本科生《》第五章目的基因制備與克隆策略

《PrincpleandTechnologyofGeneticEngineering》

《基因工程原理》Professor,Dr.Degang

Zhao(趙德剛)GuizhouKeyLaboratoryofAgriculturalBioengineering,

CollegeofLifeSciences,GuizhouUniversity

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第五章基因工程工具酶TheTooloftheGeneEngineering

教學(xué)目的與要求：1）掌握II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割原理，和部分常用識(shí)別位點(diǎn)。2）掌握常作DNA聚合酶的特性和用途。3）了解DNA連接酶和修飾酶在基因操作中的用途。2第一節(jié)目的基因的制備

3目的基因（TargetGene）：指基因工程中需要進(jìn)行制備、克隆或利用的基因。制備目的基因要根據(jù)需要獲得DNA片段，可能是啟動(dòng)子、終止子、內(nèi)含子，或者是編碼某種蛋白完整的序列。目的基因制備方法有直接分離法、基因文庫(kù)篩選法、PCR擴(kuò)增法以及化學(xué)合成法等。一、目的基因的直接分離法1．限制性核酸內(nèi)切酶酶切分離法這是最簡(jiǎn)單的獲取目的基因的方法，主要是從質(zhì)粒、病毒等比較簡(jiǎn)單的DNA分子或基因組中分離目的基因。無(wú)論是已知序列或是尚未測(cè)序的序列都可進(jìn)行分離，只要確定目的基因兩側(cè)的酶切位點(diǎn)，就可用相應(yīng)的酶進(jìn)行切割，獲得目的基因。42.基因分離的物理化學(xué)法其原理是根據(jù)基因的DNA分子兩條鏈GC含量差異較大，理化性質(zhì)、包括浮力密度和解鏈溫度明顯不同所采用相應(yīng)的方法進(jìn)行分離。（1）密度梯度離心法將DNA切割成適當(dāng)片段，富含GC的雙鏈DNA片段浮力密度大，利用密度梯度超速離心技術(shù)，可將DNA片段按不同密度大小分開(kāi)。（2）單鏈酶解法基因GC含量高（三個(gè)氫鍵），Tm值高，熱穩(wěn)定性高，可通過(guò)控制解鏈溫度使富含A=T區(qū)變性解鏈，GC區(qū)維持雙鏈狀態(tài)，再利用單鏈核酸酶S1酶切單鏈部分，獲得富含GC的基因片段。（3）分子雜交法利用DNA單鏈易與互補(bǔ)鏈形成雙鏈的原理，將已知基因DNA與目的生物的DNA進(jìn)行復(fù)性，再用單鏈核酸酶S1酶切除單鏈，留下的雙鏈即為目的基因序列53.雙抗體免疫法分離編碼蛋白基因

基因翻譯過(guò)程中，核糖體沿mRNA進(jìn)行多肽鏈合成時(shí)形成多聚核糖核蛋白體。利用多肽鏈制備的抗體及二抗，與多聚核糖核蛋白體一起溫育，目的基因的多聚核糖核蛋白體將通過(guò)抗原抗體反應(yīng)與相應(yīng)抗體形成復(fù)合物，利用不連續(xù)蔗糖梯度離心將此復(fù)合物分離出來(lái)，再通過(guò)酚/仿抽提法出去蛋白質(zhì)部分，過(guò)oligo-dT柱層析，即可分離出特定蛋白編碼的mRNA，反轉(zhuǎn)錄即可得到cDNA。目前，可用金黃色葡萄球菌中分離的proteinA代替二抗，再用proteinA-Sepharose4B作親和層析，分離出特定的多聚核糖體（代替密度梯度離心）。

64．利用酶促反轉(zhuǎn)錄直接從特定mRNA分離基因此法是在目的基因的mRNA占細(xì)胞中總mRNA量很大時(shí)采用，直接用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，與載體重組后導(dǎo)入受體菌擴(kuò)增，獲得目的基因的cDNA克隆。如哺乳動(dòng)物的網(wǎng)織紅細(xì)胞中珠蛋白mRNA占總mRNA的90%以上，用此法克隆了該基因。75．構(gòu)建基因文庫(kù)分離目的基因基因文庫(kù)分基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)?；蛭膸?kù)可用質(zhì)粒載體、噬菌體載體、柯斯質(zhì)粒（cosmid）載體和酵母人工染色體（YAC）載體進(jìn)行構(gòu)建。從基因組文庫(kù)可以分離獲得基因編碼序列、調(diào)控序列、啟動(dòng)子、終止子、核糖體識(shí)別mRNA序列、ARS、端粒序列、間隔序列等，可用于基因結(jié)構(gòu)分析、基因表達(dá)和調(diào)控研究等。cDNA文庫(kù)來(lái)自于模板mRNA的核苷酸序列，只能反映基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄及加工后mRNA產(chǎn)物所攜帶的信息，所以從cDNA文庫(kù)可以分離到基因的編碼序列。8篩選基因文庫(kù)的方法：①已知基因序列，可以人工合成核酸探針，通過(guò)核酸雜交，從基因文庫(kù)中篩選出含目的基因的克隆。②已分離純化某蛋白，并知其氨基酸序列，根據(jù)氨基酸序列合成寡聚核苷酸序列作為探針，篩選基因文庫(kù)。③已純化某蛋白，未能測(cè)出其氨基酸序列，可以該蛋白制備抗體，從cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選出含該蛋白編碼基因的克隆。④對(duì)編碼產(chǎn)物未知的基因，采用特殊分離方法如差別顯示技術(shù)、差減雜交法、遺傳互補(bǔ)法等。9遺傳互補(bǔ)法（功能互補(bǔ)法）原理：當(dāng)把一外源DNA片段引入一受體細(xì)胞后，如果受體細(xì)胞獲得某種新的性狀，那么此片段上攜帶著決定新性狀的遺傳基因。必備條件：外源基因不僅能在受體細(xì)胞表達(dá)，而且必須具備生物學(xué)活性。營(yíng)養(yǎng)缺陷型受體細(xì)胞+外源DNA→轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在合成培養(yǎng)基上→原養(yǎng)型細(xì)胞生長(zhǎng)受體細(xì)胞（無(wú)某種表型）+外源DNA→轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在特殊培養(yǎng)基上→具有新性狀細(xì)胞雖然有些受體細(xì)胞也能產(chǎn)生某種酶活性，但當(dāng)轉(zhuǎn)入目的基因后，該細(xì)胞可過(guò)量產(chǎn)生此酶活性，這亦可用于基因篩選。如釀酒酵母的MFα基因就是如此篩選到的。實(shí)例：基因組文庫(kù)DNA→轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞（leu2,Leu-）→轉(zhuǎn)化細(xì)胞（leu2/LEU2，Leu+）→LEU2基因基因組文庫(kù)DNA→轉(zhuǎn)化E.coli（無(wú)纖維素酶活性）→轉(zhuǎn)化細(xì)胞可在纖維素平板上形成水解圈→纖維素酶基因10核酸雜交法（同源序列克隆法）：（1)原理利用核酸探針與待分離DNA的同源序列可進(jìn)行雜交的特點(diǎn)分離目的基因。（2)核酸探針?lè)N類①DNA探針:分離自某一種生物。②寡核苷酸探針:根據(jù)目的基因編碼蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列推測(cè)，人工化學(xué)合成。如：Leu-Val-Phe-His-Asp-Ala六肽QUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCN對(duì)應(yīng)mRNAN：ACGT/UCAN-AAP-GTP-CTP-CG探針序列Q：CT/UP：AG32種14聚體的混合物，其中必有一種與待測(cè)DNA完全互補(bǔ)。cDNA探針:利用特異性mRNA反轉(zhuǎn)錄而成，亦可用不同mRNA混合物反轉(zhuǎn)錄而成。RNA探針:由T3或T7啟動(dòng)子和相應(yīng)聚合酶轉(zhuǎn)錄其下游基因片段而得。11分離步步驟：：基因因文庫(kù)庫(kù)→→制備備DNA樣樣品膜膜→與與標(biāo)記記探針針雜交交→→雜交交斑點(diǎn)點(diǎn)（陽(yáng)陽(yáng)性克克?。址蛛x重重組DNA分子子→→作作斑點(diǎn)點(diǎn)和Southern雜雜交以以確認(rèn)認(rèn)雜交交結(jié)果果→→DNA進(jìn)一一步證證實(shí)和和鑒定定：核核酸序序列分分析，，與蛋蛋白質(zhì)質(zhì)一級(jí)級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)比較較；分分離插插入片片段進(jìn)進(jìn)行基基因表表達(dá)，，用免免疫方方法或或其他他方法法檢測(cè)測(cè)表達(dá)達(dá)產(chǎn)物物。6．特特異性性DNA片片段(基因因)的的PCR擴(kuò)擴(kuò)增124．目目的基基因的的化學(xué)學(xué)合成成法（1））核酸酸片段段化學(xué)學(xué)合成成有磷酸酸二酯酯法、、磷酸酸三酯酯法和和亞磷磷酸三三酯法法，反反應(yīng)體體系有有液相相和固固相。。目前前常用用的方方法是是固相相亞磷磷酸三三酯法法。第第一個(gè)個(gè)核苷苷酸的的3`端通通過(guò)3`羥羥基與與惰性性固相相載體體上的的間隔隔臂形形成酯酯健，，寡核核苷酸酸按3`-5`方向向進(jìn)行行化學(xué)學(xué)合成成，正正常終終產(chǎn)物物是3`、、5`端均均帶有有羥基基的寡寡聚核核苷酸酸。合成原原料：：經(jīng)化化學(xué)修修飾的的核苷苷—亞亞磷酰酰胺。。有兩兩種類類型：：①甲甲基基化亞亞磷酰酰胺；；②??-氰乙乙基-亞磷磷酰胺胺。合合成時(shí)時(shí)要對(duì)對(duì)羥基基、磷磷酸、、氨基基進(jìn)行行保護(hù)護(hù)，合合成結(jié)結(jié)束后后，去去掉所所有保保護(hù)基基團(tuán)。。固相載載體：：是對(duì)對(duì)DNA合合成試試劑惰惰性的的物質(zhì)質(zhì)，目目前采采用可可控孔孔徑的的玻璃璃沙（（CPG））,其其表面面的硅硅氧烷烷鍵可可與A、G、C、T核苷苷的3`-羥基基以酯酯鍵連連接，，該鍵鍵可用用29%濃濃氨水水打斷斷。13反應(yīng)分分四步步：1）二甲氧氧三苯苯甲基基（DMT，羥羥基保保護(hù)基基團(tuán)））的脫脫除用用三氯氯乙酸酸（TCA）或或二氯氯乙酸酸（DCA）處處理，，脫去去連在在固相相載體體上的的核苷苷酸或或寡核核苷酸酸5`羥基基的DMT保護(hù)護(hù)基團(tuán)團(tuán)。2）偶偶聯(lián)反反應(yīng)（（縮合合反應(yīng)應(yīng)，加加成反反應(yīng)））由由溶溶于無(wú)無(wú)水乙乙腈中中的四四唑催催化，，使亞亞磷酰酰胺單單體的的3`磷酸酸基團(tuán)團(tuán)與固固相載載體上上的5`羥羥基發(fā)發(fā)生反反應(yīng)，，形成成亞磷磷酸三三酯鍵鍵。3）封封閉反反應(yīng)加加成反反應(yīng)剩剩下的的亞磷磷酰胺胺，以以N-甲基基瞇唑唑催化化，用用乙酸酸酐使使羥基基乙酰?；?，，封閉閉其羥羥基，，防止止在下下一循循環(huán)中中發(fā)生生加成成反應(yīng)應(yīng)。4）氧氧化反反應(yīng)在在堿性性條件件下，，以碘碘使加加成反反應(yīng)形形成的的3`，5`亞亞磷酸酸三酯酯鍵氧氧化為為穩(wěn)定定的5價(jià)磷磷酸三三酯。。上述每每循環(huán)環(huán)一次次，增增加一一個(gè)核核苷酸酸，需需7~9min。每每一步步反應(yīng)應(yīng)完成成都以以乙腈腈清洗洗，氬氬氣吹吹干，，保證證無(wú)水水環(huán)境境。合合成反反應(yīng)結(jié)結(jié)束后后，除除去保保護(hù)基基團(tuán)，，29%濃濃氨水水處理理使寡寡聚核核苷酸酸從載載體上上釋放放出來(lái)來(lái)，乙乙醇或或異丙丙醇沉沉淀、、回收收DNA。。用RNA亞亞磷酸酸胺單單體和和聚苯苯乙烯烯固相相載體體，合合成RNA。14（2））化學(xué)學(xué)合成成DNA片片段種種類①DNA互互補(bǔ)鏈鏈合成成引物物包包括PCR引物物和測(cè)測(cè)序引引物。。②DNALinker預(yù)預(yù)先先設(shè)計(jì)計(jì)，通通過(guò)化化學(xué)合合成的的寡聚聚核苷苷酸片片段，，含有有1種種或幾幾種酶酶切位位點(diǎn)，，酶切切可產(chǎn)產(chǎn)生粘粘性末末端。。如果果將含含有多多個(gè)酶酶切位位點(diǎn)的的Linker引引入克克隆載載體中中，就就會(huì)形形成多多克隆隆位點(diǎn)點(diǎn)（MCS），，這種種具有有多克克隆位位點(diǎn)的的連桿桿稱MCSLinker。。③Adaptor是是一種化學(xué)學(xué)合成的寡寡聚核苷酸酸，含有一一種以上的的內(nèi)切酶位位點(diǎn)。其與與Linker的差差別是Adaptor一端或或兩端已有有1種或兩兩種內(nèi)切酶酶切割產(chǎn)生生的粘性末末端。④DNA芯片片 指DNA片段以以事先設(shè)計(jì)計(jì)的排列方方式固定在在載波片或或尼龍膜上上組成的密密集分子排排列。固定定的是探針針，或者是是靶DNA分子。15（3）目的的基因的化化學(xué)合成法法1979年年，Khorana等首次化化學(xué)合成基基因有生物物活性。有有全片段酶酶促連接法法和酶促填填充法。165．利用表表達(dá)序列克克隆目的基基因（1）表達(dá)達(dá)序列標(biāo)簽簽法分離目目的基因Expressedsequencetag，簡(jiǎn)稱稱EST：指基因序序列中一段段能特異地地標(biāo)記或表表征基因的的序列，通通常它含有有足夠的結(jié)結(jié)構(gòu)信息以以顯示出該該基因與其其他基因的的差異，長(zhǎng)長(zhǎng)度一般為為100~500bp。利利用EST尋找新基基因的策略略即為表達(dá)達(dá)序列標(biāo)簽簽法（ESTs）。。最早由M.D.Adam在1991年建建立并加以以應(yīng)用，有有的文獻(xiàn)稱稱之為cDNA測(cè)測(cè)序法?；静襟E如下下：①?gòu)慕M織特特異性或細(xì)胞胞特異性的cDNA文庫(kù)庫(kù)中隨機(jī)挑選選克隆，進(jìn)行行5‘端和3’端部分序序列（約400bp））的測(cè)定。。②通過(guò)對(duì)對(duì)GenBank、EMBL或其他他核苷酸序列列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行行聯(lián)機(jī)檢索，，可以檢測(cè)出出所測(cè)定序列列及其對(duì)應(yīng)的的多肽氨基酸酸序列。將檢檢測(cè)的序列與與基因庫(kù)中已已知基因進(jìn)行行同源比較，，可檢測(cè)到已已知基因和未未知基因。③③通過(guò)基因因文庫(kù)的篩選選或基因定位位的方法分離離目的基因。。表達(dá)序列標(biāo)簽簽法分離目的的基因有時(shí)可可以從幾個(gè)不不同基因的高高度保守區(qū)得得到相同的cDNA片斷斷，有時(shí)一個(gè)個(gè)較大的基因因不同外顯子子又能表現(xiàn)為為若干不同的的cDNA。。17（2）計(jì)算機(jī)機(jī)克隆(siliconcloning)或或生物信息學(xué)學(xué)(bioinformatics)克隆新基基因策略生物信息學(xué)克克隆新基因策策略是表達(dá)序序列標(biāo)簽法的的延伸和發(fā)展展。生物信息息學(xué)與計(jì)算機(jī)機(jī)科學(xué)、信息息學(xué)等學(xué)科相相互交叉而誕誕生的一門(mén)新新興學(xué)科，核核心內(nèi)容是通通過(guò)對(duì)生物學(xué)學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的的獲取、加工工、存儲(chǔ)、檢檢索與分析，，進(jìn)而達(dá)到揭揭示數(shù)據(jù)所蘊(yùn)蘊(yùn)含的生物學(xué)學(xué)意義的目的的。做法：利用已發(fā)現(xiàn)的的其他物種基基因的cDNA序列為參參照，在國(guó)際際互聯(lián)網(wǎng)的EST數(shù)據(jù)庫(kù)庫(kù)（GebBank或EMBL等））中進(jìn)行同源源搜索，獲得得一系列同源源的或部分重重疊的EST序列，然然后用GCG、DNAstar軟軟件中的alignment程序序?qū)⑺鼈兤唇咏映梢粋€(gè)EST重疊群群(contig)，經(jīng)經(jīng)過(guò)逐步延伸伸（cDNAsalking)及及整合后可獲獲得全長(zhǎng)的cDNA序序列；根據(jù)該該推測(cè)的序列列，可合成相相應(yīng)的特異引引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增增后，即可獲獲得該基因的的cDNA片片斷。局限性：難以尋找到一一些表達(dá)量極極低或者不表表達(dá)的新基因因類型，克隆隆基因的功能能也有待鑒定定。18（3）基因表表達(dá)系列分析析法基因表達(dá)系列列分析法(serialanalysisofgeneexpression,簡(jiǎn)簡(jiǎn)稱SAGE)可一次對(duì)大大量基因轉(zhuǎn)錄錄產(chǎn)物進(jìn)行定定量分析，從從中找出新的的基因。原理（兩個(gè)）：①①?gòu)霓D(zhuǎn)錄物物某一特定位位置上分離得得到一段9~10bp的的寡核苷酸酸序列標(biāo)簽(sequencetag,ST)，它含含有確定的一一個(gè)獨(dú)特轉(zhuǎn)錄錄物的足夠信信息量，可代代表此轉(zhuǎn)錄物物的特異性。。理論上隨機(jī)機(jī)排列的9bp片斷可區(qū)區(qū)分262144（49）種轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄物，人類類的基因約僅僅有80000個(gè)轉(zhuǎn)錄錄子，因此，，9個(gè)核苷酸酸序列可以代代表所有轉(zhuǎn)錄錄子的特征。。②多個(gè)序序列標(biāo)簽（ST）能以錨錨定酶(anchoringenzyme,AE，，識(shí)別位點(diǎn)為為4堿基的限限制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶)識(shí)別別位點(diǎn)序列相相隔相互連成成雙標(biāo)簽序列列(ditag)的多聯(lián)聯(lián)體，將該多多聯(lián)體序列克克隆到一個(gè)載載體中，用連連續(xù)的方法進(jìn)進(jìn)行多聯(lián)體序序列分析，再再通過(guò)計(jì)算機(jī)機(jī)處理，確定定每一種序列列（ST）代代表轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物物的種類和出出現(xiàn)頻率，由由此實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄物的高效效、快速和大大量的分析。。196．篩選目的的基因片斷的的差別雜交及及減法雜交技技術(shù)（1）差別雜雜交法差別雜交（differentialhybridization）或稱為差差別篩選(differentialscreening)法，特別適用于分分離在特定組組織中、發(fā)育育的特定階段段表達(dá)的基因因以及受生長(zhǎng)長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的的基因，亦可可有效地用來(lái)來(lái)分離經(jīng)特殊殊處理誘導(dǎo)表表達(dá)的基因。。方法是分別制制備兩種不同同細(xì)胞群體的的mRNA提提取物，其其中一個(gè)群體體含有一定比比例的目的基基因mRNA，另一個(gè)群群體不含有目目的基因mRNA。以這這兩種總mRNA（或是是它們的cDNA拷貝貝）為探針，，分別對(duì)由表表達(dá)目的基因因的細(xì)胞群體體構(gòu)件的cDNA文庫(kù)進(jìn)進(jìn)行篩選。20（2）減法雜雜交技術(shù)減法雜交（subtractivehybridization）又叫做差差減雜交克隆隆、扣除雜交交、減數(shù)雜交交或消減雜交交等，該技術(shù)術(shù)是通過(guò)DNA復(fù)性動(dòng)力力學(xué)原理富集集目的基因序序列，并以此此構(gòu)建減數(shù)文文庫(kù)(subtractivelibrary)的方式式來(lái)進(jìn)行目的的基因克隆。。減法雜交的的對(duì)象可以是是DNA，也也可以是cDNA，相相應(yīng)地稱為基基因組DNA減法雜交交和mRNA減法雜交。。后者分析差差異表達(dá)的基基因，適于某某些低豐度mRNA的cDNA克克隆。mRNA減法法雜交原理：：從表達(dá)目的基基因的組織中中提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄錄為cDNA，然后與無(wú)無(wú)目的基因表表達(dá)的組織中中提取mRNA做過(guò)量雜雜交，在兩種種組織中均表表達(dá)的基因產(chǎn)產(chǎn)物形成cDNA/mRNA雙鏈鏈雜交分子，，而特異mRNA反轉(zhuǎn)錄錄的cDNA片段仍保持持單鏈狀態(tài)，，將這種單鏈鏈cDNA分分離出來(lái)即為為差異表達(dá)的的序列。21（3）基因表表達(dá)系列分析析法基因表達(dá)系列列分析法(serialanalysisofgeneexpression,簡(jiǎn)簡(jiǎn)稱SAGE)可一次對(duì)大大量基因轉(zhuǎn)錄錄產(chǎn)物進(jìn)行定定量分析，從從中找出新的的基因。原理（兩個(gè)）：①①?gòu)霓D(zhuǎn)錄物物某一特定位位置上分離得得到一段9~10bp的的寡核苷酸酸序列標(biāo)簽(sequencetag,ST)，它含含有確定的一一個(gè)獨(dú)特轉(zhuǎn)錄錄物的足夠信信息量，可代代表此轉(zhuǎn)錄物物的特異性。。理論上隨機(jī)機(jī)排列的9bp片斷可區(qū)區(qū)分262144（49）種轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄物，人類類的基因約僅僅有80000個(gè)轉(zhuǎn)錄錄子，因此，，9個(gè)核苷酸酸序列可以代代表所有轉(zhuǎn)錄錄子的特征。。②多個(gè)序序列標(biāo)簽（ST）能以錨錨定酶(anchoringenzyme,AE，，識(shí)別位點(diǎn)為為4堿基的限限制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶)識(shí)別別位點(diǎn)序列相相隔相互連成成雙標(biāo)簽序列列(ditag)的多聯(lián)聯(lián)體，將該多多聯(lián)體序列克克隆到一個(gè)載載體中，用連連續(xù)的方法進(jìn)進(jìn)行多聯(lián)體序序列分析，再再通過(guò)計(jì)算機(jī)機(jī)處理，確定定每一種序列列（ST）代代表轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物物的種類和出出現(xiàn)頻率，由由此實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄物的高效效、快速和大大量的分析。。第二節(jié)目的的基因克隆沒(méi)有任何一種種克隆方法能能夠涵蓋所有有好處，克隆步驟：1）克隆一個(gè)個(gè)基因的方法法：cDNA合成限制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶消化機(jī)械剪切Mechanicalshearing2）加到載體體上：選擇寄寄主和載體系系統(tǒng)平末端連接Blunt-endligation使用連接頭Useoflinkermolecules粘性末端連接接Ligationofcohesivetermini同聚物尾巴Homopolymertailing3）IntroducingtherecombinantDNAintoahostcell：：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化化TransformationwithrecombinantplasmidDNA重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)染TransfectionwithrecombinantphageDNADNA體外包包裝PackagingDNAinvitroChapter6第二節(jié)目的的基因克隆ThereisnosinglecloningstrategythatwillcoverallrequirementsA.GenerationofgenefragmentB.JoiningtoavectorC.IntroducingtherecombinantDNAintoahostcellcDNAsynthesisRestrictionenzymedigestionMechanicalshearingChoosethehost/vectorsystemBlunt-endligationUseoflinkermoleculesHomopolymertailingLigationofcohesiveterminiTransformationwithrecombinantplasmidDNATransfectionwithrecombinantphageDNAPackagingDNAinvitrocDNAsynthesisRestrictionenzymedigestionMechanicalshearingDirectChemicalsymthesisPackagingDNAinvitroTransformationwithRecombinantPlasmidDNATranfectionwithRecombinantPhageDNABlunt-endligationUseoflinkermoleculesHomopolyertailingLigationofCohesiveterminiGenerationofgenefragmentChoosethehost/vectorsystemIntroducingtherecombinantDNAintoahostcellChapter6★看家基因（Housekeepinggenes）：又稱管家基基因或持家基基因：在所有有細(xì)胞中均要要表達(dá)的一類類基因，其產(chǎn)產(chǎn)物對(duì)維持細(xì)細(xì)胞的基本結(jié)結(jié)構(gòu)和代謝功功能是必不可可少（forbasiccellularmetabolism），表達(dá)達(dá)水平受環(huán)境境因素影響較較小，在各生生長(zhǎng)階段的大大多數(shù)、或幾幾乎全部組織織中持續(xù)表達(dá)達(dá)，或變化很很小。表達(dá)只只受啟動(dòng)序列列或啟動(dòng)子與與RNA聚合合酶相互作用用的影響，而而不受其他機(jī)機(jī)制調(diào)節(jié)。如如微管蛋白基基因、糖酵解解酶系基因與與核糖體蛋白白基因等Housekeepinggenes:forbasiccellularmetabolism★每一個(gè)細(xì)胞都都會(huì)生產(chǎn)大量量的特殊的mRNAPoly(A)+RNA:eachcelltypeproducedifferentabundanceclassesofparticularmRNAs.一、CloningfrommRNAChapter6★cDNA:complementaryDNA(copyDNA),poly(A)+RNAastempleReversetranscriptase=RTaseOligo(dT)primerAlkalinehydrolysis(orRNaseH)toremovemRNAstrandT4DNApolymerase,klenowfragmentS1nucleasetoproduceablunt-ended一、CloningfrommRNAChapter6mRNAAAAAAA-3’5’Chapter6RTaseHO-TTTTTT-5’’AAAAAA-3’TTTTTT-3’TTTTTT-3’NaOHOHsscDNADNApolymeraseKlenowfragmentTTTTTT-3’S1nucleasedscDNASynthesisofcDNAmRNAAAAAAACCCC-3’’5’TTTTTT-5’’TTTTTT-5’AlkalinesucrosegradientdscDNAAAAAAA-3’5’TTTTTT-5’cDNA3’CTerminaltransferase+dCTP3’-CCCCCCRTaseTTTTTT-5’3’-CCCCCC5’-GGGGGGAddoligo(dG)primerChapter6Oligo（（dG）-primedsecond-strandcDNAsynthesisCCCC3’-C★blunt-endligation:S1nucleasedestroytheprotrudingendsofDNA;DNApolymerase(klenowfragment)fillingtheprotrudingendsofDNA.Maindisadvantage:1)isaninefficientprocess,requirehighconcentrationDNAforligation;2)vectorself-ligatetoproducecircularmoleculesortheinsert/vectorDNAsmayformconcatemersinsteadofbimolecularrecombinants,usephoshpatase(eitherBAPorCIP)topreventself-ligation;3)cloningsitedisappearintherecombinantDNA2CloningcDNAinplasmidvectorsTwomethods:1)Ligationofblunt-end2)Ligationofcohesivetermini

a.Useoflinkermoleculesb.HomopolymertailingCCGAATTCGGGGCTTAAGCCLinkers:areself-complementaryoligomersthatcontainarecognitionsequenceforaparticularrestrictionenzyme.DNAligaseCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCC5’-AATTCGGGCCCCGGGCTTAA-5’’EcoRI＋Adaptors:aresingle-strandednon-complementaryoligomersthatmaybeusedinconjunctionwithlinkers,whenannealedtogetherandbeaddedtothecDNAtoprovidesticky-endcloningwithoutdigestionofthelinkers.OH-GATCCCCGGGDNAligaseCCCGGGGGGCCCCTAG-OH-5’GGGCCCGGATCCCCTAGGBamHI+OH-GATCCCCGGGGGGCCC5’-OH-GATCCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCHpaIIHomopolymertailing:theenzymeterminaltransferaseisusedtoaddhomopolymersofdA,dT,dGordCtoaDNAmolecule.PstIvectorCCCCCCCC-3’3’-CCCCCCCCInsertCTGCAGGGGGGGG-3’G3’-GGGGGGGGACGTCGPstIsiteGGGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGGGGACGT

TGCAGCCCCCCCCCCCCCCCCPstIsiteEnzymedigestionTerminaltransferase+dCPstIdigestionTerminaltransferase+dGDNAligaseTargetgene★Mainadvantage:1)packaginginvitromaygeneratetherecombinantphage,whichincreasestheefficiencyofthecloningprocess.2)mucheasiertostoreandhandlelargenumbersofphageclonesthanplasmids.3CloningcDNAinbacteriophagevectorsIfalargenumberofrecombinantswasrequired,andalow-abundancemRNAwastobecloned,phagevectorsmaybemoresuitable.CloningcDNAinλvectorsusinglinkers:EcoRImethylaseCCGAATTCGGGGCTTAAGCCAddEcoRIlinkersdscDNAMeMeCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCDigestwithEcoRILigateInsertvectorvectorLAλvectorRA★genomiclibrary:isoftenusedtodescribeasetofclonesrepresentingtheentiregenomeofanorganism.TodeterminetheintronsToexaminethecontrolsequencesresponsibleforregulatinggeneexpression二、CloningfromgenomicDNA1Genomiclibraries★aimofconstructingagenomiclibraryisforisolatingatargetDNAsequence.★Clonebank(library):Acollectionofindependentclonesistermedaclonebankorlibrary估計(jì)基因因組文庫(kù)庫(kù)大小的的經(jīng)驗(yàn)（（empiricalformula））公式：：N=ln(1-P)/ln(1-a/b)N:thenumberofclonesrequiredP:desiredprobabilityofaparticularsequencebeingrepresented(0.95or0.99)a:theaveragesizeoftheDNAfragmenttobeclonedb:thesizeofthegenomeorganismGenomeSize(kb)No.clonesN,P=0.9520kbinserts45kbinsertsEscherichiacoli(bacteria)4.0×1036.0×1032.7×103Saccharomycescerevisiae(yeast)1.4×1042.1×1039.3×102Arabidopsisthaliana(simpleplant)7.0×1041.1×1044.7×103Drosophilamelanogaster(fruitfly)1.7×1052.5×1041.1×104Stroglyocentrotus

purpuratus(seaurchin)8.6×1051.3×1055.7×104Homosapiens(human)3.0×1064.5×1052.0×105Triticumaestivum(hexaploidwheat)1.7×1072.5×1061.1×106Geneticlibrarysizesforvariousorganisms選擇哪種種載體用用于基因因組文庫(kù)庫(kù)構(gòu)建？？Whichvectorisusedtochooseforconstructionofgeneticlibrary?λphagevector：：有效容容納量是是15kbcosmidvector：有效效容納量量是45kb建立基因因組文庫(kù)庫(kù)的一般般程序：：1．載體體DNA片段的的制備載體DNA分離離純化限限制酶切切脫脫磷酸化化反應(yīng)3.供供體與載載體DNA連接接提高重組組頻率，，應(yīng)注意意連接反反應(yīng)體系系中總DNA濃濃度和兩兩種DNA分子的的摩爾數(shù)數(shù)比率。。2．供供體DNA片段段的制備備機(jī)械剪切切法總DNA分離純純化分分離特定定大小DNA片片段酶法（部分酶酶切、完完全酶切切）4.重重組DNA分子子的轉(zhuǎn)移移和基因因組文庫(kù)庫(kù)的擴(kuò)增增利用轉(zhuǎn)化化或感染染方法將將連接好好的重組組DNA分子導(dǎo)導(dǎo)入宿主主細(xì)胞，，讓其自自主復(fù)制制，重組組DNA分子被被擴(kuò)增（（重組子子比率可可能發(fā)生生變化））。5.基基因組文文庫(kù)質(zhì)量量的評(píng)價(jià)價(jià)1）文庫(kù)庫(kù)規(guī)模----隨機(jī)挑挑取一些些轉(zhuǎn)化子子或重組組子，提提取質(zhì)粒粒DNA，，電泳測(cè)測(cè)定插入入片段大大小，然然后根據(jù)據(jù)上述公公式計(jì)算算文庫(kù)大小。。2）重組組頻率----頻率越越高，質(zhì)質(zhì)量越高高，可大大大減輕輕后續(xù)篩選基因因工作量量。CloningDNAinλvectorsusinglinkers:CCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCInsertvectorvectorCloningDNAinλvectorsusinglinkers:CCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCInsertvectorvectorThemolecularweightoftheDNAafterisolationfromtheorganism.ThemethodusedtofragmenttheDNA.文庫(kù)的連連接、包包裝和擴(kuò)擴(kuò)增TwomainconsiderationwhenpreparingDNAfragmentforcloning:Foracompletelyrandomlibrary,DNAmolecularweightshouldbeveryhigh.★100kbisavailable.★Fragmentationcanbeachievedeitherbymechanicalshearingorbypartialdigestionwitharestrictionenzyme.CTAGAnnealBamHISau3AGCCTAGGATCCGGATCCTAGGATCGCCTAGGATCCTAGGATCCGCloningSau3AfragmentsintoBamHIsite5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHI

5’-NGATCN-3’3’-NCTAGN-5’Sau3AEBSEBSEMBL4LeftarmRightarmSSLeftarmRightarmS/BS/BGATCCTAGGATCCTAGLigationofSau3A––cutDNAintotheλreplacementvectorEMBL45’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHI

5’-NGATCN-3’3’-NCTAGN-5’Sau3AEMBL4

GATCCTAGGATCCTAGEBSEBSLeftarmRightarmStufferfragmentSSLeftarmS/BGATCCTAGGATCCTAGS/BRightarmInsertDNASau3AcohesiveendSau3Acohesive

endLigationofSau3A-cutDNAintotheλreplacementvectorEMBL4GATCCTAGGATCCTAGcoscosInsertInsertInsertcoscosLALALARARAPackagedinvitroConcatemericrecombinantDNAPrimarylibraryAmplificationoflibraryPlatingthepackagedphageonasuitablehostofE.coli,thenresuspendingtheplaquesbywashingtheplateswithabuffersolutionConcatemericrecombinantDNAandamplificationoflibrary4.更更先進(jìn)的的克隆技技術(shù)Advancedcloningstrategies1)SynthesisandcloningofcDNAOkayama–Berg法法1）T引引物的合合成：在在質(zhì)粒上上進(jìn)行，，用于合合成第一一條cDNA鏈鏈2）G引引物的合合成：在在質(zhì)粒上上進(jìn)行，，用于合合成第二二條cDNA鏈鏈3）第一一條cDNA鏈鏈合成：：T引物物與mRNA退退火反反轉(zhuǎn)錄錄反應(yīng)4）第二二條cDNA鏈鏈的合成成：a.第一條cDNA鏈3’’-末端端加尾（（dCTP）b.限制酶切切除去載體上所所加的多多聚C尾尾巴c.與G引物物退火d.除去RNAe.合成第二二條cDNA鏈鏈5）cDNA文文庫(kù)的形形成—轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化2)ExpressionofclonedDNAmoleculesPromoter（啟啟動(dòng)子））:areregionswithaspecificbasesequence,towhichRNApolymerasewillbind.Strongpromoter:強(qiáng)啟啟動(dòng)子Weakpromoter:弱弱啟動(dòng)子子Induciblepromoter:誘導(dǎo)導(dǎo)型啟動(dòng)動(dòng)子在原核生生物中（（Inprokaryoticpromoter））：Consensussequence:Inprokaryoticpromoter,twomainregionsisimportant:-10region=Pribnowbox:5’-TATAAT-3’’-35region:5’TTGACA-3’真核生物物中（Ineukaryoticpromoter）:Enhancers（（增強(qiáng)子子）:maybelocatedhundredsorthousandsofbase-pairsupstreamfromtheTcstartsite.-25position：：CAATbox.Around-25positionwiththeconsensussequence5’-TATAAAT-3’(theTATAorHognessbox)andasequenceinthe-75regionwiththeconsensus5’-GG(T/C)CAATCT-3’,knownastheCAATbox.EcoRISacIPstIHindIII1）SacI2）TdT+dTTPEcoRISacITTTTTHindIIITTTTTAAAAAmRNAAMV-RT+dNTPTTTTTTTTTTAAAAATdT+dCTPTTTTTAAAAATTTTTCCCCEcoRISacIPstIHindIIICCCC1）HindIII2）取大片片段TTTTTCCCCSacIHindIIIPstI1)PstI2)TdT+dGTPEcoRIGGGGHindIIIGGGGPstISacI1）HindIII2）取小片片段HindIIIGGGGBAC:bacterialartificialchromosomesYAC:yeastartificialchromosomesCloninglargeDNAfragmentsinBACandYACTELTELtrp/ARS/CENYACuraCloninginaYACvectorHighmolecularweightgenomicDNAPartialdigestUpto500kb1.兩臂臂DNA片片段的制備備:pYAC4BamHI/EcoRI脫脫磷酸化化2.供體體DNA片片段的制備備:瓊脂糖凝膠膠-DNA樣品的制制備EcoRI部分酶酶切脈脈沖場(chǎng)場(chǎng)凝膠電泳泳片片段回收收和純化3.DNA的連連接4.重組組DAN分分子的轉(zhuǎn)化化:原生質(zhì)體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法5.轉(zhuǎn)化化子的保存存:單菌落保存存于96孔孔平板中利用YAC載體構(gòu)建建基因組文文庫(kù)酵母人工染染色體構(gòu)建建（4）SMART(SwitchMechanismAtthe5’endofRNATemplates)1)當(dāng)反反轉(zhuǎn)錄酶合合成到mRNA模板板5’端后后，它會(huì)在在第一鏈的的3’端加加上幾個(gè)C；2)合成成的寡核苷苷酸G與C配對(duì)；3)反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶以新新合成的cDNA為為模板，繼繼續(xù)合成第第二條cDNA鏈；；4)LDPCR—LongDistancePCR1.基因因特異性常來(lái)自結(jié)構(gòu)構(gòu)基因，因因此僅代表表某種生物物的一小部部分遺傳信信息，且只只代表那些些正在表達(dá)達(dá)的基因的的遺傳信息息：1—5%mRNA，80—85%rRNA，10—15%tRNA2.器官官特異性不同器官或或組織的功功能不一樣樣，因而有有的結(jié)構(gòu)基基因的表達(dá)達(dá)就具有器器官特異性性，故由不不同器官提提取的mRNA所組組建的cDNA文庫(kù)庫(kù)也就不同同cDNA文文庫(kù)的特點(diǎn)點(diǎn)4.不均均勻性在同一個(gè)cDNA文文庫(kù)中，不不同類型的的cDNA分子的數(shù)數(shù)目是大不不相同的，，盡管它們們都是由單單拷貝基因因轉(zhuǎn)錄而來(lái)來(lái)的。這與與基因組文文庫(kù)中的單單拷貝基因因均具有相相同的克隆隆數(shù)相較，，這是兩種種文庫(kù)的另另一差別。。5.各各cDNA均可獲得得表達(dá)（一一般選用的的載體都是是表達(dá)型的的）3.代謝謝或發(fā)育特特異性處于不同代代謝階段（（或發(fā)育階階段）的結(jié)結(jié)構(gòu)基因表表達(dá)亦不相相同1.限制性核酸酸內(nèi)切酶三三種類型的的特點(diǎn)？為為什么基因因工程中需需選II型酶。2.TypeIIrestrictionendonucleases的命名原則則。（EcoRI）3.酶活性單位位定義？4.Bal31、ExoIII、DNaseI，酶的作用用特點(diǎn)。5.反轉(zhuǎn)錄酶。。6.BAP和CIP分別指什么么酶，作用用特點(diǎn)是什什么？。7.DNALigase的特點(diǎn)。8.DNApolymerase與DNALigase的異同點(diǎn)？？思考題：9.AfragmentofmouseDNAwithEcoRIstickyendscarriesthegeneM.ThisDNA,whichis8kblong,isinsertedintothebacterialplasmidpBR322attheEcoRIsite.therecombinantplasmidiscleavedwithtwodifferentrestrictionenzyme.Thesizefragmentsthatwereobtainedonanagrosegelareistedbelow.Drawtherestrictionmapforthissequence.EcoRIBamHIEcoRI+BamHI2.5kb1.0kb思考題：TheEndThankYou!9、靜夜夜四無(wú)無(wú)鄰，，荒居居舊業(yè)業(yè)貧。。。12月月-2212月月-22Saturday,December24,202210、雨中中黃葉葉樹(shù)，，燈下下白頭頭人。。。09:57:1709:57:1709:5712/24/20229:57:17AM11、以我獨(dú)沈沈久，愧君君相見(jiàn)頻。。。12月-2209:57:1709:57Dec-2224-Dec-2212、故人江海海別，幾度度隔山川。。。09:57:1709:57:1709:57Saturday,Decembe