免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件

標(biāo)記免疫技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏性特異性標(biāo)記免疫技術(shù)的主要特點(diǎn)：高特異性、高靈敏性免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏性特異性標(biāo)記免疫技術(shù)1標(biāo)記免疫技術(shù)免疫測(cè)定技術(shù)免疫組化技術(shù)示蹤物及標(biāo)記技術(shù)放射免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光技術(shù)金免疫技術(shù)???標(biāo)記免疫技術(shù)免疫測(cè)定技術(shù)免疫組化技術(shù)示蹤物及放射免疫技術(shù)2第八章放射免疫技術(shù)

類型：放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA）免疫放射分析（immunoradiometricassay,IRMA）

廣義放射免疫技術(shù)還包括放射受體分析（使用受體測(cè)量抗原）和放射配體結(jié)合分析（使用配體研究受體）。特點(diǎn):靈敏度高(10-9-10-15g/L)、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等第八章放射免疫技術(shù)3標(biāo)記物:常用的核素有兩大類γ射線：131I、125I、57Cr和60Coβ射線：14C、3H和32P。使用最廣泛的是：125I①性質(zhì)活潑、易制備標(biāo)記物②對(duì)被標(biāo)記物的免疫活性影響?、蹨y(cè)量方法簡(jiǎn)便、已推廣④半衰期較長(zhǎng)、核素豐度高標(biāo)記物:4標(biāo)記方法125I的標(biāo)記原理：取代分子中酪氨酸或酪胺殘基及組胺殘基上的氫原子方法：直接標(biāo)記法

氯胺T法和乳過(guò)氧化物酶法間接標(biāo)記法

聯(lián)接標(biāo)記法免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件5適用分子原理特點(diǎn)缺點(diǎn)直接標(biāo)記肽類、蛋白質(zhì)、酶存在酪氨酸、組胺殘基等基團(tuán)操作簡(jiǎn)便、易標(biāo)記、比放射性高不適于活性功能區(qū)的殘基標(biāo)記間接標(biāo)記甾類化合物、核苷酸等小分子化合物不存在酪氨酸、組胺殘基等基團(tuán),需添加可避免氧化／還原劑對(duì)被標(biāo)記物活性的損傷等添加基團(tuán)可能影響被標(biāo)記物活性適用分子原理特點(diǎn)缺點(diǎn)直接標(biāo)記肽類、蛋白質(zhì)、酶存在酪氨酸、組胺6標(biāo)記物純化

對(duì)游離的125I等試劑與標(biāo)記物進(jìn)行分離方法：分子篩凝膠過(guò)濾；離子交換層析；聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）；高效液相色譜（HPLC）標(biāo)記物純化7標(biāo)記物鑒定放射化學(xué)純度

單位標(biāo)記物中結(jié)合在被標(biāo)記物上的放射性占總放射性的百分率。一般要求大于95％。免疫活性

標(biāo)記過(guò)程中，被標(biāo)記物活性損傷程度。B/T％>80％，B/T％↑抗原損傷↓。比放射性

單位化學(xué)量標(biāo)記物中所含的放射性強(qiáng)度.常用Ci/g、mCi/mg、Ci/mmol等單位表示。比放射性↑方法更靈敏；過(guò)高輻射自損傷大，對(duì)標(biāo)記物免疫活性影響大，儲(chǔ)存穩(wěn)定性差。標(biāo)記物鑒定8抗血清鑒定多克隆抗體的抗血清是放射免疫分析的主要試劑之一，其質(zhì)量直接影響方法的特異性和靈敏度。親合力選用親和常數(shù)K值大(109~1012L//mol)抗血清特異性其程度可直接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性

滴度最大稀釋度。在本技術(shù)方法中是指結(jié)合50％標(biāo)記抗原時(shí)的抗血清的稀釋度?？寡彖b定9放射免疫分析（RIA）基本原理

采用定量的標(biāo)記抗原（Ag＋）和非標(biāo)記抗原（Ag）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合有限量特異性抗體（Ab）的反應(yīng)。放射免疫分析（RIA）10免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件11免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件12以未結(jié)合的Ag*為F，Ag*Ab復(fù)合物為B，則B/F與Ag的量變存在著函數(shù)關(guān)系。B/F60(％)50403020

10

0.81.62.43.24.04.85.6Ag(ng/ml)以未結(jié)合的Ag*為F，Ag*Ab復(fù)合物為B，則B/F與13測(cè)定方法與步驟1.抗原抗體反應(yīng)：平衡法或非平衡法2.分離結(jié)合與游離標(biāo)記物沉淀劑沉淀復(fù)合物，離心分離。如第二抗體沉淀法、聚乙二醇沉淀法或活性炭吸附法等。要求：分離徹底，迅速；分離試劑和過(guò)程不影響反應(yīng)平衡；操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好且經(jīng)濟(jì)。3.放射性測(cè)定及數(shù)據(jù)處理晶體閃爍計(jì)數(shù)儀(γ射線)或液體閃爍計(jì)數(shù)儀(β射線)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待檢抗原濃度。測(cè)定方法與步驟14免疫放射分析（IRMA）基本原理

單位點(diǎn)IRMA：利用過(guò)量標(biāo)記抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，反應(yīng)平衡后，用固相抗原結(jié)合反應(yīng)液中剩余的未結(jié)合標(biāo)記抗體并將其分離，測(cè)定上清液的放射量。免疫放射分析（IRMA）15免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件16雙位點(diǎn)IRMA先用固相抗體與抗原反應(yīng)結(jié)合,然后再用過(guò)量的標(biāo)記抗體與已結(jié)合于固相抗原的另一抗原決定簇結(jié)合,形成固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物,洗棄反應(yīng)液中剩余的標(biāo)記抗體,測(cè)定固相上的放射性。雙位點(diǎn)IRMA先用固相抗體與抗原反應(yīng)結(jié)合,然后再用過(guò)量17免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件18IRMA與RIA的異同點(diǎn)

標(biāo)記物

在RIA中核素標(biāo)記抗原，抗原有不同種類，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)，標(biāo)記時(shí)需用不同的核素和不同的方法。在IRMA中核素標(biāo)記抗體?？贵w為蛋白質(zhì)，有利于碘化標(biāo)記，不同抗體標(biāo)記方法基本相同。標(biāo)記抗體的比活度高，提高了分析的靈敏度。反應(yīng)速率反應(yīng)速度與反應(yīng)物的濃度呈正比，在IRMA中標(biāo)記抗體是過(guò)量的，而且不存在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合復(fù)雜的反應(yīng)，所以反應(yīng)速度較RIA快。在RIA中抗體量是微量的，所以一定要用高親和力的多克隆抗體，而在IRMA中應(yīng)用親和力較低的單克隆體也能得到滿意的結(jié)果。IRMA與RIA的異同點(diǎn)19反應(yīng)原理

RIA為競(jìng)爭(zhēng)抑制，測(cè)得放射性的量與受檢抗原呈反比。IRMA為非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，劑量反應(yīng)曲線為正相關(guān)的直線關(guān)系。特異性

在雙位點(diǎn)IRMA中，一般均應(yīng)用針對(duì)不同位點(diǎn)的單克隆抗體，其交叉反應(yīng)率低于應(yīng)用多克隆抗體的RIA。檢測(cè)范圍

通常RIA的工作范圍為2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，而RIMA可達(dá)3個(gè)數(shù)量級(jí)以上。反應(yīng)原理RIA為競(jìng)爭(zhēng)抑制，測(cè)得放射性的量與受檢抗原呈反20分析誤差RIA中加入的抗體和標(biāo)記抗原都是定量的，加樣誤差可嚴(yán)重影響測(cè)定結(jié)果。IRMA中標(biāo)記和固相抗體在反應(yīng)中都是過(guò)量的，只有受檢標(biāo)本的加樣誤差才會(huì)影響分析結(jié)果。因此，IRMA的批內(nèi)和批間變異均比較小。其他RIA可以測(cè)定大分子量與小分子量的物質(zhì)，雙位點(diǎn)IRMA只能測(cè)定在分子上具有2個(gè)以上抗原表位的物質(zhì)。在RIA中應(yīng)用的為多克隆抗體，親和力和特異性要求較高，但用量很少。IRMA中標(biāo)記抗體和固相抗體用量較多，一般均用來(lái)源豐富、特異性較高的單克隆抗體。

分析誤差RIA中加入的抗體和標(biāo)記抗原都是定量的，加樣誤21放射免疫技術(shù)的應(yīng)用常用于各種激素、微量蛋白、腫瘤標(biāo)志物和藥物等微量物質(zhì)的測(cè)定。問(wèn)題：放射性污染、常用核素半衰期短、試劑盒穩(wěn)定期不長(zhǎng)不易自動(dòng)化儀器分析等。放射免疫技術(shù)的應(yīng)用22第九章免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)(immunofluorescencetechnique)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。

是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光物質(zhì)檢測(cè)的敏感性和直觀性結(jié)合起來(lái)的一種方法。

第九章免疫熒光技術(shù)23基本原理利用熒光素標(biāo)記抗體，使之在涂片上或組織切片上與標(biāo)本中的待檢抗原特異結(jié)合，采用高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，透過(guò)濾色板發(fā)出一定波長(zhǎng)的光，使結(jié)合在標(biāo)本上的熒光素被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，借助熒光顯微鏡觀察底物片上熒光染色形態(tài)，來(lái)判斷有無(wú)待檢抗原或抗體?；驹?4第一節(jié)熒光的基本知識(shí)第一節(jié)熒光的基本知識(shí)25異硫氰酸熒光素（FITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，分子量為389.4，最大吸收光波長(zhǎng)為490-495nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)520-530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，是應(yīng)用最廣泛的熒光素。主要優(yōu)點(diǎn)：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感；②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色，降低背景干擾

。異硫氰酸熒光素（FITC）26免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件27四乙基羅丹明（RB200）

為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。最大吸收光波長(zhǎng)為570nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為595－600nm，呈橘紅色熒光。常用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?/p>

四乙基羅丹明（RB200）28四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）

最大吸引光波長(zhǎng)為550nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈橙紅色熒光。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。

四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）29

熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長(zhǎng)時(shí)間的照射后會(huì)減弱甚至猝滅，一些化合物對(duì)熒光有猝滅作用，因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長(zhǎng)時(shí)間的照射后會(huì)減弱甚至猝30熒光抗體的制備作為標(biāo)記的熒光素應(yīng)符合以下要求：

①應(yīng)具有能與蛋白質(zhì)分子形成共價(jià)健的化學(xué)基團(tuán)，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。②熒光效率高,與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高的熒光效率。③熒光色澤與背景組織的色澤對(duì)比鮮明。④與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)，與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。

⑤標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、安全無(wú)毒。熒光抗體的制備31熒光抗體是將熒光素（如FITC）與特異性抗體以化學(xué)方式共價(jià)結(jié)合而成。

標(biāo)記方法：攪拌法(適合大樣品)透析法(適合小樣品)標(biāo)記抗體的純化：透析法層析分離法

熒光抗體是將熒光素（如FITC）與特異性抗體以化學(xué)方式共價(jià)結(jié)32熒光抗體的鑒定F/P比率：將制備的熒光抗體稀釋至A280≈1.0，分別測(cè)讀A280（蛋白質(zhì)特異吸收峰）和標(biāo)記熒光素的特異吸收峰熒光抗體的鑒定F/P比率：33F/P值越高，說(shuō)明抗體分子上結(jié)合的熒光素越多，反之則越少。一般用于固定標(biāo)本的熒光抗體以F/P＝1.5為宜，用于活細(xì)胞染色的以F/P＝2.4為宜。

F/P值越高，說(shuō)明抗體分子上結(jié)合的熒光素越多，反之則越少。一34抗體效價(jià)：效價(jià)越大標(biāo)記抗體的特異性越高非特異熒光越少。效價(jià)在1:16-1:32者較為理想抗體特異性：免疫電泳和交叉免疫電泳觀察特異性沉淀線或沉淀峰，在紫外線照射下發(fā)出強(qiáng)烈熒光抗體效價(jià)：效價(jià)越大標(biāo)記抗體的特異性越高非特異熒光越少。效價(jià)在35第二節(jié)免疫熒光顯微技術(shù)基本原理：使熒光抗體與標(biāo)本切片中組織或細(xì)胞表面的抗原進(jìn)行反應(yīng)，洗滌除去游離的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見(jiàn)明亮的特異熒光。

第二節(jié)免疫熒光顯微技術(shù)36直接法

熒光抗體染色直接法熒光抗體染色37直接法優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、特異性高、非特異熒光染色因素少，缺點(diǎn)：靈敏度偏低，每檢查一種抗原需制備相應(yīng)的特異熒光抗體直接法38間接法

間接法39間接法優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，在不同抗原的檢測(cè)中只需應(yīng)用一種熒光抗體。既可檢測(cè)抗原，也可檢測(cè)抗體。間接法40免疫熒光技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用在細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中主要用于菌種的鑒定。免疫熒光用于梅毒螺旋體抗體的檢測(cè)是梅毒特異性診斷常用方法之一。用熒光抗體染色法可檢出病毒及其繁殖情況。在寄生蟲(chóng)感染診斷中，間接免疫熒光試驗(yàn)（IFAT）是當(dāng)前公認(rèn)的最有效的檢測(cè)瘧疾抗體的方法。免疫熒光技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用41免疫熒光法還是檢測(cè)自身抗體的好工具，在自身免疫病的實(shí)驗(yàn)診斷中應(yīng)用廣泛。其突出優(yōu)點(diǎn)是能以簡(jiǎn)單方法同時(shí)檢測(cè)抗體和與抗體起特異反應(yīng)的組織成分，并能在同一組織中同時(shí)檢查抗不同組織成分的抗體。熒光抗體技術(shù)的一種特殊應(yīng)用是流式細(xì)胞分析（flowcytometry）?？捎糜跈z測(cè)細(xì)胞大小、折散率、粘滯度等，更常用于T細(xì)胞亞群等的檢測(cè)。免疫熒光法還是檢測(cè)自身抗體的好工具，在自身免疫病的實(shí)驗(yàn)診斷中42第十章酶免疫技術(shù)

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件43第一節(jié)酶免疫技術(shù)概述基本原理利用酶催化底物反應(yīng)的生物放大作用,提高特異性抗原-抗體免疫學(xué)反應(yīng)的檢測(cè)敏感性的一種標(biāo)記免疫技術(shù)。

第一節(jié)酶免疫技術(shù)概述44基本特點(diǎn)：①標(biāo)記后保留酶和抗原(抗體)的活性②酶促反應(yīng)專一性，保證特異性③底物反應(yīng)放大作用，提高敏感性④酶標(biāo)試劑保存穩(wěn)定⑤操作簡(jiǎn)便，安全易行基本特點(diǎn)：45主要試劑的制備與要求主要試劑的制備與要求46一、酶與酶作用底物（一）用于標(biāo)記酶的要求：酶活性高標(biāo)記后酶活性穩(wěn)定，且不影響標(biāo)記抗原與抗體的免疫反應(yīng)性酶催化底物后信號(hào)易判定或測(cè)定酶活性不受樣品中其他成分的影響酶、輔助因子及底物理化性質(zhì)穩(wěn)定，安全無(wú)害，價(jià)廉一、酶與酶作用底物47（二）常用酶及其底物1.辣根過(guò)氧化物酶（HRP）常用底物：鄰苯二胺（OPD）：反應(yīng)顯橙黃色，應(yīng)避光，致癌性四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：反應(yīng)后呈藍(lán)色，無(wú)需避光，無(wú)致癌性，但水溶性差。（二）常用酶及其底物48免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件492.堿性磷酸酶（AP）

常用底物為對(duì)硝基苯磷酸酯（p-NPP），產(chǎn)物為黃色。

*AP靈敏性高與HRP，但不易獲得純品，穩(wěn)定性及酶標(biāo)記物收率低于HRP，且價(jià)高，故應(yīng)用不如HRP普及。2.堿性磷酸酶（AP）50二、酶標(biāo)記抗體或抗原基本要求：酶標(biāo)記抗原純度要高，抗原性完整；抗體的特異性好，效價(jià)高，親和力強(qiáng)，比活性高以及易于批量生產(chǎn)和分離純化二、酶標(biāo)記抗體或抗原51酶標(biāo)記方法

1.交聯(lián)法以雙功能交聯(lián)劑為“橋”，分別與酶和抗體（抗原）連接形成結(jié)合物。如戊二醛交聯(lián)法。2.直接法

用過(guò)碘酸鈉活化酶蛋白分子后，再與抗體（抗原）結(jié)合。僅適用于含糖蛋白分子的酶（如HRP）標(biāo)記物制備。酶標(biāo)記方法52三、固相載體基本要求結(jié)合容量高，結(jié)合穩(wěn)定；可與抗原抗體復(fù)合物等大分子蛋白結(jié)合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法簡(jiǎn)便易行、快捷經(jīng)濟(jì)。三、固相載體53固相載體的種類與選擇1.塑料制品材料經(jīng)濟(jì)，操作簡(jiǎn)便，易于自動(dòng)化，最常用。2.微顆粒結(jié)合容量大，反應(yīng)迅速，逐漸普遍用于自動(dòng)化分析。3.膜載體硝酸纖維素膜（NC）、尼龍膜等微孔濾膜，廣泛應(yīng)用于定性或半定量的斑點(diǎn)ELISA。固相載體的種類與選擇54四、免疫吸附劑原理：非共價(jià)鍵吸附或共價(jià)鍵化學(xué)偶聯(lián)（包被）。一般采用偏堿性（pH9.6）的碳酸鹽溶液（ELISA板）。封閉：1％－5％牛血清白蛋白或5％－20％小牛血清。四、免疫吸附劑55酶免疫技術(shù)的分類

酶免疫組化用于檢測(cè)組織切片或細(xì)胞涂片中的抗原和抗體

酶免疫技術(shù)均相酶免疫測(cè)定酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定異相酶免疫測(cè)定（ELISA）液相酶免疫測(cè)定酶免疫技術(shù)的分類56均相酶免疫測(cè)定Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E基本原理：利用酶標(biāo)抗體結(jié)合抗原形成復(fù)合物后，標(biāo)記酶的活性發(fā)生改變的原理，在不將復(fù)合物與游離酶標(biāo)抗體分離的情況下，直接測(cè)定系統(tǒng)中總的標(biāo)記酶活性的改變，進(jìn)而推算出待檢樣品中的抗原量。均相酶免疫測(cè)定Ag+Ab-EAgAb-E57異相酶免疫測(cè)定（enzymeimmunoassay,EIA）基本原理：在抗原抗體反應(yīng)后，先將抗原抗體復(fù)合物與游離的酶標(biāo)抗體分離，再測(cè)定酶標(biāo)記的復(fù)合物催化底物顯色的活性，最后推算出樣品中抗原的含量。液相EIA：分離劑分離游離的和結(jié)合的標(biāo)記物。固相EIA：固相載體結(jié)合酶標(biāo)復(fù)合物，經(jīng)洗滌去除游離的酶標(biāo)抗體。如ELISA。Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E異相酶免疫測(cè)定（enzymeimmunoassay,EIA）58

第二節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)enzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)

第二節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)59基本原理：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)基本原理：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活60用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，61ELISA技術(shù)類型：

ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體，在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體，酶標(biāo)記的抗原或抗體，酶作用的底物。ELISA技術(shù)類型：ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定62免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件631．雙抗體夾心法

1．雙抗體夾心法64免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件65特點(diǎn)：非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)常用于抗原的檢測(cè)適用于分子中具有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測(cè)所用兩種抗體分別針對(duì)同一個(gè)抗原分子的不同抗原決定簇

特點(diǎn)：662．間接法

2．間接法67免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件683.競(jìng)爭(zhēng)法

3.競(jìng)爭(zhēng)法69特點(diǎn)：用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可對(duì)抗體進(jìn)行測(cè)定。酶標(biāo)Ag（Ab）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的非標(biāo)記Ag（Ab）具有相同的與固相Ab(Ag)結(jié)合的能力。反應(yīng)體系中，固相Ab（Ag）和酶標(biāo)Ag（Ab）是固定限量的，且前者的結(jié)合位點(diǎn)少于酶標(biāo)記與非標(biāo)記Ag（Ab）的分子數(shù)量和。反應(yīng)后，結(jié)合與固相載體上復(fù)合物中被測(cè)定的酶標(biāo)Ag（Ab）的量（酶活性）與樣品中非標(biāo)記Ag（Ab）的濃度成反比。特點(diǎn)：704.捕獲法（反向間接法）

主要用于血清中某種抗體亞型成分（如IgM）的測(cè)定。基本原理：

固相抗IgM待檢標(biāo)本(IgM)抗原(與特異抗體結(jié)合)酶標(biāo)抗體底物4.捕獲法（反向間接法）固相抗IgM待檢標(biāo)本(IgM)抗原(71

第三節(jié)膜載體的酶免疫測(cè)定固相膜免疫測(cè)定與ELISA相類似,其特點(diǎn)是以微孔膜作為固相.標(biāo)記物可用酶和各種有色微粒子,如彩色乳膠、膠體金等。常用固相膜為硝酸纖維素膜。類型：免疫滲濾試驗(yàn)：穿流形式免疫層析試驗(yàn)：橫流形式斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)（dot-ELISA）免疫印跡法(Westernblot)

第三節(jié)膜載體的酶免疫測(cè)定72免疫印跡法（immunoblottingtest，IBT）亦被稱為Westernblot分三個(gè)階段進(jìn)行:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）電轉(zhuǎn)移酶免疫定位

免疫印跡法（immunoblottingtest，IBT）73SDS抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯胺凝膠中從陰極向陽(yáng)泳動(dòng)，分子量越小，泳動(dòng)速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見(jiàn)（只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶）

SDS74免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件75電轉(zhuǎn)移將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1-2A），通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此分階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見(jiàn)。電轉(zhuǎn)移76酶免疫定位將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜（相當(dāng)于包被了抗原的固相載體）依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。陽(yáng)性反應(yīng)的條帶清晰可辨，并可根據(jù)SDA加入的分子量標(biāo)準(zhǔn)，確定各組分的分子量。酶免疫定位77免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件78免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件79第四節(jié)酶免疫測(cè)定的應(yīng)用第四節(jié)酶免疫測(cè)定的應(yīng)用80病原體及其抗體廣泛應(yīng)用于傳染病的診斷。病毒如肝炎病毒、風(fēng)疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等；細(xì)菌如鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌、幽門螺桿菌和布氏桿菌等；寄生蟲(chóng)如弓形體、阿米巴、瘧原蟲(chóng)等。蛋白質(zhì)如各種免疫球蛋白、補(bǔ)體組分、腫瘤標(biāo)志物（例如AFP、CEA、PSA）、多種血漿蛋白質(zhì)、同工酶、激素（如HCG、TSH）。非肽類激素如T3、T4、雌激素、皮質(zhì)醇等。藥物和毒品如地高辛、苯巴比妥、慶大霉素、嗎啡等。

病原體及其抗體廣泛應(yīng)用于傳染病的診斷。病毒如肝炎病毒、風(fēng)疹病81ABC-ELISA(應(yīng)用親和素和生物素的ELISA)ABC-ELISA82生物素-親合素系統(tǒng)(biotin-avidinsystem，BAS)，是70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué)，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。由于它具有生物素與親合素之間高度親和力及多級(jí)放大效應(yīng)，并與熒光素、酶、同位素等免疫標(biāo)記技術(shù)有機(jī)地結(jié)合，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進(jìn)一步提高。生物素-親合素系統(tǒng)(biotin-avidin83親和素是一種糖蛋白，可以和4個(gè)生物素分子親密結(jié)合。現(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）。卵黃、肝組織提取用化學(xué)方法制成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）。末端羧基可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素是一種糖蛋白，可以和4個(gè)生物素分子親密結(jié)合。現(xiàn)在使用更84

親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于1個(gè)親和素分子有4個(gè)生物素分子的結(jié)合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復(fù)合體。因此把親和素和生物素與ELIS偶聯(lián)起來(lái)，就可大提高ELISA的敏感度。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和85橋聯(lián)法ABC-ELISA（avidinbiotincomplex-ELISA）夾心法測(cè)抗原的過(guò)程橋聯(lián)法ABC-ELISA（avidinbiotincompl86廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的各個(gè)領(lǐng)域，既可用于微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測(cè)及定位觀察研究，亦可制成親和介質(zhì)用于上述各類反應(yīng)體系中反應(yīng)物的分離、純化。

廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的各個(gè)領(lǐng)域，既可用于微量87標(biāo)記免疫技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏性特異性標(biāo)記免疫技術(shù)的主要特點(diǎn)：高特異性、高靈敏性免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏性特異性標(biāo)記免疫技術(shù)88標(biāo)記免疫技術(shù)免疫測(cè)定技術(shù)免疫組化技術(shù)示蹤物及標(biāo)記技術(shù)放射免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光技術(shù)金免疫技術(shù)???標(biāo)記免疫技術(shù)免疫測(cè)定技術(shù)免疫組化技術(shù)示蹤物及放射免疫技術(shù)89第八章放射免疫技術(shù)

類型：放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA）免疫放射分析（immunoradiometricassay,IRMA）

廣義放射免疫技術(shù)還包括放射受體分析（使用受體測(cè)量抗原）和放射配體結(jié)合分析（使用配體研究受體）。特點(diǎn):靈敏度高(10-9-10-15g/L)、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等第八章放射免疫技術(shù)90標(biāo)記物:常用的核素有兩大類γ射線：131I、125I、57Cr和60Coβ射線：14C、3H和32P。使用最廣泛的是：125I①性質(zhì)活潑、易制備標(biāo)記物②對(duì)被標(biāo)記物的免疫活性影響?、蹨y(cè)量方法簡(jiǎn)便、已推廣④半衰期較長(zhǎng)、核素豐度高標(biāo)記物:91標(biāo)記方法125I的標(biāo)記原理：取代分子中酪氨酸或酪胺殘基及組胺殘基上的氫原子方法：直接標(biāo)記法

氯胺T法和乳過(guò)氧化物酶法間接標(biāo)記法

聯(lián)接標(biāo)記法免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件92適用分子原理特點(diǎn)缺點(diǎn)直接標(biāo)記肽類、蛋白質(zhì)、酶存在酪氨酸、組胺殘基等基團(tuán)操作簡(jiǎn)便、易標(biāo)記、比放射性高不適于活性功能區(qū)的殘基標(biāo)記間接標(biāo)記甾類化合物、核苷酸等小分子化合物不存在酪氨酸、組胺殘基等基團(tuán),需添加可避免氧化／還原劑對(duì)被標(biāo)記物活性的損傷等添加基團(tuán)可能影響被標(biāo)記物活性適用分子原理特點(diǎn)缺點(diǎn)直接標(biāo)記肽類、蛋白質(zhì)、酶存在酪氨酸、組胺93標(biāo)記物純化

對(duì)游離的125I等試劑與標(biāo)記物進(jìn)行分離方法：分子篩凝膠過(guò)濾；離子交換層析；聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）；高效液相色譜（HPLC）標(biāo)記物純化94標(biāo)記物鑒定放射化學(xué)純度

單位標(biāo)記物中結(jié)合在被標(biāo)記物上的放射性占總放射性的百分率。一般要求大于95％。免疫活性

標(biāo)記過(guò)程中，被標(biāo)記物活性損傷程度。B/T％>80％，B/T％↑抗原損傷↓。比放射性

單位化學(xué)量標(biāo)記物中所含的放射性強(qiáng)度.常用Ci/g、mCi/mg、Ci/mmol等單位表示。比放射性↑方法更靈敏；過(guò)高輻射自損傷大，對(duì)標(biāo)記物免疫活性影響大，儲(chǔ)存穩(wěn)定性差。標(biāo)記物鑒定95抗血清鑒定多克隆抗體的抗血清是放射免疫分析的主要試劑之一，其質(zhì)量直接影響方法的特異性和靈敏度。親合力選用親和常數(shù)K值大(109~1012L//mol)抗血清特異性其程度可直接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性

滴度最大稀釋度。在本技術(shù)方法中是指結(jié)合50％標(biāo)記抗原時(shí)的抗血清的稀釋度?？寡彖b定96放射免疫分析（RIA）基本原理

采用定量的標(biāo)記抗原（Ag＋）和非標(biāo)記抗原（Ag）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合有限量特異性抗體（Ab）的反應(yīng)。放射免疫分析（RIA）97免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件98免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件99以未結(jié)合的Ag*為F，Ag*Ab復(fù)合物為B，則B/F與Ag的量變存在著函數(shù)關(guān)系。B/F60(％)50403020

10

0.81.62.43.24.04.85.6Ag(ng/ml)以未結(jié)合的Ag*為F，Ag*Ab復(fù)合物為B，則B/F與100測(cè)定方法與步驟1.抗原抗體反應(yīng)：平衡法或非平衡法2.分離結(jié)合與游離標(biāo)記物沉淀劑沉淀復(fù)合物，離心分離。如第二抗體沉淀法、聚乙二醇沉淀法或活性炭吸附法等。要求：分離徹底，迅速；分離試劑和過(guò)程不影響反應(yīng)平衡；操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好且經(jīng)濟(jì)。3.放射性測(cè)定及數(shù)據(jù)處理晶體閃爍計(jì)數(shù)儀(γ射線)或液體閃爍計(jì)數(shù)儀(β射線)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待檢抗原濃度。測(cè)定方法與步驟101免疫放射分析（IRMA）基本原理

單位點(diǎn)IRMA：利用過(guò)量標(biāo)記抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，反應(yīng)平衡后，用固相抗原結(jié)合反應(yīng)液中剩余的未結(jié)合標(biāo)記抗體并將其分離，測(cè)定上清液的放射量。免疫放射分析（IRMA）102免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件103雙位點(diǎn)IRMA先用固相抗體與抗原反應(yīng)結(jié)合,然后再用過(guò)量的標(biāo)記抗體與已結(jié)合于固相抗原的另一抗原決定簇結(jié)合,形成固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物,洗棄反應(yīng)液中剩余的標(biāo)記抗體,測(cè)定固相上的放射性。雙位點(diǎn)IRMA先用固相抗體與抗原反應(yīng)結(jié)合,然后再用過(guò)量104免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件105IRMA與RIA的異同點(diǎn)

標(biāo)記物

在RIA中核素標(biāo)記抗原，抗原有不同種類，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)，標(biāo)記時(shí)需用不同的核素和不同的方法。在IRMA中核素標(biāo)記抗體?？贵w為蛋白質(zhì)，有利于碘化標(biāo)記，不同抗體標(biāo)記方法基本相同。標(biāo)記抗體的比活度高，提高了分析的靈敏度。反應(yīng)速率反應(yīng)速度與反應(yīng)物的濃度呈正比，在IRMA中標(biāo)記抗體是過(guò)量的，而且不存在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合復(fù)雜的反應(yīng)，所以反應(yīng)速度較RIA快。在RIA中抗體量是微量的，所以一定要用高親和力的多克隆抗體，而在IRMA中應(yīng)用親和力較低的單克隆體也能得到滿意的結(jié)果。IRMA與RIA的異同點(diǎn)106反應(yīng)原理

RIA為競(jìng)爭(zhēng)抑制，測(cè)得放射性的量與受檢抗原呈反比。IRMA為非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，劑量反應(yīng)曲線為正相關(guān)的直線關(guān)系。特異性

在雙位點(diǎn)IRMA中，一般均應(yīng)用針對(duì)不同位點(diǎn)的單克隆抗體，其交叉反應(yīng)率低于應(yīng)用多克隆抗體的RIA。檢測(cè)范圍

通常RIA的工作范圍為2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，而RIMA可達(dá)3個(gè)數(shù)量級(jí)以上。反應(yīng)原理RIA為競(jìng)爭(zhēng)抑制，測(cè)得放射性的量與受檢抗原呈反107分析誤差RIA中加入的抗體和標(biāo)記抗原都是定量的，加樣誤差可嚴(yán)重影響測(cè)定結(jié)果。IRMA中標(biāo)記和固相抗體在反應(yīng)中都是過(guò)量的，只有受檢標(biāo)本的加樣誤差才會(huì)影響分析結(jié)果。因此，IRMA的批內(nèi)和批間變異均比較小。其他RIA可以測(cè)定大分子量與小分子量的物質(zhì)，雙位點(diǎn)IRMA只能測(cè)定在分子上具有2個(gè)以上抗原表位的物質(zhì)。在RIA中應(yīng)用的為多克隆抗體，親和力和特異性要求較高，但用量很少。IRMA中標(biāo)記抗體和固相抗體用量較多，一般均用來(lái)源豐富、特異性較高的單克隆抗體。

分析誤差RIA中加入的抗體和標(biāo)記抗原都是定量的，加樣誤108放射免疫技術(shù)的應(yīng)用常用于各種激素、微量蛋白、腫瘤標(biāo)志物和藥物等微量物質(zhì)的測(cè)定。問(wèn)題：放射性污染、常用核素半衰期短、試劑盒穩(wěn)定期不長(zhǎng)不易自動(dòng)化儀器分析等。放射免疫技術(shù)的應(yīng)用109第九章免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)(immunofluorescencetechnique)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。

是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光物質(zhì)檢測(cè)的敏感性和直觀性結(jié)合起來(lái)的一種方法。

第九章免疫熒光技術(shù)110基本原理利用熒光素標(biāo)記抗體，使之在涂片上或組織切片上與標(biāo)本中的待檢抗原特異結(jié)合，采用高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，透過(guò)濾色板發(fā)出一定波長(zhǎng)的光，使結(jié)合在標(biāo)本上的熒光素被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，借助熒光顯微鏡觀察底物片上熒光染色形態(tài)，來(lái)判斷有無(wú)待檢抗原或抗體。基本原理111第一節(jié)熒光的基本知識(shí)第一節(jié)熒光的基本知識(shí)112異硫氰酸熒光素（FITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，分子量為389.4，最大吸收光波長(zhǎng)為490-495nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)520-530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，是應(yīng)用最廣泛的熒光素。主要優(yōu)點(diǎn)：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感；②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色，降低背景干擾

。異硫氰酸熒光素（FITC）113免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件114四乙基羅丹明（RB200）

為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。最大吸收光波長(zhǎng)為570nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為595－600nm，呈橘紅色熒光。常用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?/p>

四乙基羅丹明（RB200）115四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）

最大吸引光波長(zhǎng)為550nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈橙紅色熒光。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。

四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）116

熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長(zhǎng)時(shí)間的照射后會(huì)減弱甚至猝滅，一些化合物對(duì)熒光有猝滅作用，因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長(zhǎng)時(shí)間的照射后會(huì)減弱甚至猝117熒光抗體的制備作為標(biāo)記的熒光素應(yīng)符合以下要求：

①應(yīng)具有能與蛋白質(zhì)分子形成共價(jià)健的化學(xué)基團(tuán)，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。②熒光效率高,與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高的熒光效率。③熒光色澤與背景組織的色澤對(duì)比鮮明。④與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)，與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。

⑤標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、安全無(wú)毒。熒光抗體的制備118熒光抗體是將熒光素（如FITC）與特異性抗體以化學(xué)方式共價(jià)結(jié)合而成。

標(biāo)記方法：攪拌法(適合大樣品)透析法(適合小樣品)標(biāo)記抗體的純化：透析法層析分離法

熒光抗體是將熒光素（如FITC）與特異性抗體以化學(xué)方式共價(jià)結(jié)119熒光抗體的鑒定F/P比率：將制備的熒光抗體稀釋至A280≈1.0，分別測(cè)讀A280（蛋白質(zhì)特異吸收峰）和標(biāo)記熒光素的特異吸收峰熒光抗體的鑒定F/P比率：120F/P值越高，說(shuō)明抗體分子上結(jié)合的熒光素越多，反之則越少。一般用于固定標(biāo)本的熒光抗體以F/P＝1.5為宜，用于活細(xì)胞染色的以F/P＝2.4為宜。

F/P值越高，說(shuō)明抗體分子上結(jié)合的熒光素越多，反之則越少。一121抗體效價(jià)：效價(jià)越大標(biāo)記抗體的特異性越高非特異熒光越少。效價(jià)在1:16-1:32者較為理想抗體特異性：免疫電泳和交叉免疫電泳觀察特異性沉淀線或沉淀峰，在紫外線照射下發(fā)出強(qiáng)烈熒光抗體效價(jià)：效價(jià)越大標(biāo)記抗體的特異性越高非特異熒光越少。效價(jià)在122第二節(jié)免疫熒光顯微技術(shù)基本原理：使熒光抗體與標(biāo)本切片中組織或細(xì)胞表面的抗原進(jìn)行反應(yīng)，洗滌除去游離的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見(jiàn)明亮的特異熒光。

第二節(jié)免疫熒光顯微技術(shù)123直接法

熒光抗體染色直接法熒光抗體染色124直接法優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、特異性高、非特異熒光染色因素少，缺點(diǎn)：靈敏度偏低，每檢查一種抗原需制備相應(yīng)的特異熒光抗體直接法125間接法

間接法126間接法優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，在不同抗原的檢測(cè)中只需應(yīng)用一種熒光抗體。既可檢測(cè)抗原，也可檢測(cè)抗體。間接法127免疫熒光技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用在細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中主要用于菌種的鑒定。免疫熒光用于梅毒螺旋體抗體的檢測(cè)是梅毒特異性診斷常用方法之一。用熒光抗體染色法可檢出病毒及其繁殖情況。在寄生蟲(chóng)感染診斷中，間接免疫熒光試驗(yàn)（IFAT）是當(dāng)前公認(rèn)的最有效的檢測(cè)瘧疾抗體的方法。免疫熒光技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用128免疫熒光法還是檢測(cè)自身抗體的好工具，在自身免疫病的實(shí)驗(yàn)診斷中應(yīng)用廣泛。其突出優(yōu)點(diǎn)是能以簡(jiǎn)單方法同時(shí)檢測(cè)抗體和與抗體起特異反應(yīng)的組織成分，并能在同一組織中同時(shí)檢查抗不同組織成分的抗體。熒光抗體技術(shù)的一種特殊應(yīng)用是流式細(xì)胞分析（flowcytometry）?？捎糜跈z測(cè)細(xì)胞大小、折散率、粘滯度等，更常用于T細(xì)胞亞群等的檢測(cè)。免疫熒光法還是檢測(cè)自身抗體的好工具，在自身免疫病的實(shí)驗(yàn)診斷中129第十章酶免疫技術(shù)

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件130第一節(jié)酶免疫技術(shù)概述基本原理利用酶催化底物反應(yīng)的生物放大作用,提高特異性抗原-抗體免疫學(xué)反應(yīng)的檢測(cè)敏感性的一種標(biāo)記免疫技術(shù)。

第一節(jié)酶免疫技術(shù)概述131基本特點(diǎn)：①標(biāo)記后保留酶和抗原(抗體)的活性②酶促反應(yīng)專一性，保證特異性③底物反應(yīng)放大作用，提高敏感性④酶標(biāo)試劑保存穩(wěn)定⑤操作簡(jiǎn)便，安全易行基本特點(diǎn)：132主要試劑的制備與要求主要試劑的制備與要求133一、酶與酶作用底物（一）用于標(biāo)記酶的要求：酶活性高標(biāo)記后酶活性穩(wěn)定，且不影響標(biāo)記抗原與抗體的免疫反應(yīng)性酶催化底物后信號(hào)易判定或測(cè)定酶活性不受樣品中其他成分的影響酶、輔助因子及底物理化性質(zhì)穩(wěn)定，安全無(wú)害，價(jià)廉一、酶與酶作用底物134（二）常用酶及其底物1.辣根過(guò)氧化物酶（HRP）常用底物：鄰苯二胺（OPD）：反應(yīng)顯橙黃色，應(yīng)避光，致癌性四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：反應(yīng)后呈藍(lán)色，無(wú)需避光，無(wú)致癌性，但水溶性差。（二）常用酶及其底物135免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件1362.堿性磷酸酶（AP）

常用底物為對(duì)硝基苯磷酸酯（p-NPP），產(chǎn)物為黃色。

*AP靈敏性高與HRP，但不易獲得純品，穩(wěn)定性及酶標(biāo)記物收率低于HRP，且價(jià)高，故應(yīng)用不如HRP普及。2.堿性磷酸酶（AP）137二、酶標(biāo)記抗體或抗原基本要求：酶標(biāo)記抗原純度要高，抗原性完整；抗體的特異性好，效價(jià)高，親和力強(qiáng)，比活性高以及易于批量生產(chǎn)和分離純化二、酶標(biāo)記抗體或抗原138酶標(biāo)記方法

1.交聯(lián)法以雙功能交聯(lián)劑為“橋”，分別與酶和抗體（抗原）連接形成結(jié)合物。如戊二醛交聯(lián)法。2.直接法

用過(guò)碘酸鈉活化酶蛋白分子后，再與抗體（抗原）結(jié)合。僅適用于含糖蛋白分子的酶（如HRP）標(biāo)記物制備。酶標(biāo)記方法139三、固相載體基本要求結(jié)合容量高，結(jié)合穩(wěn)定；可與抗原抗體復(fù)合物等大分子蛋白結(jié)合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法簡(jiǎn)便易行、快捷經(jīng)濟(jì)。三、固相載體140固相載體的種類與選擇1.塑料制品材料經(jīng)濟(jì)，操作簡(jiǎn)便，易于自動(dòng)化，最常用。2.微顆粒結(jié)合容量大，反應(yīng)迅速，逐漸普遍用于自動(dòng)化分析。3.膜載體硝酸纖維素膜（NC）、尼龍膜等微孔濾膜，廣泛應(yīng)用于定性或半定量的斑點(diǎn)ELISA。固相載體的種類與選擇141四、免疫吸附劑原理：非共價(jià)鍵吸附或共價(jià)鍵化學(xué)偶聯(lián)（包被）。一般采用偏堿性（pH9.6）的碳酸鹽溶液（ELISA板）。封閉：1％－5％牛血清白蛋白或5％－20％小牛血清。四、免疫吸附劑142酶免疫技術(shù)的分類

酶免疫組化用于檢測(cè)組織切片或細(xì)胞涂片中的抗原和抗體

酶免疫技術(shù)均相酶免疫測(cè)定酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定異相酶免疫測(cè)定（ELISA）液相酶免疫測(cè)定酶免疫技術(shù)的分類143均相酶免疫測(cè)定Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E基本原理：利用酶標(biāo)抗體結(jié)合抗原形成復(fù)合物后，標(biāo)記酶的活性發(fā)生改變的原理，在不將復(fù)合物與游離酶標(biāo)抗體分離的情況下，直接測(cè)定系統(tǒng)中總的標(biāo)記酶活性的改變，進(jìn)而推算出待檢樣品中的抗原量。均相酶免疫測(cè)定Ag+Ab-EAgAb-E144異相酶免疫測(cè)定（enzymeimmunoassay,EIA）基本原理：在抗原抗體反應(yīng)后，先將抗原抗體復(fù)合物與游離的酶標(biāo)抗體分離，再測(cè)定酶標(biāo)記的復(fù)合物催化底物顯色的活性，最后推算出樣品中抗原的含量。液相EIA：分離劑分離游離的和結(jié)合的標(biāo)記物。固相EIA：固相載體結(jié)合酶標(biāo)復(fù)合物，經(jīng)洗滌去除游離的酶標(biāo)抗體。如ELISA。Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E異相酶免疫測(cè)定（enzymeimmunoassay,EIA）145

第二節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)enzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)

第二節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)146基本原理：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)基本原理：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活147用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，148ELISA技術(shù)類型：

ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體，在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體，酶標(biāo)記的抗原或抗體，酶作用的底物。ELISA技術(shù)類型：ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定149免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件1501．雙抗體夾心法

1．雙抗體夾心法151免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件152特點(diǎn)：非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)常用于抗原的檢測(cè)適用于分子中具有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測(cè)所用兩種抗體分別針對(duì)同一個(gè)抗原分子的不同抗原決定簇

特點(diǎn)：1532．間接法

2．間接法154免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)課件1553.競(jìng)爭(zhēng)法

3.競(jìng)爭(zhēng)法156特點(diǎn)：用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可對(duì)抗體進(jìn)行測(cè)定。酶標(biāo)Ag（Ab）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的非標(biāo)記Ag（Ab）具有相同的與固相Ab(Ag)結(jié)合的能力。反應(yīng)體系中，固相Ab（Ag）和酶標(biāo)Ag（Ab）是固定限量的，且前者的結(jié)合位點(diǎn)少于酶標(biāo)記與非標(biāo)記Ag