血液細胞組織化學(xué)課件

概述

細胞化學(xué)染色是在組織化學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一個學(xué)科分支，是細胞學(xué)與化學(xué)相結(jié)合而形成的一門科學(xué)，研究細胞的化學(xué)成分，在保存血液細胞形態(tài)的基礎(chǔ)上，在細胞原位顯示化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果，根據(jù)化學(xué)反應(yīng)的原理，研究細胞成分的化學(xué)性質(zhì)。

概述細胞化學(xué)染色是在組織化學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一個學(xué)科分1研究目的及臨床應(yīng)用

研究正常血液細胞的活動與生理功能提高血液病的診斷和鑒別診斷水平

確定急性白血病的類型

有助于某些血液病的鑒別診斷觀察療效和估計預(yù)后

探索某些血液病的發(fā)病原理及治療機制

研究目的及臨床應(yīng)用研究正常血液細胞的活動與生理功能2標(biāo)本的選擇

BM片、血片、淋巴結(jié)印片、脾印片等均可作組化染色。用于酶染色的標(biāo)本應(yīng)盡可能新鮮。用于非酶染色的標(biāo)本可在室溫下放置1個月，如PAS標(biāo)本。

標(biāo)本的選擇

3固定的目的及方法

目的保持細胞生前的結(jié)構(gòu)與化學(xué)成分，并使血膜在染色、沖洗過程中不易脫落損壞。常用化學(xué)固定方法

甲醛蒸汽固定：將濾紙平鋪于染色缸底部，加入少許40%甲醛溶液。將涂片標(biāo)本放入缸內(nèi)，加蓋使甲醛蒸汽固定血膜5-10分鐘，水洗后晾干。液體固定：常用的固定液為乙醇、丙酮、甲醇、甲醛等，也可用兩種或兩種以上成分組成混合固定液。

固定的目的及方法

4顯示方法

純化學(xué)方法

金屬沉淀法

偶氮偶聯(lián)法

聯(lián)苯胺色素法

Schiff反應(yīng)

普魯士藍反應(yīng)類化學(xué)方法

物理學(xué)方法顯示方法

5復(fù)染方法

復(fù)染是細胞內(nèi)化學(xué)成分顯色后，為了便于觀察而進行的對比染色方法。

細胞核復(fù)染法：常用染料為蘇木精、甲基綠、核固紅、沙黃等。

細胞漿復(fù)染法：常用染料為伊紅、光綠等復(fù)染方法6過氧化物酶染色（Peroxidasestain,POX）過氧化物酶染色（Peroxidasestain,POX）7目的急性白血病的鑒別診斷AML：陽性ALL：陰性目的急性白血病的鑒別診斷8分布特點-1原粒細胞：陰性，白血病副原粒細胞可呈陽性反應(yīng)。中性粒細胞：自早幼粒細胞起隨細胞成熟陽性強度遞增。陽性顆粒圓形，規(guī)則，直徑與嗜蘇丹黑顆粒相仿，比瑞氏染色特殊顆粒大。嗜酸粒細胞：陽性反應(yīng)，顆粒比中性粒細胞的大，著色深。嗜堿粒細胞：陰性反應(yīng)，在CML時可出現(xiàn)陽性反應(yīng)。分布特點-1原粒細胞：陰性，白血病副原粒細胞可呈陽性反應(yīng)。9分布特點-2在粒細胞系統(tǒng)中，過氧化物酶顆粒的出現(xiàn)和增多與特殊顆粒的出現(xiàn)和增多有平行關(guān)系。單核細胞系：原單呈陰性反應(yīng)，幼單和單核細胞呈弱陽性反應(yīng)。陽性顆粒少而細小，彌散分布，有的也可呈陰性反應(yīng)。其他細胞：淋巴細胞、巨核細胞、血小板、幼紅細胞、漿細胞和組織細胞均呈陰性反應(yīng)。有的吞噬細胞可呈陽性反應(yīng)分布特點-2在粒細胞系統(tǒng)中，過氧化物酶顆粒的出現(xiàn)和增多與特殊10血液細胞組織化學(xué)課件11試劑配制0.3%聯(lián)苯胺酒精溶液：

聯(lián)苯胺0.3g+95%乙醇全溶后，加入亞硝基鐵氰化鈉飽和水溶液1ml?？杀４?-2年。

過氧化氫溶液配制：

3%過氧化氫1滴+蒸餾水5ml，須每次用時新鮮配制。

試劑配制0.3%聯(lián)苯胺酒精溶液：

聯(lián)苯胺0.3g+9512染色步驟于新鮮涂片上滴加復(fù)方聯(lián)苯胺染液3－8滴，使涂片蓋滿。1－2分鐘后加入等量過氧化氫溶液。4－8分鐘后用水沖洗，空氣中晾干。用瑞氏染液復(fù)染，涼干后油鏡觀察。染色步驟13染色原理

粒細胞及部分單核細胞胞漿內(nèi)的顆粒中含有過氧化物酶，該酶能分解過氧化氫，釋放出新生態(tài)的氧。從而使無色的聯(lián)苯胺氧化為藍色的聯(lián)苯胺藍。聯(lián)苯胺藍是一種不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，它可進一步氧化變成棕色的化合物

染色原理粒細胞及部分單核細胞胞漿內(nèi)的顆粒中含有過氧化物酶，14結(jié)果判斷陽性反應(yīng)為藍色或藍棕色顆粒，定位于胞漿中。結(jié)果判斷陽性反應(yīng)為藍色或藍棕色顆粒，定位于胞漿中。15臨床意義ALL時，原始細胞的POX陽性小于3%。AML時，原始細胞的陽性≥3%。在多數(shù)的M1、絕大部分M2和M3中，原始細胞的陽性率大于85%。M4和M5時，原單有時可呈弱陽性，但絕大多數(shù)的原單是POX陰性。M6，原粒和幼稚粒細胞是POX陽性，幼紅細胞是POX陰性。在M7，血小板POX的活性只能在超微結(jié)構(gòu)上證實。MDS時，粒細胞白血病和感染所致的WBC增高時，成熟中性粒細胞的POX活性可能降低或消失。CML時，成熟中性粒細胞的POX活性增強。臨床意義ALL時，原始細胞的POX陽性小于3%。16注意事項

已固定的血膜因為酶已破壞不能再作過氧化物酶染色。所用過氧化氫必須新鮮，加于血膜上應(yīng)能發(fā)生泡沫。過量時紅細胞可出現(xiàn)假陽性。過氧化氫的濃度要適當(dāng)加減，過量則顆粒色深，不足則顆粒色淡。滴加過氧化氫液之后，最好將染片置于載物臺上，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)胞漿出現(xiàn)陽性顆粒時，立即水洗。注意事項已固定的血膜因為酶已破壞不能再作過氧化物酶染色。17血液細胞組織化學(xué)課件18

糖原染色

（Periodicacid-Schiffreaction,PAS）

糖原染色

（Periodicacid-S19目的

紅白血?。?+++）與巨幼紅細胞貧血（-）的鑒別診斷MDS與巨幼紅細胞貧血（-）的鑒別診斷單核細胞白血?。?）與組織細胞病（MH）的鑒別診斷淋巴肉瘤、何杰金病與急性淋巴細胞白血病的鑒別診斷高歇病與尼曼-匹克病的鑒別診斷

以上都是前者增高，后者降低或陰性。

目的紅白血?。?+++）與巨幼紅細胞貧血（-）的鑒別診斷20試劑-110g/L過碘酸液Schiff染液：堿性品紅0.5gDH2O100mlDH2O煮沸后待片刻，加入堿性品紅，振蕩數(shù)分鐘使品紅溶解，冷至50℃加入1M的鹽酸20ml，混勻。待冷卻至25℃加入偏重亞硫酸鈉0.5g，混合，置于帶塞的棕色瓶中，放于暗處24小時。染液為無色，如為微紅則加活性炭1－2g，混合過濾，如過濾液仍有紅色，應(yīng)再加少許活性炭，至紅色完全被吸收為止。制成后置于棕色瓶內(nèi)保存在冰箱備用，如變?yōu)榧t色，則不能使用。

試劑-110g/L過碘酸液21試劑-2

蘇木素液：蘇木素0.9g95％乙醇10ml銨（鉀）明礬20gDH2O200ml將蘇木素溶于95％的乙醇，鉀明礬溶于水（可加熱），然后將蘇木素液加入明礬液中混合，用強火煮沸后加氧化汞0.5g，迅速攪拌，呈深紫色，迅速移入冷水中，次日過濾，臨用時取此液95ml加冰醋酸5ml，可使細胞著色清楚。

試劑-2蘇木素液：22染色步驟

將新鮮血片或骨髓片用95％乙醇固定10分鐘。10g/L過碘酸液作用20分鐘DH2O洗滌1分鐘，晾干Schiff染液，60分鐘用自來水洗滌15分鐘（細水長流沖洗）蘇木素染液10分鐘。自來水沖洗15分鐘，待干鏡檢。

染色步驟將新鮮血片或骨髓片用95％乙醇固定10分鐘。23染色原理

過碘酸能使細胞內(nèi)的多糖乙二醇基氧化成二醛，再與Schiff氏液的無色品紅結(jié)合，呈紅色，定位于胞漿上。

染色原理過碘酸能使細胞內(nèi)的多糖乙二醇基氧化成二醛，再與Sc24結(jié)果判斷

正常BM：有核紅細胞幾乎均呈陰性反應(yīng)，在AML－M6，幼紅細胞為PAS強陽性。中性粒細胞：原粒細胞多為陰性，早幼粒階段開始呈PAS陽性，其后各階段陽性逐漸增強。巨核細胞和血小板：不含糖原，但含粘多糖等，故巨核細胞為細小彌散的陽性，PLT為粉紅色。ALL：可以是密集粗塊狀的顆粒，也能是細小彌散的顆粒，或是這兩種顆粒的混合。ALL的PAS也可能為陰性，特別是L3時。單核細胞白血病，原單細胞常為陰性，幼單和成熟單可有弱陽性或彌散陽性。

結(jié)果判斷正常BM：有核紅細胞幾乎均呈陰性反應(yīng)，在AML－M25注意事項

1）

Schiff液變紅不能再用。2）

堿性品紅的質(zhì)量很重要，如堿性品紅不合格，加活性炭，顏色也不被吸附。如無蘇木精復(fù)染液，可用1%甲綠復(fù)染25分替代。

注意事項1）

Schiff液變紅不能再用。26血液細胞組織化學(xué)課件27血液細胞組織化學(xué)課件28血液細胞組織化學(xué)課件29非特異性酯酶染色非特異性酯酶染色30原理

非特異性酯酶是作用于短鏈脂肪的酶，當(dāng)酯酶活性存在時，水解基質(zhì)中的α－醋酸萘酚，與重氮鹽偶聯(lián)，生成不溶性的有機產(chǎn)物，定位于胞漿上。原理非特異性酯酶是作用于短鏈脂肪的酶，當(dāng)酯酶活性存在時，水31試劑甲醛：基質(zhì)液：1/15M的磷酸緩沖液PH7.440ml10g/Lα－醋酸萘酚50％丙酮液0.8ml重氮鹽（DiazoblueB）40mg試劑甲醛：32方法

新鮮涂片用甲醛蒸汽固定5分鐘。流水沖洗5分鐘，晾干。置于基質(zhì)液中37℃1小時，水洗泡10分鐘。20g/L甲綠復(fù)染20－30分鐘。水洗，晾干，鏡檢。方法新鮮涂片用甲醛蒸汽固定5分鐘。33臨床意義

單核細胞系統(tǒng)呈陽性，伴隨著細胞的成熟而加強，對AL有鑒別診斷作用。臨床意義單核細胞系統(tǒng)呈陽性，伴隨著細胞的成熟而加強，對AL34非特異性酯酶-氟化鈉抑制試驗同非特異性酯酶，只是在1ml作用液中，加入1.5mg氟化鈉，即可抑制單核細胞的酯酶，故可作急性單核細胞白血病的鑒別診斷。

非特異性酯酶-氟化鈉抑制試驗同非特異性酯酶，只是在1ml作35血液細胞組織化學(xué)課件36血液細胞組織化學(xué)課件37血液細胞組織化學(xué)課件38急性白血病中的組化染色

白血病POXNSEPASALL

—+

+AML

M0+——

M1+(>3原始細胞)——

M2++——

M3++++—

M4++（原單細胞）—

M5—/+++—/+

M6+（原粒細胞）—+（幼紅細胞）

M7—++急性白血病中的組化染色白血病POX39

中性粒細胞堿性磷酸酶染色（AKP）

中性粒細胞堿性磷酸酶染色（AKP）40目的鑒別白血病（低）和白血病樣（高）反應(yīng)鑒別淋巴肉瘤（高）和何杰金病鑒別細菌性感染（高）與病毒性感染

目的鑒別白血?。ǖ停┖桶籽樱ǜ撸┓磻?yīng)41分布

血細胞的堿性磷酸酶活性，主要見于成熟的中性粒細胞，定位于胞漿中。

分布血細胞的堿性磷酸酶活性，主要見于成熟的中性粒細胞，定位42原理

細胞中的AKP在PH9.5－9.6緩沖液中能使基質(zhì)中的磷酸萘酚鈉水解，釋放出萘酚。后者與一種穩(wěn)定的重氮鹽（常用有固紫Fast--Garnet，GBC或固藍RR）偶聯(lián)，生成不溶性的偶氮染料，沉積于細胞上。

原理細胞中的AKP在PH9.5－9.6緩沖液中能使基質(zhì)中的43試劑

95%乙醇固醬紫GBCAS-BI磷酸萘酚12.5mg+DH2O100ml0.2Mtris緩沖液：三羥甲基氨基甲烷2.43g+DH2O溶至100ml。0.05Mtris緩沖液（PH8.6-9.0）：0.2Mtris緩沖液25ml+0.1MHCL49ml貯存液：50mlAS-BI磷酸萘酚+PH8.80.05Mtris緩沖液50ml混勻，冰箱保存1%甲基綠

試劑95%乙醇44染色步驟

新鮮BM片及血片待干95%乙醇固定10分鐘固醬紫1mg+2ml貯存液混勻，立即滴加數(shù)滴在血片或BM片上，置37℃孵箱孵育30分鐘用蒸餾水快沖

放入1%甲綠中復(fù)染5分鐘用蒸餾水快沖，待干，鏡檢

染色步驟

新鮮BM片及血片待干45結(jié)果判斷

陽性顆粒呈紅色，定位于成熟中性粒細胞胞漿內(nèi)。

計數(shù)方法，按堿酶活性強弱，分為0-4+共5級。分?jǐn)?shù)特點0胞漿內(nèi)無紅色的顆粒1彌散的紅色，偶見顆粒2彌散的紅色，有中等量的顆粒3顯著的紅色，有較多的顆粒4顯著的紅色，有充滿胞漿的粗大顆粒結(jié)果判斷陽性顆粒呈紅色，定位于成熟中性粒細胞胞漿46計算積分分?jǐn)?shù)細胞數(shù)目積分0200145452255035154520總數(shù)100130=LAP積分

計算積分分?jǐn)?shù)細胞數(shù)目積分47臨床意義

正常的LAP積分是20－100分，但因為計數(shù)的主觀性，很重要的是建立每個實驗室自己的正常值。臨床診斷積分正常20－100CML＜13類白血?。?00真紅100－200繼發(fā)性紅細胞增多10－100

臨床意義正常的LAP積分是20－100分，但因為計數(shù)的主觀48血液細胞組織化學(xué)課件49鐵粒染色鐵粒染色50原理

骨髓小粒中的含鐵血黃素稱細胞外鐵，其中的三價鐵與分子中的蛋白質(zhì)結(jié)合不牢，經(jīng)稀鹽酸處理后而游離出來，并能在酸性亞鐵氰化鉀溶液中產(chǎn)生普魯士藍反應(yīng)。細胞內(nèi)鐵也可用此法顯示。根據(jù)反應(yīng)的強弱了解骨髓中鐵的含量。

原理骨髓小粒中的含鐵血黃素稱細胞外鐵，其中的三價鐵與分子中51試劑

酸性亞鐵氰化鉀溶液：200g/L亞鐵氰化鉀溶液5份濃鹽酸1份取200g/L亞鐵氰化鉀溶液置于試管中，緩緩加入濃鹽酸，邊滴加邊搖勻，至出現(xiàn)白色沉淀，再滴加200g/L亞鐵氰化鉀，邊滴加邊搖勻，至白色沉淀消失為止，備用。2g/L核固紅－硫酸鋁溶液：取硫酸鋁10g加入100mlDH2O再加入核固紅EMER出品0.2g，置于37℃水浴中1小時，并經(jīng)常振蕩，使溶解，過濾后使用。試劑酸性亞鐵氰化鉀溶液：52方法選骨髓小粒豐富的骨髓涂片玻片上滴加酸性亞鐵氰化鉀，染色30分鐘。（可置于37℃）用DH2O沖洗后用核固紅染液復(fù)染10－15分鐘。流水沖洗，晾干，油鏡檢查。方法選骨髓小粒豐富的骨髓涂片53結(jié)果

正常人細胞外鐵：＋－＋＋幼紅細胞呈鮮紅色，胞漿成淡黃紅色，鐵粒呈藍綠色。細胞外鐵的判斷用低倍鏡觀察涂片，特別時涂片尾部和骨髓小粒附近。結(jié)果正常人細胞外鐵：＋－＋＋54細胞外鐵判斷標(biāo)準(zhǔn)－無顆粒＋有少數(shù)鐵顆?；蚺家婅F小珠＋＋有較多的鐵顆粒和小珠＋＋＋有很多的鐵顆粒，小珠和少數(shù)小塊狀＋＋＋＋有極多的鐵顆粒，小珠并有很多的小塊，密集成堆細胞外鐵判斷標(biāo)準(zhǔn)－無顆粒55血液細胞組織化學(xué)課件56鐵粒幼紅細胞的分型1型僅含一個鐵顆粒2型含2－5個鐵顆粒3型含6－9個鐵顆粒4型含10個以上的鐵顆粒鐵粒幼紅細胞的分型1型僅含一個鐵顆粒57血液細胞組織化學(xué)課件58環(huán)形鐵粒幼細胞

含鐵顆粒6個以上，其中2/3以上的鐵顆粒圍繞核周圍排列成完全環(huán)形或不完全環(huán)形（圍繞核周圍指分布緊靠著細胞核或靠近細胞核的1/3胞漿內(nèi)，鐵顆粒增多時，可分布于外2/3的胞漿內(nèi)。

環(huán)形鐵粒幼細胞含鐵顆粒6個以上，其中2/3以上的鐵顆粒圍繞59血液細胞組織化學(xué)課件60臨床意義

IDA：骨髓細胞外鐵和內(nèi)鐵顯著減少或消失，鐵粒幼紅細胞陽性率為0－16％，鐵顆粒極少并著色淺，以1型為主，2型者極少，3型以上者不見。經(jīng)鐵劑治療后細胞外鐵和內(nèi)鐵可迅速增多，因此是診斷IDA和指導(dǎo)鐵劑治療的一種輔助方法。臨床意義IDA：骨髓細胞外鐵和內(nèi)鐵顯著減少或消失，鐵粒幼紅61是診斷鐵粒幼紅細胞貧血的重要依據(jù)，能發(fā)現(xiàn)數(shù)量不等的環(huán)狀鐵粒幼紅細胞，并且多見粗顆粒的3型和4型鐵粒幼紅細胞。

血液細胞組織化學(xué)課件62注意事項

玻片必須經(jīng)無鐵處理：將新玻片經(jīng)清潔液浸泡24小時，取出后反復(fù)水洗浸入95％酒精24小時，晾干，再浸泡在5％鹽酸中24小時，用D2H2O反復(fù)洗玻片，取出烤干后備用。酸性亞鐵氰化鉀液必須新鮮配制。最好用骨髓小粒豐富的骨髓涂片進行染色并作細胞外鐵觀察。

注意事項玻片必須經(jīng)無鐵處理：將新玻片經(jīng)清潔液浸泡24小時，63概述

細胞化學(xué)染色是在組織化學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一個學(xué)科分支，是細胞學(xué)與化學(xué)相結(jié)合而形成的一門科學(xué)，研究細胞的化學(xué)成分，在保存血液細胞形態(tài)的基礎(chǔ)上，在細胞原位顯示化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果，根據(jù)化學(xué)反應(yīng)的原理，研究細胞成分的化學(xué)性質(zhì)。

概述細胞化學(xué)染色是在組織化學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一個學(xué)科分64研究目的及臨床應(yīng)用

研究正常血液細胞的活動與生理功能提高血液病的診斷和鑒別診斷水平

確定急性白血病的類型

有助于某些血液病的鑒別診斷觀察療效和估計預(yù)后

探索某些血液病的發(fā)病原理及治療機制

研究目的及臨床應(yīng)用研究正常血液細胞的活動與生理功能65標(biāo)本的選擇

BM片、血片、淋巴結(jié)印片、脾印片等均可作組化染色。用于酶染色的標(biāo)本應(yīng)盡可能新鮮。用于非酶染色的標(biāo)本可在室溫下放置1個月，如PAS標(biāo)本。

標(biāo)本的選擇

66固定的目的及方法

目的保持細胞生前的結(jié)構(gòu)與化學(xué)成分，并使血膜在染色、沖洗過程中不易脫落損壞。常用化學(xué)固定方法

甲醛蒸汽固定：將濾紙平鋪于染色缸底部，加入少許40%甲醛溶液。將涂片標(biāo)本放入缸內(nèi)，加蓋使甲醛蒸汽固定血膜5-10分鐘，水洗后晾干。液體固定：常用的固定液為乙醇、丙酮、甲醇、甲醛等，也可用兩種或兩種以上成分組成混合固定液。

固定的目的及方法

67顯示方法

純化學(xué)方法

金屬沉淀法

偶氮偶聯(lián)法

聯(lián)苯胺色素法

Schiff反應(yīng)

普魯士藍反應(yīng)類化學(xué)方法

物理學(xué)方法顯示方法

68復(fù)染方法

復(fù)染是細胞內(nèi)化學(xué)成分顯色后，為了便于觀察而進行的對比染色方法。

細胞核復(fù)染法：常用染料為蘇木精、甲基綠、核固紅、沙黃等。

細胞漿復(fù)染法：常用染料為伊紅、光綠等復(fù)染方法69過氧化物酶染色（Peroxidasestain,POX）過氧化物酶染色（Peroxidasestain,POX）70目的急性白血病的鑒別診斷AML：陽性ALL：陰性目的急性白血病的鑒別診斷71分布特點-1原粒細胞：陰性，白血病副原粒細胞可呈陽性反應(yīng)。中性粒細胞：自早幼粒細胞起隨細胞成熟陽性強度遞增。陽性顆粒圓形，規(guī)則，直徑與嗜蘇丹黑顆粒相仿，比瑞氏染色特殊顆粒大。嗜酸粒細胞：陽性反應(yīng)，顆粒比中性粒細胞的大，著色深。嗜堿粒細胞：陰性反應(yīng)，在CML時可出現(xiàn)陽性反應(yīng)。分布特點-1原粒細胞：陰性，白血病副原粒細胞可呈陽性反應(yīng)。72分布特點-2在粒細胞系統(tǒng)中，過氧化物酶顆粒的出現(xiàn)和增多與特殊顆粒的出現(xiàn)和增多有平行關(guān)系。單核細胞系：原單呈陰性反應(yīng)，幼單和單核細胞呈弱陽性反應(yīng)。陽性顆粒少而細小，彌散分布，有的也可呈陰性反應(yīng)。其他細胞：淋巴細胞、巨核細胞、血小板、幼紅細胞、漿細胞和組織細胞均呈陰性反應(yīng)。有的吞噬細胞可呈陽性反應(yīng)分布特點-2在粒細胞系統(tǒng)中，過氧化物酶顆粒的出現(xiàn)和增多與特殊73血液細胞組織化學(xué)課件74試劑配制0.3%聯(lián)苯胺酒精溶液：

聯(lián)苯胺0.3g+95%乙醇全溶后，加入亞硝基鐵氰化鈉飽和水溶液1ml?？杀４?-2年。

過氧化氫溶液配制：

3%過氧化氫1滴+蒸餾水5ml，須每次用時新鮮配制。

試劑配制0.3%聯(lián)苯胺酒精溶液：

聯(lián)苯胺0.3g+9575染色步驟于新鮮涂片上滴加復(fù)方聯(lián)苯胺染液3－8滴，使涂片蓋滿。1－2分鐘后加入等量過氧化氫溶液。4－8分鐘后用水沖洗，空氣中晾干。用瑞氏染液復(fù)染，涼干后油鏡觀察。染色步驟76染色原理

粒細胞及部分單核細胞胞漿內(nèi)的顆粒中含有過氧化物酶，該酶能分解過氧化氫，釋放出新生態(tài)的氧。從而使無色的聯(lián)苯胺氧化為藍色的聯(lián)苯胺藍。聯(lián)苯胺藍是一種不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，它可進一步氧化變成棕色的化合物

染色原理粒細胞及部分單核細胞胞漿內(nèi)的顆粒中含有過氧化物酶，77結(jié)果判斷陽性反應(yīng)為藍色或藍棕色顆粒，定位于胞漿中。結(jié)果判斷陽性反應(yīng)為藍色或藍棕色顆粒，定位于胞漿中。78臨床意義ALL時，原始細胞的POX陽性小于3%。AML時，原始細胞的陽性≥3%。在多數(shù)的M1、絕大部分M2和M3中，原始細胞的陽性率大于85%。M4和M5時，原單有時可呈弱陽性，但絕大多數(shù)的原單是POX陰性。M6，原粒和幼稚粒細胞是POX陽性，幼紅細胞是POX陰性。在M7，血小板POX的活性只能在超微結(jié)構(gòu)上證實。MDS時，粒細胞白血病和感染所致的WBC增高時，成熟中性粒細胞的POX活性可能降低或消失。CML時，成熟中性粒細胞的POX活性增強。臨床意義ALL時，原始細胞的POX陽性小于3%。79注意事項

已固定的血膜因為酶已破壞不能再作過氧化物酶染色。所用過氧化氫必須新鮮，加于血膜上應(yīng)能發(fā)生泡沫。過量時紅細胞可出現(xiàn)假陽性。過氧化氫的濃度要適當(dāng)加減，過量則顆粒色深，不足則顆粒色淡。滴加過氧化氫液之后，最好將染片置于載物臺上，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)胞漿出現(xiàn)陽性顆粒時，立即水洗。注意事項已固定的血膜因為酶已破壞不能再作過氧化物酶染色。80血液細胞組織化學(xué)課件81

糖原染色

（Periodicacid-Schiffreaction,PAS）

糖原染色

（Periodicacid-S82目的

紅白血病（++++）與巨幼紅細胞貧血（-）的鑒別診斷MDS與巨幼紅細胞貧血（-）的鑒別診斷單核細胞白血?。?）與組織細胞?。∕H）的鑒別診斷淋巴肉瘤、何杰金病與急性淋巴細胞白血病的鑒別診斷高歇病與尼曼-匹克病的鑒別診斷

以上都是前者增高，后者降低或陰性。

目的紅白血?。?+++）與巨幼紅細胞貧血（-）的鑒別診斷83試劑-110g/L過碘酸液Schiff染液：堿性品紅0.5gDH2O100mlDH2O煮沸后待片刻，加入堿性品紅，振蕩數(shù)分鐘使品紅溶解，冷至50℃加入1M的鹽酸20ml，混勻。待冷卻至25℃加入偏重亞硫酸鈉0.5g，混合，置于帶塞的棕色瓶中，放于暗處24小時。染液為無色，如為微紅則加活性炭1－2g，混合過濾，如過濾液仍有紅色，應(yīng)再加少許活性炭，至紅色完全被吸收為止。制成后置于棕色瓶內(nèi)保存在冰箱備用，如變?yōu)榧t色，則不能使用。

試劑-110g/L過碘酸液84試劑-2

蘇木素液：蘇木素0.9g95％乙醇10ml銨（鉀）明礬20gDH2O200ml將蘇木素溶于95％的乙醇，鉀明礬溶于水（可加熱），然后將蘇木素液加入明礬液中混合，用強火煮沸后加氧化汞0.5g，迅速攪拌，呈深紫色，迅速移入冷水中，次日過濾，臨用時取此液95ml加冰醋酸5ml，可使細胞著色清楚。

試劑-2蘇木素液：85染色步驟

將新鮮血片或骨髓片用95％乙醇固定10分鐘。10g/L過碘酸液作用20分鐘DH2O洗滌1分鐘，晾干Schiff染液，60分鐘用自來水洗滌15分鐘（細水長流沖洗）蘇木素染液10分鐘。自來水沖洗15分鐘，待干鏡檢。

染色步驟將新鮮血片或骨髓片用95％乙醇固定10分鐘。86染色原理

過碘酸能使細胞內(nèi)的多糖乙二醇基氧化成二醛，再與Schiff氏液的無色品紅結(jié)合，呈紅色，定位于胞漿上。

染色原理過碘酸能使細胞內(nèi)的多糖乙二醇基氧化成二醛，再與Sc87結(jié)果判斷

正常BM：有核紅細胞幾乎均呈陰性反應(yīng)，在AML－M6，幼紅細胞為PAS強陽性。中性粒細胞：原粒細胞多為陰性，早幼粒階段開始呈PAS陽性，其后各階段陽性逐漸增強。巨核細胞和血小板：不含糖原，但含粘多糖等，故巨核細胞為細小彌散的陽性，PLT為粉紅色。ALL：可以是密集粗塊狀的顆粒，也能是細小彌散的顆粒，或是這兩種顆粒的混合。ALL的PAS也可能為陰性，特別是L3時。單核細胞白血病，原單細胞常為陰性，幼單和成熟單可有弱陽性或彌散陽性。

結(jié)果判斷正常BM：有核紅細胞幾乎均呈陰性反應(yīng)，在AML－M88注意事項

1）

Schiff液變紅不能再用。2）

堿性品紅的質(zhì)量很重要，如堿性品紅不合格，加活性炭，顏色也不被吸附。如無蘇木精復(fù)染液，可用1%甲綠復(fù)染25分替代。

注意事項1）

Schiff液變紅不能再用。89血液細胞組織化學(xué)課件90血液細胞組織化學(xué)課件91血液細胞組織化學(xué)課件92非特異性酯酶染色非特異性酯酶染色93原理

非特異性酯酶是作用于短鏈脂肪的酶，當(dāng)酯酶活性存在時，水解基質(zhì)中的α－醋酸萘酚，與重氮鹽偶聯(lián)，生成不溶性的有機產(chǎn)物，定位于胞漿上。原理非特異性酯酶是作用于短鏈脂肪的酶，當(dāng)酯酶活性存在時，水94試劑甲醛：基質(zhì)液：1/15M的磷酸緩沖液PH7.440ml10g/Lα－醋酸萘酚50％丙酮液0.8ml重氮鹽（DiazoblueB）40mg試劑甲醛：95方法

新鮮涂片用甲醛蒸汽固定5分鐘。流水沖洗5分鐘，晾干。置于基質(zhì)液中37℃1小時，水洗泡10分鐘。20g/L甲綠復(fù)染20－30分鐘。水洗，晾干，鏡檢。方法新鮮涂片用甲醛蒸汽固定5分鐘。96臨床意義

單核細胞系統(tǒng)呈陽性，伴隨著細胞的成熟而加強，對AL有鑒別診斷作用。臨床意義單核細胞系統(tǒng)呈陽性，伴隨著細胞的成熟而加強，對AL97非特異性酯酶-氟化鈉抑制試驗同非特異性酯酶，只是在1ml作用液中，加入1.5mg氟化鈉，即可抑制單核細胞的酯酶，故可作急性單核細胞白血病的鑒別診斷。

非特異性酯酶-氟化鈉抑制試驗同非特異性酯酶，只是在1ml作98血液細胞組織化學(xué)課件99血液細胞組織化學(xué)課件100血液細胞組織化學(xué)課件101急性白血病中的組化染色

白血病POXNSEPASALL

—+

+AML

M0+——

M1+(>3原始細胞)——

M2++——

M3++++—

M4++（原單細胞）—

M5—/+++—/+

M6+（原粒細胞）—+（幼紅細胞）

M7—++急性白血病中的組化染色白血病POX102

中性粒細胞堿性磷酸酶染色（AKP）

中性粒細胞堿性磷酸酶染色（AKP）103目的鑒別白血?。ǖ停┖桶籽樱ǜ撸┓磻?yīng)鑒別淋巴肉瘤（高）和何杰金病鑒別細菌性感染（高）與病毒性感染

目的鑒別白血病（低）和白血病樣（高）反應(yīng)104分布

血細胞的堿性磷酸酶活性，主要見于成熟的中性粒細胞，定位于胞漿中。

分布血細胞的堿性磷酸酶活性，主要見于成熟的中性粒細胞，定位105原理

細胞中的AKP在PH9.5－9.6緩沖液中能使基質(zhì)中的磷酸萘酚鈉水解，釋放出萘酚。后者與一種穩(wěn)定的重氮鹽（常用有固紫Fast--Garnet，GBC或固藍RR）偶聯(lián)，生成不溶性的偶氮染料，沉積于細胞上。

原理細胞中的AKP在PH9.5－9.6緩沖液中能使基質(zhì)中的106試劑

95%乙醇固醬紫GBCAS-BI磷酸萘酚12.5mg+DH2O100ml0.2Mtris緩沖液：三羥甲基氨基甲烷2.43g+DH2O溶至100ml。0.05Mtris緩沖液（PH8.6-9.0）：0.2Mtris緩沖液25ml+0.1MHCL49ml貯存液：50mlAS-BI磷酸萘酚+PH8.80.05Mtris緩沖液50ml混勻，冰箱保存1%甲基綠

試劑95%乙醇107染色步驟

新鮮BM片及血片待干95%乙醇固定10分鐘固醬紫1mg+2ml貯存液混勻，立即滴加數(shù)滴在血片或BM片上，置37℃孵箱孵育30分鐘用蒸餾水快沖

放入1%甲綠中復(fù)染5分鐘用蒸餾水快沖，待干，鏡檢

染色步驟

新鮮BM片及血片待干108結(jié)果判斷

陽性顆粒呈紅色，定位于成熟中性粒細胞胞漿內(nèi)。

計數(shù)方法，按堿酶活性強弱，分為0-4+共5級。分?jǐn)?shù)特點0胞漿內(nèi)無紅色的顆粒1彌散的紅色，偶見顆粒2彌散的紅色，有中等量的顆粒3顯著的紅色，有較多的顆粒4顯著的紅色，有充滿胞漿的粗大顆粒結(jié)果判斷陽性顆粒呈紅色，定位于成熟中性粒細胞胞漿109計算積分分?jǐn)?shù)細胞數(shù)目積分0200145452255035154520總數(shù)100130=LAP積分

計算積分分?jǐn)?shù)細胞數(shù)目積分110臨床意義

正常的LAP積分是20－100分，但因為計數(shù)的主觀性，很重要的是建立每個實驗室自己的正常值。臨床診斷積分正常20－100CML