超氧化物歧化酶(SOD)課件

大寶，天天見(jiàn)微生物發(fā)酵生產(chǎn)超氧化物歧化酶微生物發(fā)酵生產(chǎn)超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，由于其具有清除生物體內(nèi)超氧陰離子自由基的作用，而引起廣大學(xué)者的關(guān)注。微生物發(fā)酵生產(chǎn)SOD的工藝是目前生產(chǎn)SOD的最主要手段，今天就SOD的發(fā)現(xiàn)、功能以及發(fā)展史作了一個(gè)簡(jiǎn)單的介紹，并著重從微生物發(fā)酵生產(chǎn)SOD的方向，對(duì)幾種SOD高產(chǎn)菌株的選育方法、篩選方法、優(yōu)化工藝等進(jìn)行了綜述，并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。介紹內(nèi)容

超氧化物歧化酶(Superoxide

dismutase，SOD)是一種生物體防御氧化損傷的、對(duì)機(jī)體具有顯著保護(hù)作用的生物酶，它廣泛分布于動(dòng)物、植物與微生物體內(nèi)。由于SOD具有清除體內(nèi)O2-的能力，且能較好地抵御氧自由基和基他氧化物自由基對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的毒性，維持細(xì)胞正常的生理代謝，所以其在機(jī)體保護(hù)方面起著重要作用，也因此SOD被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品工業(yè)，作為抗衰老、抗炎癥、治療自身免疫疾病的藥品以及食品、化妝品的添加劑等，被專家稱為21世紀(jì)最有前途的藥用酶。

從SOD的發(fā)現(xiàn)到其命名，期間經(jīng)歷了三十多年的時(shí)間，最初的發(fā)現(xiàn)是在1938年，Mann和Keilin從牛紅細(xì)胞中分離提取出一種含Cu的血銅蛋白；1953年Keilin又從小牛肝、鯨肝中分離出肝銅蛋白；1968年McCord和Fridovich根據(jù)血銅蛋白、肝銅蛋白、腦銅蛋白皆有O2-歧化活性，才將此酶命名為超氧化物歧化酶。但那時(shí)，他們的研究大多集中于從動(dòng)物血液或臟器中提取SOD，容易受原料來(lái)源、產(chǎn)品得率、穩(wěn)定性及安全性等方面的限制。

一.SOD的發(fā)現(xiàn)

SOD類型：超氧化物歧化酶按其所含金屬輔基不同可分為三種：第一種是含銅（Cu）鋅（Zn）金屬輔基的稱（Cu.Zn—SOD），最為常見(jiàn)的一種酶，呈綠色，主要存在于機(jī)體細(xì)胞漿中；第二種是含錳（Mn）金屬輔基的稱（Mn—SOD），呈紫色，存在于真核細(xì)胞的線粒體和原核細(xì)胞內(nèi)；第三種是含鐵（Fe）金屬輔基的稱（Fe—SOD），呈黃褐色，存在于原核細(xì)胞中。二.SOD的種類及分布

鑒于SOD在微生物中的含量的分布，常用以下七種SOD高產(chǎn)菌株進(jìn)行研究。三.SOD的發(fā)酵生產(chǎn)3.1普通酵母菌3.2啤酒廢酵母3.3霉菌3.4云芝菌絲體3.5枯草芽孢桿菌3.6大腸桿菌3.7乳酸菌啤酒廢酵母菌提取的經(jīng)濟(jì)價(jià)值

啤酒廢酵母是啤酒生產(chǎn)重要的副產(chǎn)物．其產(chǎn)量為啤酒產(chǎn)量的0．2％～0．3％(干基，質(zhì)量分?jǐn)?shù))。我國(guó)啤酒年產(chǎn)量已達(dá)3200萬(wàn)千升，將有～96萬(wàn)t的啤酒廢酵母產(chǎn)生。目前啤酒廠除將小部分酵母泥留作種子使用外，大部分連同其中的殘留啤酒直接排入下水道，嚴(yán)重污染環(huán)境(酵母泥的生物耗氧量、化學(xué)耗氧量均高達(dá)l0萬(wàn)mg/L以上)；或者是加工成附加值較低的一些產(chǎn)品。

實(shí)際上，啤酒酵母含有許多營(yíng)養(yǎng)成分，且無(wú)毒，這是一巨大的寶貴資源，研究酵母中生物活性物質(zhì)。合理開(kāi)發(fā)利用啤酒廢酵母，將產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。菌株的培育：通過(guò)將啤酒廢酵母洗滌、分離、漂洗預(yù)處理后，再將其接種至酵母培養(yǎng)基中培養(yǎng)進(jìn)行復(fù)壯，最終以異丙醇破壁提取法提取酵母中的SOD，并用丙醇溶液對(duì)所提SOD進(jìn)行兩次純化。此方法不僅有較高的SOD產(chǎn)率，且所提SOD有較高的酶活力。

啤酒廢酵母

酵母泥洗滌

酵母培養(yǎng)基滅菌酵母菌復(fù)壯SOD純化SOD提取工藝流程葡萄糖8%蛋白胨1%酵母膏1%蒸餾水1000ml酵母培養(yǎng)基配方121℃滅菌20min按30％接種量接入經(jīng)過(guò)洗滌后的酵母恒溫?fù)u床培養(yǎng)28℃140r/min2h擴(kuò)大培養(yǎng)，得到含SOD的濕菌體返回?cái)嚢?20min離心除去菌體SOD粗提液每1g酵母濕細(xì)胞中加入9mL異丙醇加入三倍體積的50mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH7.0）浸泡120min抽濾除去溶劑返回丙酮分級(jí)沉淀操作時(shí)，宜在4～10℃條件下進(jìn)行，有利于提高蛋白沉淀效果，保護(hù)酶活性。提取SOD后的酵母殘?jiān)半s蛋白可考慮加工為飼料或飼料蛋白添加劑，真正達(dá)到清潔生產(chǎn)的目的。為降低成本，異丙醇均可考慮回收濃縮循環(huán)使用。SOD活性測(cè)定采用改進(jìn)的微量鄰苯酚自氧化法。蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用改良的Lowry法注意事項(xiàng)1.細(xì)胞破壁方法分別對(duì)比了甲苯法、乙醇-氯仿法、異丙醇法。異丙醇法得到的SOD酶活最高。2.異丙醇濃度的確定

90%的異丙醇提取得到的酶總活力最高3.最佳提取時(shí)間SOD的釋放量隨著提取時(shí)間的增加而增加到一定的數(shù)量后，增加量減慢。120min提取量和設(shè)備利用率都得到保證。4.最適提取pH的確定在pH7.0時(shí)總酶活最高5.SOD最佳純化條件的確定

pH為5.0，丙酮的濃度控制在丙酮：粗酶液(v/v)=0.8:1時(shí)，雜蛋白沉淀最多，SOD純化最好．SOD酶比活最高。6.不同丙酮濃度對(duì)SOD沉淀純化的影響采用丙酮：SOD清液為0.3:1的比例所獲得的SOD沉淀酶比活最高，因此純度最高。提取條件的研究采用異丙醇破壁、丙酮二次純化提取SOD生產(chǎn)工藝，可得到SOD產(chǎn)