素材：DNA限制性核酸內(nèi)切酶問(wèn)題釋疑 高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

DNA限制性核酸內(nèi)切酶問(wèn)題釋疑DNA限制性核酸內(nèi)切酶是一種基因工程的工具酶，這類酶的最大功能特點(diǎn)有特異性，特異性體現(xiàn)序列和位點(diǎn)的切割。選擇性必修3教材對(duì)限制性內(nèi)切酶介紹過(guò)于簡(jiǎn)單，在做試題時(shí)，會(huì)產(chǎn)生多種疑問(wèn)。新教材選擇性必修3第100頁(yè)1.為什么叫限制性核酸內(nèi)切酶？20世紀(jì)30年代，微生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)，微生物的噬菌體不能交叉感染，如EcoliK株的噬菌體只能感染EcoliK株，不能感染其他株，反之亦然。這種現(xiàn)象稱為“限制現(xiàn)象”。1962年，W．Arber提出一個(gè)假設(shè)來(lái)解釋上述現(xiàn)象。他認(rèn)為這是細(xì)菌中有2種以上功能不同的酶，一種是核酸內(nèi)切酶，能識(shí)別并切斷外來(lái)DNA分子的某些部位，使外來(lái)DNA失去活性，限制外來(lái)噬菌體的繁殖，把這類酶稱為限制性核酸內(nèi)切酶。2.限制性核酸內(nèi)切酶在微生物中的作用限制性核酸內(nèi)切酶是由細(xì)菌產(chǎn)生的，其生理意義是提高自身的防御能力，限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA。3.細(xì)菌的限制性核酸內(nèi)切酶為什么不切割自己的DNA？細(xì)菌自身的DNA沒(méi)有被分解的原因可以是通過(guò)自身的DNA甲基化，甲基化是常見(jiàn)的修飾作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保護(hù)，即讓它們?cè)诩谆D(zhuǎn)移酶的作用下，與甲基發(fā)生共價(jià)結(jié)合。通過(guò)甲基化作用達(dá)到識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來(lái)遺傳物質(zhì)的目的。當(dāng)然，也有可能不存在自身限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列。4.限制性核酸內(nèi)切酶能不能切割RNA目前為止，還沒(méi)有資料說(shuō)明有切割RNA的限制性核酸內(nèi)切酶。在進(jìn)化的角度去看，理由可能是只能切割穩(wěn)定的DNA，RNA本身一般是單鏈結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，不需要進(jìn)行切割防御。事實(shí)證明，熟悉的限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列都有堿基T。5.不同的限制性內(nèi)切酶（同尾酶）切割連接后，還能不能這兩種酶的某一種切開？不一定，除非是產(chǎn)生平末端的限制性內(nèi)切酶，因?yàn)檎承阅┒伺鋵?duì)后，序列可能發(fā)生了改變，這兩種酶就無(wú)法切開（見(jiàn)下列試題）。試題解析

試題：下表中列出了幾種限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中箭頭表示相關(guān)限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用

兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過(guò)

酶作用后獲得重組質(zhì)粒。（2）為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加

。（3）若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個(gè)堿基對(duì)序列為

，對(duì)于該部位，這兩種酶

(填“都能”“都不能”或“只有一種能”)切開。（4）若用Sau3AⅠ切割質(zhì)粒，最多可能獲得

種大小不同的DNA片段。答案：（1）BclⅠ和HindⅢDNA連接（2）四環(huán)素（3）都不能（4）7解析：（1）在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，需用限制性核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒和目的基因，為提高重組效率使用兩種限制性核酸內(nèi)切酶，使質(zhì)粒和目的基因兩端產(chǎn)生不同的粘性末端，從而防止自身環(huán)化和倒接。選擇BclⅠ和HindⅢ兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過(guò)DNA連接酶作用后獲得重組質(zhì)粒。Sau3AⅠ和BamHⅠ可以產(chǎn)生與BclⅠ相同的粘性末端，而且BamHⅠ在質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因都有酶切點(diǎn)，使用BamHⅠ酶切后質(zhì)粒將被破壞，所以上述兩種酶不能用。(2)當(dāng)選擇BclⅠ和HindⅢ兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒后，氨芐青霉素抗性基因被破壞，而四環(huán)素抗性基因完整可作為標(biāo)記基因，為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素，這樣導(dǎo)入質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒的大腸桿菌可以生長(zhǎng)，其余不能生長(zhǎng)。(3)用BamHⅠ酶切的DNA末端為，而BclⅠ酶切的DNA末端為，若將兩者連接，則重新連接部位的6個(gè)堿基對(duì)序列為，若旋轉(zhuǎn)180°就是。而對(duì)重新連接部位用BamHⅠ酶和BclⅠ酶都不能識(shí)別，也不能切開。(4)仔細(xì)觀察表中Sau3AⅠ與其他酶的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)，可以發(fā)現(xiàn)Sau3AⅠ能切開BamHⅠ和BclⅠ的識(shí)別序列，這樣用Sau3AⅠ切圖1質(zhì)粒，就有3個(gè)不同切點(diǎn)，如圖，若3個(gè)切點(diǎn)同時(shí)切開會(huì)出現(xiàn)①②③3個(gè)片段，但S