植物抗旱生理指標(biāo)測定原理及方法

9/9植物抗旱生理指標(biāo)測定原理及方法生命科學(xué)學(xué)院楊歌指標(biāo)測定：可溶性糖（蒽酮法）脯氨酸丙二醛葉綠素蛋白（考馬斯亮藍(lán)法）超氧化物歧化酶（SOD）過氧化物酶（POD）谷胱甘肽（GSH）九、電導(dǎo)率可溶性糖含量的測定1.蒽酮法1.1原理糖在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反應(yīng)生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應(yīng)生成藍(lán)綠色糠醛衍生物，在可見光吸收峰位620nm。測定對象：幾乎可以測定所有的碳水化合物，而且可以測所有寡糖類和多糖類，其中包括淀粉、纖維素等（反應(yīng)液中的濃硫酸可以把多糖水解成單糖而發(fā)生反應(yīng)，所以用蒽酮法測出的碳水化合物含量，實際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量）。1.2步驟試劑：(1)濃硫酸；(2)蒽酮乙酸乙酯試劑：蒽酮1g加乙酸乙酯至50ml實驗步驟：稱取樣品0.1g，置于研缽中，加4mlddH2O研磨成勻漿，8mlddH2O洗滌研缽。100°4000rpm離心10min。取上清5ml轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶定容。1ml提取液+1mlddH2O+0.5ml蒽酮+5ml濃硫酸，輕輕混合均勻，100°620nm處測吸光值。1.3計算方法可溶性糖含量%

=

C*V/(W*10^6)*100%

V為植物樣品稀釋后的體積（ml）100ml

C為提取液的含糖量（μg/ml）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算W為植物組織鮮重量（g）

問題及質(zhì)疑：1.目標(biāo)糖含量：標(biāo)準(zhǔn)曲線是用葡萄糖位標(biāo)準(zhǔn)整理的，而蒽酮法是測總糖的量，包括己糖、戊糖，濃硫酸將淀粉、纖維素水解成的單糖，將總糖得出的OD值代入由單一糖做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，有一定誤差存在。注：查看所有文獻(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線都是用葡萄糖整理。2.誤差分析：（1）不同糖類與蒽酮試劑反應(yīng)的顯色程度不同。果糖最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖最淺造成誤差。（2）蒽酮試劑溶解度較低，非常容易析出，在反應(yīng)時加入糖的水溶液中，出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，影響反應(yīng)進(jìn)行。（3）介于以上原因，將上清5ml轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶定容，稀釋程度過大，當(dāng)糖含量少的時候，大的誤差可能會掩蓋真實的糖含量。造成品數(shù)據(jù)沒有實際意義。方案修改意見：首先，做五到六組空白，測試分光光度計誤差程度。增加平行組數(shù)，由三組增加至五組，減少每個樣品測試次數(shù)。改變測試樣品定容量，由100ml變?yōu)?0ml。

脯氨酸含量的測定茚三酮法1.1原理在正常環(huán)境條件下，植物體內(nèi)游離脯氨酸含量較低，但在逆境（干旱、低溫、高溫、鹽漬等）及植物衰老時，植物體內(nèi)游離脯氨酸含量可增加10-100倍，并且游離脯氨酸積累量與逆境程度、植物的抗逆性有關(guān)。用磺基水楊酸提取植物樣品時，脯氨酸游離于磺基水楊酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加熱處理后，溶液即成紅色，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波長下比色，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出（或用回歸方程計算）脯氨酸的含量。1.2步驟試劑：（1）25%茚三酮：茚三酮0.625g冰乙酸15ml6mol/L磷酸10ml70°（2）6mol/L磷酸：85%磷酸稀釋至原體積的2.3倍；（3）3%磺基水楊酸：磺基水楊酸3g加蒸餾水至100ml實驗步驟：（1）稱取0.1g樣品放入研缽，加5ml3%磺基水楊酸研磨成勻漿，100°C沸水浴15min；（2）冰上冷卻，4000rpm離心10min；（3）提取液2ml+冰醋酸2ml+25%茚三酮2ml混合均勻，100°（4）加4ml甲苯混合均勻，震蕩30s，靜置30min；（5）以甲苯為空白對照，再520nm下測定吸光值。計算方法脯氨酸含量（μg/gFW）＝X*提取液總量（ml）/樣品鮮重（g）*測定時提取液用量（ml）*10^6公式中：X從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的脯氨酸含量（μg）提取液總量5ml測定時提取液用量2ml

問題及質(zhì)疑：1.酸性體系下，脯氨酸與茚三酮加熱反應(yīng)后的最終產(chǎn)物為紅色，再實驗過程中，僅有少數(shù)時候能發(fā)現(xiàn)紅色產(chǎn)物。原因有待確定。2.經(jīng)查看文獻(xiàn)資料，反應(yīng)步驟已經(jīng)是優(yōu)化的，沒有問題。甲苯萃取脯氨酸與茚三酮的反應(yīng)產(chǎn)物，消除了多余未反應(yīng)的茚三酮，磺基水楊酸，提取液中其他雜質(zhì)（如色素）以及PH變化的干擾。3.根據(jù)茚三酮與脯氨酸的縮合反應(yīng)分析：（1）反應(yīng)體系的PH控制很重要，保持酸性環(huán)境，否則，反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸光值并不在520nm。（2）極限干旱材料或者重脫水材料的脯氨酸含量大，材料干重比新鮮材料多數(shù)倍，加相同量的茚三酮，反應(yīng)程度應(yīng)該有所不同。而脯氨酸含量少的樣本，容易受到各種因素的干擾。

丙二醛含量的測定原理植物在逆境下遭受傷害（或衰老）與活性氧積累誘發(fā)的膜脂過氧化作用密切相關(guān)，膜脂過氧化的產(chǎn)物有二烯軛合物、脂類過氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛（MDA）是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，因此可通過測定MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。丙二醛在高溫及酸性環(huán)境下可與2-硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)產(chǎn)生紅棕色的產(chǎn)物3,5,5′-三甲基惡唑2,4-二酮（三甲川），該物質(zhì)在532nm處有一吸收高峰，并且在660nm處有較小光吸收。由于醛、可溶性糖對此反應(yīng)有干擾，在450nm處有一吸收峰，用雙組分分光光度法加以排除。步驟試劑：（1）10%三氯乙酸（TCA）：TCA25g加ddH2O至250ml（2）0.6%硫代巴比妥（TBA）：TBA0.6g加5%TCA至100ml實驗步驟：（1）稱取材料0.1g，加10%TCA2ml研磨至勻漿，再加8ml進(jìn)一步研磨；（2）4000rpm離心10min，取上清至新管；（3）2ml提取液+2ml0.6%TBA，混合均勻，2mlddH2O+2ml0.6%TBA為空白對照；（4）混合沸水浴15min，冰上冷卻；（5）4000rpm離心10min；（6）取上清再532nm，600nm，450nm波長下的光密度值。計算方法式中，Vt：提取液總體積（mL）10ml；Vs：測定用提取液體積（ml）2ml；FW：樣品鮮重（g）0.1g。

注意事項：1．可溶性糖與TBA顯色反應(yīng)的產(chǎn)物在532nm也有吸收（最大吸收在450nm），當(dāng)植物處于極度干旱時可溶性糖含量會增高，必要時要排除可溶性糖的干擾。2．低濃度的鐵離子能增強(qiáng)MDA與TBA的顯色反應(yīng)，當(dāng)植物組織中鐵離子濃度過低時應(yīng)補(bǔ)充Fe3+（最終濃度為0.5nmol·L-1）3．如待測液渾濁，可適當(dāng)增加離心力及時間，最好使用低溫離心機(jī)離心。葉綠素含量的測定乙醇法原理葉綠素廣泛存在于綠色植物組織中，當(dāng)植物細(xì)胞死亡后，葉綠素即游離出來，游離葉綠素很不穩(wěn)定，對光、熱較敏感；高等植物中葉綠素有兩種：葉綠素a和b，兩者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。葉綠素的含量測定方法有分光光度法，利用分光光度計測定葉綠素提取液在最大吸收波長下的吸光值，即可用朗伯—比爾定律計算出提取液中各色素的含量。葉綠素a和葉綠素b在645nm和663nm處有最大吸收，且兩吸收曲線相交于652nm處。因此測定提取液在645nm、663nm、652nm波長下的吸光值，并根據(jù)經(jīng)驗公式可分別計算出葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量。步驟試劑：95%乙醇實驗步驟：（1）稱取樣品0.1g放入研缽，加3ml95%乙醇研磨至勻漿，再加7ml95%乙醇研磨至組織變白，避光；（2）4000rpm離心10min；（3）取上清5ml定容至25ml；（4）95%乙醇為空白對照，在645nm、663nm、652nm波長下測定光密度值。1.3計算方法D663=82.04Ca+9.27CbD645=16.75Ca+45.6Cb(濃度單位：g/mL）CA=12.72D663–2.59D645CB=22.88D645–4.68