翻譯1-黑米中豐富的花色苷提取物對大鼠的慢性酒精性肝損傷的作用

黑米中豐富的花色苷提取物對大鼠的慢性酒精性肝損傷的作用侯召華，裴友秦，桂興任作物科學(xué)*研究所中國北京海淀區(qū)100081，中國科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所學(xué)院南路80號摘要：該研究評估了從黑米中萃取的豐富花青素(AEBR)對用慢性乙醇誘導(dǎo)的雄性Wistar大鼠體內(nèi)產(chǎn)生的化學(xué)變化。對雄性大鼠用乙醇（3.7g/kg/day）誘導(dǎo)45天，觀察其對肝臟的損害，伴隨著大鼠血清內(nèi)天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST），丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT），γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）和肝臟丙二醛（MDA）水平的明顯增加（P<0.05）。與此相反，在酒精中加入AEBR（500mg/kg），有效降低了血清中肝酶（AST，ALT和GGT）的活力，以及MDA水平及血清濃聚物和肝臟甘油三酯（甘油三酯）和總膽固醇（TCH）。用黑米色素處理大鼠顯示了抗氧化系統(tǒng)在正常谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px），超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）的活性下更好的一面。所有的這些結(jié)果都是、附有肝組織學(xué)觀察的。結(jié)果表明，AEBR能有效減輕酒精的危害。關(guān)鍵詞：黑米，大量花色素提取物，肝損傷，大鼠，乙醇引言花青素是一組植物色素，廣泛分布于鮮花，水果和谷物中，并促成這些植物鮮艷的顏色成分（綠色，紅色和藍色）。作為一種類黃酮色素，花青素不僅能作為著色劑，而且最重要的是對健康的作用。因為它們無毒性和非誘變性，能抗氧化。因此，花青素已被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)和人類健康行業(yè)。最近幾年，花青素的“健康普及”活動已經(jīng)引起關(guān)注。作為人類飲食中的豐富成分（新鮮水果，果汁，酒，谷物），花青素應(yīng)經(jīng)被證明具有消炎作用和抗氧化活性。通過花青素在全身體液中循環(huán)能減輕氧化對身體的負擔(dān)，從根本上降低氧化引起疾病惡化的危險。黑米（水稻粳稻），作為一個特殊的含豐富花青素水稻栽種品種，已被視為促進健康的食品，并在東亞地區(qū)廣泛食用。以往的研究表明，在兩種不同類型動物中，黑米色素的小部分成分能夠顯著的降低氧化負擔(dān)，改善和調(diào)節(jié)血脂動脈粥樣硬化的損傷。從黑米中提取的豐富花青素天然抗氧化劑能夠幫助減輕酒精引起的肝臟病理變化。一些物質(zhì)會使肝臟遭嚴(yán)重和潛在的致命傷害，包括鬼筆環(huán)肽，四氯化碳（CCl4），半乳糖胺，乙醇等其他化合物。長期食用酒精因為氧化強化劑和抗氧化系統(tǒng)失去平衡而在肝臟中產(chǎn)生氧化壓力。肝臟對乙醇毒性的敏感性促使酒精性肝損傷，而保護藥物的療效本質(zhì)上是依靠其減少有害影響或維持細胞和組織的正常生理的能力。近年來，測試了用各種抗氧化劑和不同的飲食來緩解因濫用酒精引起的氧化壓力。本文研究的目的是探討黑米提取的豐富花青素對大鼠中酒精性肝損傷的作用。材料與方法動物:試驗中使用雄性Wistar大鼠（150g±20g）。動物是在動物房間內(nèi)12h光照-黑夜循環(huán)（光7:00-19:00），溫度保持22℃±2℃，濕度70％±4％，并自由獲取食物和水的標(biāo)準(zhǔn)條件下存放。以下實驗，符合歐洲社會對實驗動物的使用準(zhǔn)則和北京大學(xué)委員會對動物護理和使用。黑米中豐富花色素提取的準(zhǔn)備工作（AEBR）。黑米是從中國吉林當(dāng)?shù)厥袌鲑徺I。AEBR的提取過程在實驗前描述。簡單的說，是把黑米通過壓榨機磨碎，并到60目篩網(wǎng)上通過篩選。黑米粉末通過乙醇/水/鹽酸（50:50:0.5，v/v/v）按固液比1:10溫度50℃下2h提取兩次。濾液合并真空干燥（RotavaporR210;B€uchi,Flawil,瑞典）去除乙醇。濃縮的提取液轉(zhuǎn)移到AB-8樹脂。AB-8樹脂用蒸餾水洗凈，并隨后被吸收花青素用80％乙醇洗脫。乙醇洗脫液被噴霧于豐富的花色素粉末。圖1。黑米花色苷提取物剖面分析采用高效液相色譜法。進行檢測520納米。峰1，花青素-3,5-葡萄糖苷，峰2，花青素-3-葡萄糖苷;峰3，花青素-3-蕓香糖苷，峰4，peonidin-3-葡萄糖苷花色苷的鑒定與定量：ABER中的花色素用高效液相色譜法通過比較與標(biāo)準(zhǔn)品和已公布的保留時間和質(zhì)譜的數(shù)據(jù)來鑒定。矢車菊-3-葡萄糖苷（色譜級）購自PolyphenolsLaboratories（桑內(nèi)斯，挪威）。電噴霧質(zhì)譜法和Esquire-LC質(zhì)譜（MS）一起使用（布魯克道爾頓，比爾里卡，MA），一個儀器設(shè)備的離子阱電噴霧接口。質(zhì)譜記錄在陽離子模式下m/z50到1500之間。質(zhì)譜的主要參數(shù)如下：毛細管出口，4000V；毛細管補償，500V；脫脂1，38.3V；霧化氣體，氮氣，40psi，干燥氣體，氮氣，12L/min;干燥溫度，300℃。實驗條件事先確定。四種花青素被確定如下，矢車菊-3-葡萄糖苷（91.01％），芍藥素-3-葡萄糖苷（7.13％），矢車菊素-3，5-葡萄糖苷（0.92％），矢車菊素-3-蕓香糖苷（0.94％）（圖1）。在ShimadzuLC-20A高效液相色譜上進行分析。圖1顯示了黑米花色苷高效液相色譜法的輪廓圖。黑米色素中的花色苷用ShimadzuLC-20A高效液相色譜法量化并表示矢車菊-3-葡萄糖苷。黑米色素中的總花色苷含量達到22.5%。除了花色苷，黑米色素中還含有水分（6.96％），粗蛋白（8.78％），粗脂肪（4.35％），總糖和其它成分（57.41％）。實驗設(shè)計：實驗動物隨機分為5組，每組為8只大鼠。酒精和AEBR在水中溶解并被用來置于胃內(nèi)的管狀器官中45天，根據(jù)初步的實驗和以前的資料。實驗設(shè)計如下。第一組：用蒸餾水處理的對照大鼠（3.7g/kg體重）。第2組：正常大鼠口服乙醇（3.7g/kg體重）。第3組：正常大鼠口服乙醇（3.7g/kg體重）含AEBR（500mg/kg體重）。第4組：正常大鼠口服乙醇（3.7克/公斤體重）含AEBR（250mg/kg體重）。第5組：正常大鼠口服乙醇（3.7克/公斤體重）含AEBR（125mg/kg體重）。在實驗期結(jié)束后，斷頭處死動物。立即切除肝臟，用冰冷生理鹽水溶液（0.9％）處理，洗后干燥，稱重。血液和亞細胞的分離制備.血是從頸部血管中提取并在室溫下保持30分鐘。3000g離心10分鐘得到血清，在分析使用前分裝并在-80℃存儲。肝亞細胞組分（微粒體，??細胞質(zhì)，線粒體）中分離如前所述。肝臟樣品的每一部分在0.1M的Tris-HCl，0.25M蔗糖，0.1mM乙二胺四乙酸（EDTA，pH7.4）均質(zhì)，并在4℃，2000g離心15分鐘，取細胞核后上清液。該細胞核后上清液離心10000g，4℃進一步離心30min；顆粒狀物為線粒體。線粒體后上清液在4℃，100000g條件下繼續(xù)離心1h獲取微粒體（顆粒狀）和細胞質(zhì)（上清液）。線粒體和微粒體在0.1M的Tris-HCl（pH7.4）含10％甘油，0.1mMEDTA終止，并在液氮下速凍。為了準(zhǔn)備10％的肝勻漿，肝臟組織織用冰冷的0.9％的氯化鈉（1:10）處理均質(zhì)。肝功能生化參數(shù).血清中的天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST），丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT），γ-谷氨酶（GGT），谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）的活性通過一整套儀器測量[南京建成生物工程研究所（NJBI），中國]。肝臟勻漿和血清中的TC（總膽固醇），TG（甘油三酯）和MDA（丙二醛）的測量.總膽固醇（TC），甘油三酯（TG）和丙二醛（MDA）通過比色法測量。MDA由硫代巴比土酸-反應(yīng)產(chǎn)物（TBRAS）在532nm水平光譜光度測量方法下分析。結(jié)果為nmol/ng蛋白。生化分析.微粒體中的超氧化歧化物（SOD）和線粒體中的組分，去線粒體后組分中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，血清中的谷胱苷肽過氧化物以及微粒體中的組分由NJBI（中國）提供的一套儀器而定。組織病理學(xué).除去肝臟左葉尾部，用10％中性緩沖甲醛溶液固定。固定后組織用石蠟包埋，切成5-6微米厚的切片放在顯微鏡載玻片上。切片用蘇木精和伊紅染色（H＆E），是鑲嵌有中性聯(lián)苯乙烯-鄰苯二甲酸二丁酯-二甲苯（DPX）的媒介，用于顯微觀察。統(tǒng)計分析：所有數(shù)據(jù)都表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析的單向方差分析（ANOVA），采用SPSS社會科學(xué)統(tǒng)計程序（13.0版本軟件，SPSS公司，芝加哥，美國）。以P＜0.05值認為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果與討論生長性能和肝臟指數(shù).表1顯示在控制和實驗動物的最初和最終體重。乙醇處理組比對照組明顯減少了體重（P<0.01）。肝臟指數(shù)在乙醇喂養(yǎng)組明顯升高（P<0.01）與對照組相比，但是在AEBR（500mg/kgBW）組增加不顯著。用乙醇處理的大鼠表現(xiàn)出明顯較小體重（表1），與對照組相比，它類似于以前的報道（21）;其原因可能是由于食物攝入量的損失和吸收不良。AEBR對AST，ALT，GGT活性的影響.乙醇在肝臟中引起病變包括肝臟腫大和血清變化隨著天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST），谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）的活性增加。表2顯示在對照組和實驗組大鼠的血清AST，ALT和GGT的活性。乙醇處理組的AST,ALT,GGT的活性顯著增加（P＜0.05）。AEBR處理組（500mg/kg），連同乙醇顯著逆轉(zhuǎn)了這些功能標(biāo)記向正常的方向發(fā)展。AEBR在劑量為500mg/kg體重當(dāng)與其它兩個劑量（250和125mg/kg體重）相比則更為有效。這是眾所周知的，乙醇攝入引起血漿肝細胞酶的滲漏損失是肝損傷的一個標(biāo)志。酒精誘導(dǎo)的肝細胞氧化應(yīng)激作用在酒精性肝損傷的形成中起主要作用。ALT和AST是肝功能可靠的保障。血清中的酶如AST和ALT增加的水平表明細胞通透性和破壞的增加和/或細胞壞死。膜上限酶GGT被釋放到血液循環(huán)中，根據(jù)病理現(xiàn)象。在我們的研究，慢性酒精消耗造成了引起AST，ALT和GGT（表2）活性的顯著增加，這可導(dǎo)致膜組織的嚴(yán)重破壞。Obi等研究，從rosainensis芙蓉花瓣中提取的花青素顯著降低血清中天門冬氨酸和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性的水平。在這項研究中，對這些AEBR大鼠處理中酶活性的降低表明了保肝藥的作用。AEBR對肝臟和血清中的總膽固醇和甘油三酯的影響：10％的肝勻漿和血清（清液）中的甘油三酯（TG）和總膽固醇的水平列于表3。飲酒導(dǎo)致血清中的TG和TCH的增加（P<0.05）。AEBR改善這些不利的影響。與乙醇組血清和肝組織中的TG水平相比，ABER組則顯著降低。脂肪肝已被定義為肝臟細胞中含的脂肪滴超過5%或是總脂肪超過肝臟重量的5%。脂肪的積累是重度酒精吸入最普遍及最初的反應(yīng)。酒精性脂肪肝通常以肝腫大，血清和肝臟中的甘油三酯水平增加，肝臟部分和大量脂肪滴結(jié)合在一起為特征。在目前的研究中，酒精處理組會引起肝臟指數(shù)相當(dāng)大的增加，血清和肝臟中甘油三酯水平的提升，表明乙醇處理會引起典型的脂肪肝。與這些變化相對應(yīng)的，在病理檢查乙醇處理的大鼠肝臟中出現(xiàn)大量脂肪滴。AEBR對谷胱甘肽、丙二醛濃度和SOD（超氧化物歧化酶），GST（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）、GSH–Px（谷胱甘肽過氧化物酶）活性的影響。被控制和實驗的大鼠中血清和肝臟的MDA和GSH水平見表4。乙醇處理引起了血清和肝臟中MDA濃聚物的劇烈增加（P<0.01）。AEBR預(yù)處理的大鼠降低了血清和肝臟中MDA的形成。表4表示在組織中非酶抗氧化劑（GSH）的水平。酒精處理的大鼠與對照相比其GSH的水平顯著降低（P<0.05）。AEBR（500mg/kg）的處理顯著（P<0.05）恢復(fù)了在組織非酶抗氧化劑的水平。酒精性肝損傷與氧化應(yīng)激和自由基介導(dǎo)的組織損傷的聯(lián)系在大鼠和人體中被廣泛證實。自由基或活性氧簇（ROS）是由乙醇誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激造成的。自由基的形成是由于乙醇介導(dǎo)的過程中有很大的電位能快速的與脂類起化學(xué)，該反應(yīng)就會引起脂質(zhì)過氧化作用（LPO）。丙二醛（MDA）的水平被廣泛用作LPO的生物標(biāo)記已經(jīng)有很多年了。蔣等人研究表明，黑米花色苷提取物（矢車菊素-3-葡萄糖苷和芍藥素-3-葡萄糖苷）通過在體外和體內(nèi)減少ROS并增加抗氧化酶的活性可能會減弱氧化應(yīng)激的作用。津田等（1999年）發(fā)現(xiàn)，矢車菊-3-葡萄糖苷（C3G），在體內(nèi)的強抗氧化劑，可降低血清中硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)（TBARS）的濃度，提高血清對脂質(zhì)過氧化作用的抗氧化性。在本研究中，發(fā)現(xiàn)AEBR能顯著抑制MDA的水平因酒精而升高，表明AEBR的保護作用可能與抗氧化活性有關(guān)。在抗氧化系統(tǒng)中，非酶抗氧化劑如GSH在生化物系統(tǒng)中對保護細胞對抗脂質(zhì)過氧化作用起著重要的作用。對酒精處理的大鼠組補增ABER恢復(fù)了其血清和肝臟中的非酶抗氧化劑的水平。我們觀察到酒精處理的大鼠其抗氧化劑的水平（表4）接近正常。AEBR起到了氧自由基清除劑和氧化劑鏈斷裂的作用，這使體內(nèi)抗氧化劑的消耗降到最低并提高了酒精處理的大鼠體內(nèi)循環(huán)的非酶抗氧化劑的水平?？寡趸锏幕钚园ǔ趸锲缁福⊿OD），谷胱甘肽過氧化物酶（GPx），谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）見表5。酒精處理的大鼠被觀察到酶活性的顯著增加。對服用AEBR(500mg/kg)酒精處理的大鼠顯著（P<0.01）降低了其活性。長期的酒精處理通過加劇肝脂質(zhì)過氧化作用和抗氧化酶活性的下降引起肝臟的氧化應(yīng)激作用。自由清除酶包括SOD,GST和GPx是對抗氧化損傷的第一道防線?？寡趸到y(tǒng)的抑制可能會導(dǎo)致ROS或其分解產(chǎn)物的積累。GSTs是多基因家族中促進GSH同親電子復(fù)合物變種結(jié)合的同工酶，因此在保護細胞對抗ROS起到關(guān)鍵作用。乙醇或它的代謝產(chǎn)物可能會很明確的以GST同工酶為目標(biāo)，酶活性或表達的減少可能會對酒精肝毒性有作用。與這些報告一致，我們的研究表明口服增補AEBR的酒精長期處理的大鼠其肝臟中GSH-Px，SOD和GST的活性有恢復(fù)（表5）。大鼠肝組織病理學(xué)的檢查.乙醇可引起嚴(yán)重肝損害。酒精組大鼠肝臟樣本顯示的肝細胞損傷和變性的焦點（圖2B）。據(jù)發(fā)現(xiàn)，AEBR的處理扭轉(zhuǎn)了對肝臟的損傷。AEBR的一次500mg/kg體重劑量（圖2C）與其它兩個劑量（250和125mg/kg體重）相比要更有效果（圖2D，E）。除AEBR以外的乙醇（500mg/kg體重）處理表明接近正常的表現(xiàn)（圖2A）。肝臟接近正常表面上與AEBR（500mg/kg）處理的大鼠的肝臟細胞的輕微變化相同。組織學(xué)觀察結(jié)果表明