實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握小鼠骨髓細(xì)胞微核實驗方法和嗜多微核形成原理微核：染色體斷裂或紡錘絲受損,在細(xì)胞有絲分裂后期滯留在細(xì)胞核外的遺傳物質(zhì)。2.2實驗原理微核micronucleus微核形成原理微核：染色體斷裂或紡錘絲受損,在細(xì)胞有絲分裂后微核試驗：通過觀察微核的形成情況來檢測斷裂劑及非整備體誘發(fā)劑。

可以根據(jù)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)細(xì)胞中微核出現(xiàn)率，觀察環(huán)境污染物對染色體完整性和染色體分離改變的影響，判定其有無遺傳毒性。微核試驗：通過觀察微核的形成情況來檢測斷裂劑及非整備體誘發(fā)劑2.3

實驗器材

手術(shù)刀手術(shù)剪無齒鑷小型彎止血鉗干凈紗布帶橡皮頭吸管臺式離心機(jī)刻度離心管

9.電吹風(fēng)機(jī)10.玻璃蠟筆11.2ml注射器及針頭12.載玻片及推片13.定時鐘14.帶油鏡頭顯微鏡15.細(xì)胞計數(shù)器16.玻璃染色缸17.晾片架2.3實驗器材手術(shù)刀9.電吹風(fēng)機(jī)2.4

主要試劑

甲醇（分析純）生理鹽水小牛血清pH6.8的磷酸鹽緩沖液

分別取1/15mol/L的磷酸二氫鉀溶液50.40ml和1/15mol/L的磷酸氫二鈉溶液49.60ml，兩者混合均勻。吉姆薩(Giemsa)染液陽性對照物環(huán)磷酰胺或絲裂霉素C

2.4主要試劑甲醇（分析純）2.5

實驗步驟

（1）實驗動物及處理

①實驗動物

品系：昆明種小鼠

性別：雌性雄性各半

周齡：8周

體重：18-20g

2.5實驗步驟（1）實驗動物及處理②染毒途徑經(jīng)口經(jīng)皮經(jīng)呼吸道注射小白鼠的灌胃方法小白鼠的腹腔注射方法測試氣態(tài)污染物的毒性，應(yīng)優(yōu)先選擇哪種染毒方式？a.經(jīng)口b.經(jīng)皮c.經(jīng)呼吸道d.注射測試主要存在于水體、食物中的化合物的毒性，應(yīng)優(yōu)先選擇哪種染毒方式？測試化妝品主要成分的毒性，應(yīng)優(yōu)先選擇哪種染毒方式？②染毒途徑經(jīng)口小白鼠的灌胃方法小白鼠的腹腔注射方法測試③染毒次數(shù)及取樣時間染毒時間微核率環(huán)境毒物誘發(fā)微核出現(xiàn)的高峰時間：24-72h染毒次數(shù)：4次連續(xù)染毒每24h染毒1次③染毒次數(shù)及取樣時間染毒時間微核率環(huán)境毒物誘發(fā)微核出現(xiàn)染毒④劑量選擇染毒組陰性對照組陽性對照組最高劑量組采用該毒物的最大耐受量(或1/2LD50)在此以下再設(shè)3-5個濃度組等體積溶劑環(huán)磷酰胺50-100mg/kg絲裂霉素C100mg/kg在動物實驗中不引起實驗動物死亡的最大劑量或濃度

④劑量選擇染毒組陰性對照組陽性對照組最高劑量組采用該(2)

骨髓液的制備和涂片取胸骨剪去骨骺端擦凈血污，剔去肌肉小牛血清混勻、推片推片的操作方法(2)骨髓液的制備和涂片取胸骨剪去骨骺端擦凈血污，剔去肌肉(3)

固定涂片自然干燥后放人甲醇中固定15min。

(4)

染色用新鮮配置的吉姆薩使用液染色

10-15min，取出后迅速用磷酸鹽緩沖液(pH6.8)

沖洗染色殘液，晾干(3)固定(4)染色（5）觀察計數(shù)低倍鏡觀察(100-400倍放大)選擇細(xì)胞分布均勻、疏密適度、染色較好、形態(tài)完整的區(qū)域油鏡(1000倍放大)細(xì)胞計數(shù)嗜多染紅細(xì)胞和微核注意區(qū)分微核和雜質(zhì)（5）觀察計數(shù)低倍鏡觀察(100-400倍放大)油鏡(100（6）數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評價微核率計算方法結(jié)果評價陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：實驗組微核率顯著高于對照組，具有重現(xiàn)性具有劑量-效應(yīng)關(guān)系陰性判斷標(biāo)準(zhǔn)：實驗劑量足夠大，染毒次數(shù)足夠（6）數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評價微核率計算方法結(jié)果評價陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：（7）質(zhì)量保證/質(zhì)量控制(QA/QC)陰性對照：應(yīng)得到陰性結(jié)果，微核自發(fā)率約為3‰陰性對照異常的可能原因試劑被污染實驗動物異常，實驗前已接觸遺傳毒物操作錯誤陽性對照：應(yīng)得到陽性結(jié)果，各次實驗結(jié)果具有重現(xiàn)性陽性對照異常的可能原因無效染毒，染毒試劑已分解實驗動物異常，周齡不合適，敏感度下降操作錯誤（7）質(zhì)量保證/質(zhì)量控制(QA/QC)陰性對照：應(yīng)得到陰性注意事項

1.實驗所用的器具必須潔凈，小牛血清無污染。2.骨髓涂片上，細(xì)胞疏密程度要合適，細(xì)胞之間互不重疊。3.正確區(qū)分微核和涂片上的異物。4.實驗動物年齡不宜過大。

注意事項1.實驗所用的器具必須潔凈，小牛血清無污小鼠骨髓細(xì)胞微核實驗環(huán)境毒理學(xué)實驗——小鼠骨髓細(xì)胞微核實驗環(huán)境毒理學(xué)實驗——1.1

環(huán)境毒理學(xué)1.引言

研究環(huán)境污染物，特別是化學(xué)污染物對生物有機(jī)體，尤其是對人體的損害作用及其機(jī)理的科學(xué)。新興科學(xué)發(fā)展迅速1.1環(huán)境毒理學(xué)1.引言研究環(huán)境污染物，特別是化學(xué)藻類生長抑制實驗魚類急性毒性實驗經(jīng)口急性毒性實驗小鼠骨髓細(xì)胞微核實驗一般毒性特殊毒性1.2

環(huán)境毒理學(xué)實驗——環(huán)境毒理學(xué)的研究方法水生脊椎動物浮游植物哺乳類嚙齒動物藻類生長抑制實驗魚類急性毒性實驗經(jīng)口急性毒性實驗小鼠骨髓細(xì)胞1.3遺傳毒性研究突變(mutation)：遺傳物質(zhì)發(fā)生的可改變生殖細(xì)胞或體細(xì)胞中的遺傳信息并產(chǎn)生新的表型效應(yīng)的變化。環(huán)境致突變作用化學(xué)物質(zhì)及其他環(huán)境因素導(dǎo)致生物體遺傳機(jī)構(gòu)的改變，可以導(dǎo)致人類的某些遺傳性疾病且與癌癥的發(fā)生有關(guān)自發(fā)突變誘發(fā)突變化學(xué)因素物理因素生物因素

環(huán)境化學(xué)誘變物藥品：抗癌藥物環(huán)磷酰胺、氨苯喋啶等農(nóng)藥：DDT,敵敵畏，谷硫磷等工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用和產(chǎn)生的污染物亞硝胺類，多環(huán)芳烴類，甲醛，苯，砷，鉛……1.3遺傳毒性研究突變(mutation)：遺傳物質(zhì)發(fā)生的1.4

致突變試驗評定外源化合物對生殖細(xì)胞及體細(xì)胞的致突變性對遺傳危害性做出初步評價用于環(huán)境誘變劑污染的監(jiān)測及評價有價值的工具用來評價誘發(fā)癌癥的可能性1.4致突變試驗遺傳毒性研究新技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)單細(xì)胞凝膠電泳試驗熒光原位雜交轉(zhuǎn)基因小鼠突變試驗基因芯片技術(shù)常用經(jīng)典方法Ames試驗微核試驗染色體畸變分析SCE試驗顯性致死試驗試驗原理微核micronucleus微核試驗課件根據(jù)檢測的遺傳學(xué)終點，可將致突變實驗分為基因突變試驗、染色體損傷試驗、非整備體試驗和DNA損傷試驗。根據(jù)檢測的遺傳學(xué)終點，可將致突變實驗分為基因突變試驗、染色體2.1

實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握小鼠骨髓細(xì)胞微核實驗方法和嗜多染紅細(xì)胞(PCE)微核測定方法了解微核測試的原理和遺傳毒理學(xué)在實際生活與工作中的應(yīng)用范圍及意義2.小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗2.1實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握小鼠骨髓細(xì)胞微核實驗方法和嗜多微核形成原理微核：染色體斷裂或紡錘絲受損,在細(xì)胞有絲分裂后期滯留在細(xì)胞核外的遺傳物質(zhì)。2.2實驗原理微核micronucleus微核形成原理微核：染色體斷裂或紡錘絲受損,在細(xì)胞有絲分裂后微核試驗：通過觀察微核的形成情況來檢測斷裂劑及非整備體誘發(fā)劑。

可以根據(jù)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)細(xì)胞中微核出現(xiàn)率，觀察環(huán)境污染物對染色體完整性和染色體分離改變的影響，判定其有無遺傳毒性。微核試驗：通過觀察微核的形成情況來檢測斷裂劑及非整備體誘發(fā)劑2.3

實驗器材

手術(shù)刀手術(shù)剪無齒鑷小型彎止血鉗干凈紗布帶橡皮頭吸管臺式離心機(jī)刻度離心管

9.電吹風(fēng)機(jī)10.玻璃蠟筆11.2ml注射器及針頭12.載玻片及推片13.定時鐘14.帶油鏡頭顯微鏡15.細(xì)胞計數(shù)器16.玻璃染色缸17.晾片架2.3實驗器材手術(shù)刀9.電吹風(fēng)機(jī)2.4

主要試劑

甲醇（分析純）生理鹽水小牛血清pH6.8的磷酸鹽緩沖液

分別取1/15mol/L的磷酸二氫鉀溶液50.40ml和1/15mol/L的磷酸氫二鈉溶液49.60ml，兩者混合均勻。吉姆薩(Giemsa)染液陽性對照物環(huán)磷酰胺或絲裂霉素C

2.4主要試劑甲醇（分析純）2.5

實驗步驟

（1）實驗動物及處理

①實驗動物

品系：昆明種小鼠

性別：雌性雄性各半

周齡：8周

體重：18-20g

2.5實驗步驟（1）實驗動物及處理②染毒途徑經(jīng)口經(jīng)皮經(jīng)呼吸道注射小白鼠的灌胃方法小白鼠的腹腔注射方法測試氣態(tài)污染物的毒性，應(yīng)優(yōu)先選擇哪種染毒方式？a.經(jīng)口b.經(jīng)皮c.經(jīng)呼吸道d.注射測試主要存在于水體、食物中的化合物的毒性，應(yīng)優(yōu)先選擇哪種染毒方式？測試化妝品主要成分的毒性，應(yīng)優(yōu)先選擇哪種染毒方式？②染毒途徑經(jīng)口小白鼠的灌胃方法小白鼠的腹腔注射方法測試③染毒次數(shù)及取樣時間染毒時間微核率環(huán)境毒物誘發(fā)微核出現(xiàn)的高峰時間：24-72h染毒次數(shù)：4次連續(xù)染毒每24h染毒1次③染毒次數(shù)及取樣時間染毒時間微核率環(huán)境毒物誘發(fā)微核出現(xiàn)染毒④劑量選擇染毒組陰性對照組陽性對照組最高劑量組采用該毒物的最大耐受量(或1/2LD50)在此以下再設(shè)3-5個濃度組等體積溶劑環(huán)磷酰胺50-100mg/kg絲裂霉素C100mg/kg在動物實驗中不引起實驗動物死亡的最大劑量或濃度

④劑量選擇染毒組陰性對照組陽性對照組最高劑量組采用該(2)

骨髓液的制備和涂片取胸骨剪去骨骺端擦凈血污，剔去肌肉小牛血清混勻、推片推片的操作方法(2)骨髓液的制備和涂片取胸骨剪去骨骺端擦凈血污，剔去肌肉(3)

固定涂片自然干燥后放人甲醇中固定15min。

(4)

染色用新鮮配置的吉姆薩使用液染色

10-15min，取出后迅速用磷酸鹽緩沖液(pH6.8)

沖洗染色殘液，晾干(3)固