分子生物學(xué)常用技術(shù)課件

第二十一章分子生物學(xué)常用技術(shù)ThePopularTechnologyinMolecularBiology1/3/20231第二十一章分子生物學(xué)常用技術(shù)12/27/20221第2節(jié)PCR技術(shù)第3節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)與基因剔除技術(shù)第1節(jié)分子印跡與雜交技術(shù)第6節(jié)蛋白質(zhì)與核酸相互作用研究技術(shù)第4節(jié)生物芯片技術(shù)第5節(jié)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)1/3/20232第2節(jié)PCR技術(shù)第3節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)與基因剔除技術(shù)第1節(jié)第一節(jié)

分子印跡與雜交技術(shù)

MolecularBlotting&HybridizationTechnology1/3/20233第一節(jié)

分子印跡與雜交技術(shù)

MolecularBlott一、核酸分子印跡與雜交技術(shù)指具有一定互補(bǔ)序列，不同來源的核苷酸單鏈，在一定條件下按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則形成雙鏈的過程。核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)印跡(blotting)指利用各種物理方法，使電泳凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到硝基纖維膜等特定的支持物上，使之成為固相化分子的過程。1/3/20234學(xué)習(xí)要求1一、核酸分子印跡與雜交技術(shù)指具有一定互補(bǔ)序列，不(heteroduplex)1/3/20235(heteroduplex)12/27/20225探針(probe)探針種類標(biāo)記物指可用來檢測(cè)某一特定核苷酸序列或基因序列的,與被測(cè)序列互補(bǔ)并經(jīng)過特殊標(biāo)記的DNA或RNA片段。寡核苷酸基因組DNAcDNA片段RNA片段放射性同位素地高辛生物素?zé)晒馊玖蟫-32PATPa-32PdATP1/3/20236HdATP**探針(probe)探針種類標(biāo)記物指可用來檢測(cè)某一特定1/3/20237dUTPDig-dUTPBiotin-dUTP非放射性標(biāo)記物12/27/20227dUTPDig-dUTPBiotin-Dig-DNA探針雜交化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測(cè)原理

Luminol化學(xué)發(fā)光原理Dig-DNA探針雜交化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測(cè)原理Luminol化Biotin-DNA探針雜交化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測(cè)原理

Luminol化學(xué)發(fā)光原理BiotinAvidinBiotin-DNA探針雜交化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測(cè)原理Lumin（一）Southern印跡雜交

Southern印跡雜交（Southernblotting）是指DNA與DNA分子之間的雜交?；具^程:

將瓊脂糖凝膠電泳分離的待測(cè)DNA片段變性，再將凝膠中的DNA分子轉(zhuǎn)移到硝基纖維膜等固相支持物上，然后用標(biāo)記的探針檢測(cè)待測(cè)的DNA?？捎糜诨蚪MDNA的定性與定量分析，重組質(zhì)粒和噬菌體的分析等。1/3/202310（一）Southern印跡雜交Southern印跡Southern印跡雜交的基本步驟:

①待測(cè)DNA樣品的限制性內(nèi)切酶消化②酶切DNA樣品的電泳分離③凝膠中DNA的變性和Southern印跡

④探針的制備⑤Southern雜交⑥雜交結(jié)果的檢測(cè)1/3/202311Southern印跡雜交的基本步驟:①待測(cè)DNA樣品的限支持物轉(zhuǎn)移緩沖液Whatman濾紙凝膠Whatman濾紙紙巾玻璃板重物500gNC膜或尼龍膜支持物轉(zhuǎn)移緩沖液Whatman濾紙凝膠Whatman濾紙紙巾（二）Northern印跡雜交

利用類似于Southern印跡雜交的技術(shù)來檢測(cè)RNA稱為Northern印跡雜交（Northernblotting）。原理和過程與Southern印跡基本相同，只是檢測(cè)的分子是RNA，可用來對(duì)組織或細(xì)胞中的mRNA進(jìn)行定性或定量分析。1/3/202313（二）Northern印跡雜交利用類似于SouthNorthern與Southernblotting的異同點(diǎn)相同點(diǎn)：原理均為毛細(xì)作用用途：檢測(cè)組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平；比較不同組織和細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。不同點(diǎn)：轉(zhuǎn)移的是RNA轉(zhuǎn)移前無需酶切轉(zhuǎn)移效率較高變性方法:DNA(堿變性）

RNA（甲醛、乙二醛等）1/3/202314Northern與Southernblotting的異同④HRP/AP標(biāo)記抗體與Dig結(jié)合②漂洗和封閉YHRPHRPHRP⑤底物與抗體-HRP/AP反應(yīng),顯色或發(fā)光底物①

電泳,轉(zhuǎn)膜，紫外交聯(lián)固定D││D

North-South雜交原理和操作流程(地高辛標(biāo)記)③雜交：Dig標(biāo)記的探針與靶DNA結(jié)合1/3/202315④HRP/AP標(biāo)記抗體與Dig結(jié)合②漂洗和封閉YHRPHRP

North-South雜交原理和操作流程(Biotin標(biāo)記)③雜交：生物素標(biāo)記探針與靶DNA結(jié)合⑤底物在HRP催化下,反應(yīng)發(fā)光①電泳,轉(zhuǎn)膜，紫外交聯(lián)固定SAHRP底物B││B④HRP標(biāo)記的鏈親和素與探針上的生物素結(jié)合1/3/202316②漂洗和封閉North-South雜交原理和操作流程(Biotin標(biāo)1.曝光：用濾紙吸去雜交膜上多余底物，作好標(biāo)記，

保鮮膜包裹，放在暗夾里，放上X光片，曝光1-5

分鐘；2.顯影：取出X光片，按使用說明書顯影和定影。后繼的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)

Luminol化學(xué)發(fā)光原理1/3/2023171.曝光：用濾紙吸去雜交膜上多余底物，作好標(biāo)記，2.顯影：?。ㄈ┢渌怂犭s交方法1.斑點(diǎn)印跡雜交2.原位雜交（insituhybridization）

將變性的DNA或RNA直接點(diǎn)樣于NC膜或尼龍膜上，故稱為斑點(diǎn)印跡。簡(jiǎn)便、快速，可以在同一張膜上進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè)。

是指直接用組織切片或細(xì)胞涂片進(jìn)行雜交的方法，可用于檢測(cè)組織切片或細(xì)胞內(nèi)某些特異性核苷酸或核酸片段。1/3/202318（三）其他核酸雜交方法1.斑點(diǎn)印跡雜交2.原位雜交（in二、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Westernblotting)

根據(jù)蛋白質(zhì)分子之間存在相互作用的特點(diǎn)，將蛋白質(zhì)電泳分離，然后將其轉(zhuǎn)移和固定于固體支持物（NC膜或其它膜）上，再用相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子（最常用的是抗體）對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。因此，被稱為免疫印跡（immunoblotting）技術(shù)。

用Westernblotting檢測(cè)樣品中存在特異蛋白質(zhì)用于細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的定量分析用于蛋白質(zhì)分子的相互作用研究1/3/202319二、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Westernblotting)1/3/20232012/27/202220③HRP/AP標(biāo)記抗體與蛋白結(jié)合②漂洗和封閉YHRPHRPHRP④底物與抗體-HRP/AP反應(yīng),顯色或發(fā)光底物①電泳分離,轉(zhuǎn)膜,固定蛋白于膜上1.WesternBlotting直接法操作流程:1/3/202321③HRP/AP標(biāo)記抗體與蛋白結(jié)合②漂洗和封閉YHRPHRPH優(yōu)點(diǎn)：1.快速（一種抗體）2.沒有二抗交叉反應(yīng)引起的非特異性條帶缺點(diǎn)：1.免疫反應(yīng)性較低2.無信號(hào)二級(jí)放大3.抗體標(biāo)記費(fèi)時(shí)昂貴,使用不方便1/3/202322優(yōu)點(diǎn)：1.快速（一種抗體）2.沒有二抗交叉反④HRP/AP標(biāo)記二抗與一抗－蛋白復(fù)合物結(jié)合②漂洗和封閉YYHRPHRPHRP⑤底物與二抗-HRP/AP反應(yīng),顯色或發(fā)光底物①電泳分離,轉(zhuǎn)膜,固定蛋白于膜上③一抗與蛋白結(jié)合(小鼠單抗或兔多抗)2.WesternBlotting間接法操作流程:1/3/202323④HRP/AP標(biāo)記二抗與一抗－蛋白復(fù)合物結(jié)合②漂洗和封閉YY缺點(diǎn)：1.較慢速（2種抗體）2.有二抗交叉反應(yīng)引起的非特異性條帶優(yōu)點(diǎn)：1.免疫反應(yīng)性較高2.有信號(hào)二級(jí)放大，靈敏度高3.可選用的標(biāo)記二抗體商品多,使用方便1/3/202324缺點(diǎn)：1.較慢速（2種抗體）2.有二抗交叉反

三種印跡技術(shù)的比較

Southernblotting

NorthernblottingWesternblotting樣品限制性內(nèi)切酶消化電泳變性轉(zhuǎn)移膜紫外交聯(lián)儀等固定雜交標(biāo)記物DNARNA蛋白質(zhì)需要不需要不需要瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳SDS電泳堿變性甲醛或戊二醛變性高溫變性NC膜或尼龍膜NC膜或尼龍膜NC膜或PVDF膜需要需要不需要標(biāo)記探針標(biāo)記探針 (標(biāo)記)抗體1/3/202325三種印跡技術(shù)的比較Southernblot第二節(jié)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用PolymeraseChainReaction1/3/202326第二節(jié)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用12/27/2022265Primer15Primer2Cycle2Cycle155

55

5

5TemplateDNA55

555

5

55一、PCR技術(shù)的基本原理1/3/2023275Primer15Primer2Cycle2CycCycle3555555555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。1/3/202328Cycle35555555555模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶

(Taq

DNA聚合酶)dNTPsMg2+

PCR體系基本組成成分1/3/202329一、PCR技術(shù)的基本原理模板DNAPCR體系基本組成成分12/27/202229PCR反應(yīng)循環(huán)變性95?C左右延伸酶最適溫度72℃退火Tm-5?C55℃

經(jīng)過30個(gè)左右的循環(huán)后，PCR的擴(kuò)增倍數(shù)為(1+x)n,x=75%,n為循環(huán)數(shù).PCR反應(yīng)循環(huán)變性延伸退火經(jīng)過30個(gè)左右的循環(huán)后，P二、PCR技術(shù)的主要特點(diǎn)1.特異性強(qiáng)2.靈敏度高3.簡(jiǎn)便快速4.對(duì)標(biāo)本的純度要求低1/3/202331二、PCR技術(shù)的主要特點(diǎn)1.特異性強(qiáng)2.靈敏度高1/3/202332（三）基因突變分析PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測(cè)的敏感性。（四）DNA和RNA的微量分析（五）DNA序列測(cè)定學(xué)習(xí)要求2（二）基因的體外定點(diǎn)突變--PCR定點(diǎn)誘變?nèi)?、PCR技術(shù)的主要用途（一）目的基因的擴(kuò)增與克隆12/27/202232（三）基因突變分析（四）DNA2.利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段。3.利用簡(jiǎn)并引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中獲得具有一定同源性的基因片段。4.利用隨機(jī)引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中隨機(jī)克隆基因。1.與反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接從組織和細(xì)胞的mRNA獲得目的基因片段。1/3/202333（一）目的基因的擴(kuò)增與克隆2.利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已5’3’3’5’引物A引物A’混合,變性,退火5’3’5’3’3’5’3’5’+DNA聚合酶5’3’3’5’5’3’3’5’用引物B和B’作PCR（二）基因的體外定點(diǎn)突變--PCR定點(diǎn)誘變引物B引物B’5’5’3’3’PCRPCRPCR3’3’5’5’PCR5’5’3’3’5’3’3’5’引物A引物A’混合,變性,退火5’5’3’3TheNobelPrizeinChemistry1993"forcontributionstothedevelopmentsofmethodswithinDNA-basedchemistry"MichaelSmith1944-1932-2000LaJolla,CA,USAKaryB.MullisUniversityofBritishColumbiaVancouver,Canada"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method""forhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudies"1/3/202335TheNobelPrizeinChemistry1電泳負(fù)極正極

測(cè)序反應(yīng)

GATC（五）末端合成終止法測(cè)定DNA序列的原理*2’，3’雙脫氧核苷酸*用4種不同熒光標(biāo)記

DNA樣品、引物DNA聚合酶、dNTPddGddAddTddC5'

3'

CCGATTCTTGCACCTGAGGCTAAAAACGTGGACTGGCTAAAddAAddAGGCTAAAAAddCGGCTAAAAACddGGGCTAAAAACGddTGGCTAAAAACGTddGGGCTAAAAACGTGddGGGCTAAAAACGTGGddAGGCTAAAAACGTGGAddCGGCTAAAAACGTGGACddTGGCTAAA電泳負(fù)極正極測(cè)序反應(yīng)GATC（五）末端合成終止法測(cè)定DDNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果1/3/202337DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果12/27/202237TheNobelPrizeinChemistry1980"forhisfundamentalstudiesofthebiochemistryofnucleicacids,withparticularregardtorecombinant-DNA""fortheircontributionsconcerningthedeterminationofbasesequencesinnucleicacids"PaulBerg1/2oftheprizeStanfordUniversityStanford,CA,USA1926-WalterGilbertFrederickSanger1/4oftheprize1/4oftheprize

HarvardUniversity,BiologicalLaboratoriesCambridge,MA,USAMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdom1932-1918-TheNobelPrizeinChemistry1彌補(bǔ)了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。（二）原位PCR技術(shù)(insituPCR)（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)

(real-timePCR)通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對(duì)定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。1/3/202339（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(RT-PCR)

四、幾種重要的PCR衍生技術(shù)

是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對(duì)已知序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法彌補(bǔ)了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR

PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而使熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)；每擴(kuò)增一條DNA鏈就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。1/3/202340實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3第三節(jié)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)與基因剔除技術(shù)

TransgenicTechnology&Gene

KnockoutTechnology1/3/202341第三節(jié)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)與基因剔除技術(shù)

TransgenicT

是指將外源基因整合到動(dòng)物或植物細(xì)胞的基因組中，并使外源基因在動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞中穩(wěn)定地遺傳和表達(dá)的技術(shù)?；虻膶?dǎo)入方式主要：

顯微注射法(最常用)胚胎干細(xì)胞法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法1/3/202342一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指將外源基因整合到動(dòng)物或植物細(xì)胞的基因組中，并使外轉(zhuǎn)基因小鼠正常小鼠1982年哈佛R.D.Palmiter“制造”的“超級(jí)小鼠”基本原理

是采用顯微注射等方法，將目的基因?qū)胧芫鸦蛑睬暗呐咛ジ杉?xì)胞核內(nèi)，并經(jīng)同源重組整合到的基因組DNA中，然后將細(xì)胞置入受體動(dòng)物子宮，使之發(fā)育成個(gè)體。

轉(zhuǎn)基因(transgene)：被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenicanimal)：目的基因的受體動(dòng)物轉(zhuǎn)基因小鼠正常小鼠1982年哈佛R.D.Palmiter基本乳腺生物反應(yīng)器的誕生

據(jù)推測(cè)，2010年世界上采用動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的年產(chǎn)超過了500億美元。

1987年Gordon等將組織型纖溶酶原激活劑(tPA)與小鼠乳清蛋白基因的啟動(dòng)子構(gòu)成重組基因，培育出了37只在乳汁中能表達(dá)tPA的轉(zhuǎn)基因小鼠。乳腺生物反應(yīng)器的誕生據(jù)推測(cè)，2010年世界上采用動(dòng)物動(dòng)物多肽藥物用途綿羊a1抗胰蛋白酶蛋白治療氣腫綿羊CFTR治療囊腫性纖維化綿羊組織型纖溶酶原活化因子治療血栓綿羊凝血VIII因子、IX因子治療血友病綿羊纖維蛋白原傷口愈合豬組織型纖溶酶原活化因子治療血栓豬凝血VIII因子、IX因子治療血友病山羊人蛋白質(zhì)C治療血栓山羊抗血栓因子3治療血栓山羊谷氨酸脫羧酶治療I型糖尿病山羊Pro542治療愛滋病牛a-乳清白蛋白抗炎癥牛凝血VIII因子治療血友病牛纖維蛋白原傷口愈合牛膠原蛋白I,II組織修復(fù),治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎牛乳鐵蛋白治療腸道感染,感染性關(guān)節(jié)炎牛人血清白蛋白維護(hù)血液體積雞,牛,山羊單克隆抗體用于疫苗生產(chǎn)動(dòng)物多肽藥物用途綿羊a1抗胰蛋白酶蛋白治療氣腫綿羊CFTR治

是用顯微操作、電融合等方法，將供體動(dòng)物體細(xì)胞的胞核，全部導(dǎo)入另一動(dòng)物個(gè)體的去核卵細(xì)胞中，然后將其置入受體動(dòng)物子宮，使之發(fā)育成為動(dòng)物個(gè)體的技術(shù)員。1/3/202346二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)--即體細(xì)胞克隆技術(shù)

核轉(zhuǎn)移技術(shù)產(chǎn)生的個(gè)體所攜帶的遺傳物質(zhì)，與細(xì)胞核供體的遺傳物質(zhì)完全一樣，是一種無性繁殖過程，即克隆(clone)。是用顯微操作、電融合等方法，將供體動(dòng)物體細(xì)胞的胞核，1997年2月27日Nature雜志報(bào)道：科學(xué)家維爾穆特(Wilmut)和坎貝爾(Campbell)，利用克隆技術(shù)，培育出一只小母羊“多利”?？寺〖夹g(shù)被《科學(xué)》評(píng)為1997年世界十大科技進(jìn)步之首?！岸嗬闭Q生標(biāo)志著生物技術(shù)新時(shí)代的來臨1.用于動(dòng)物克?。D(zhuǎn)移的核末經(jīng)修飾1997年2月27日Nature雜志報(bào)道：科學(xué)家維爾穆特(W核轉(zhuǎn)移技術(shù)的基本原理1.將供者細(xì)胞核注入到去核卵細(xì)胞內(nèi)2.用電轉(zhuǎn)移法將供者細(xì)胞核注射到去核卵細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)移技術(shù)的基本原理1.將供者細(xì)胞核注入到去核卵細(xì)胞內(nèi)2.1997年6月維爾穆特(Wilmut)報(bào)道：用基因改造過的胎兒成纖維細(xì)胞為核供體，獲得了表達(dá)人凝血因子IX的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊“波莉”?？寺〕鰯y帶有人凝血因子ＩX基因的綿羊早期胚胎成纖維細(xì)胞。以該細(xì)胞系為核供體移植到去核卵母細(xì)胞中，經(jīng)過處理后將卵母細(xì)胞植入假孕綿羊體內(nèi)發(fā)育。獲得3只能高水平表達(dá)人凝血因子ＩX（125μg/ml）

的綿羊。2.用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器的制備

－－轉(zhuǎn)移經(jīng)過修飾的核1997年6月維爾穆特(Wilmut)報(bào)道：用基因改造過的胎－－又稱基因打靶(genetargeting)原理：

通過DNA定點(diǎn)同源重組，使動(dòng)物胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)的某特定內(nèi)源基因被破壞而造成其功能喪失。1/3/202350三、基因剔除技術(shù)(geneknock-out)是采用分子生物學(xué)的方法，定向敲除動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi)的某個(gè)基因的技術(shù)。－－又稱基因打靶(genetargeting)原理：基本過程包括：①用同源基因片段構(gòu)建含有失活目的基因的載體；②顯微注射法將含有失活目的基因的載體導(dǎo)入ES細(xì)胞，與ES細(xì)胞染色體的相應(yīng)基因發(fā)生同源重組，替代(剔除)掉ES細(xì)胞中原有的正常/異?；颍虎軐⒑谢蛱蕹腅S細(xì)胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宮中，使之發(fā)育成一種既含基因剔除細(xì)胞又含正常細(xì)胞的嵌合體小鼠；⑤將嵌合體小鼠與正常小鼠交配，最終篩選出基因剔除的純合子小鼠。③將剔除正常基因的ES細(xì)胞注入動(dòng)物的囊胚中，使其與囊胚中的細(xì)胞共同組成囊胚內(nèi)的細(xì)胞團(tuán)；基本過程包括：①用同源基因片段構(gòu)建含有失活目的基因的載體；四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用（一）建立疾病動(dòng)物模型（二）生物制藥（三）治療性克隆和生產(chǎn)可用于人體器官移植的

動(dòng)物器官1/3/202352建立人類疾病的各種動(dòng)物模型，研究基因在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)調(diào)控規(guī)律及其產(chǎn)物與疾病的關(guān)系。轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物作為醫(yī)用或食用蛋白的生物反應(yīng)器，用于生產(chǎn)出具有醫(yī)藥價(jià)值的多肽或蛋白質(zhì)、抗體、疫苗等。學(xué)習(xí)要求4四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用（一）建立疾病動(dòng)物模型第四節(jié)

生物芯片技術(shù)

BiochipTechnology1/3/202353第四節(jié)

生物芯片技術(shù)

BiochipTechn生物芯片:生物芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片和組織芯片等。1/3/202354是指采用微電子和微加工技術(shù)，將大量已知序列的核酸或蛋白質(zhì)片段等，有序地組合在約1cm2大小的固相介質(zhì)表面而構(gòu)成的集成分析系統(tǒng)。

將其與標(biāo)記樣品中的特異核酸或蛋白分子雜交、結(jié)合，通過對(duì)“標(biāo)記”的測(cè)定即可實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸或蛋白質(zhì)組分的快速、高效的分析處理。生物芯片:生物芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片DNA芯片(DNAchip)、DNA陣列(DNAarray)或cDNA芯片(cDNAchip)一、基因芯片(genechip)1/3/202355指以原位合成或顯微打印的方式，將大量特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列、固化在約1cm2的支持物上。

使用時(shí)與標(biāo)記的樣品雜交，通過對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析從而得出樣品的遺傳信息。DNA芯片(DNAchip)、DNA陣列(DNA1/3/202356

玻片型這種芯片的點(diǎn)陣是通過原位合成技術(shù)制作的，10~40萬點(diǎn)陣/cm2，必須借助于特殊的儀器對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行解讀和分析。(Affimetrix公司)。12/27/202256玻片型這種芯片的點(diǎn)陣是通過原位2202芯片點(diǎn)樣儀

2202芯片點(diǎn)樣儀

*Cy3為紅色,標(biāo)記處理組；Cy5為綠色,標(biāo)記對(duì)照組。*紅色表示上調(diào)；黃色表示不變；綠色表示下調(diào)。*Cy3為紅色,標(biāo)記處理組；Cy5為綠色,標(biāo)記對(duì)照組。是將蛋白分子作為探針，高度密集排列、固定在固相支持物上的點(diǎn)陣。加入待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)1/3/202359基本原理：蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子之間在空間構(gòu)象上能特異性的相互識(shí)別和相互結(jié)合。最常用的探針：抗體檢測(cè)方法：標(biāo)記檢測(cè)法、直接檢測(cè)法——又稱蛋白質(zhì)陣列(proteinarray)學(xué)習(xí)要求5是將蛋白分子作為探針，高度密集排列、固定在固相支持物上的點(diǎn)陣第五節(jié)

蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)

Protein-ProteinInteractionTechnology1/3/202360第五節(jié)

蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)

Protein-Prot

該系統(tǒng)的建立是基于對(duì)酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4分子的研究。GAL4（一）基本原理DNA結(jié)構(gòu)域(BD)(DNAbindingdomain)N端轉(zhuǎn)錄激活域(AD)(activationdomain)C端一、酵母雙雜交系統(tǒng)（yeasttwo-hybridsystem）1/3/202361該系統(tǒng)的建立是基于對(duì)酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4分子的研BD能識(shí)別位于Gal4效應(yīng)基因的上游激活序列(UAS)；GAL4的DNA-BD和DNA-AD結(jié)構(gòu)域：1/3/202362AD可與其他成分結(jié)合而啟動(dòng)UAS下游的基因轉(zhuǎn)錄。BD和AD兩結(jié)構(gòu)域單獨(dú)存在時(shí)無轉(zhuǎn)錄激活功能；只有兩者連接而形成的空間結(jié)構(gòu)才具有轉(zhuǎn)錄激活功能。BDAD轉(zhuǎn)錄因子激活序列(UAS)Gal4效應(yīng)基因BD能識(shí)別位于Gal4效應(yīng)基因的上游激活序列(UAS)；GA1/3/202363將BD基因與已知蛋白基因X融合后，插入表達(dá)載體中構(gòu)建BD-X重組載體；將AD基因與未知蛋白群基因Y(或未知蛋白群cDNA文庫(kù))融合后，插入表達(dá)載體構(gòu)建AD-Y重組載體群。

宿主菌:剔除了轉(zhuǎn)錄因子GAL4；在其GAL4基因啟動(dòng)激活序列的下游插入特定的報(bào)告基因，如-半乳糖苷酶編碼基因，表達(dá)產(chǎn)物為-半乳糖苷酶。BDAD轉(zhuǎn)錄因子激活序列(UAS)Gal4效應(yīng)基因BDXADYY=Y1,Y2,Y3,,Yn12/27/202263將BD基因與已知蛋白基因X融-半乳糖苷酶YmX-半乳糖苷酶Ym+iX-半乳糖苷酶YmX-半乳糖苷酶Ym+iX（二）酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用1.分析已知蛋白質(zhì)之間的相互作用2.篩選和發(fā)現(xiàn)新的相關(guān)蛋白質(zhì)3.篩選藥物的作用位點(diǎn)及藥物對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用的影響

4.繪制蛋白相互作用系統(tǒng)圖譜1/3/202365（二）酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用1.分析已知蛋白質(zhì)之間的相互作二、噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽，與噬菌體表面蛋白融合表達(dá)，并呈現(xiàn)在噬菌體表面的技術(shù)。通過與特定的標(biāo)記抗體(或受體、配基等)結(jié)合，可把展示有特定蛋白的噬菌體，從表達(dá)有各種外源性蛋白的噬菌體肽庫(kù)中篩選出來；感染大腸桿菌擴(kuò)增選出的噬菌體，分離出融合基因并測(cè)序，可獲得相應(yīng)的結(jié)構(gòu)與功能的信息。二、噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽，與噬菌體表三、蛋白質(zhì)工程中的定點(diǎn)誘變技術(shù)是在編碼蛋白質(zhì)基因的特定位置引入堿基替代、產(chǎn)生堿基缺失或插入，使其編碼的蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。在合成PCR引物時(shí)，除了在定點(diǎn)誘變的位置引入相應(yīng)的突變（點(diǎn)突變、小片段插入或缺失）外，其余序列與模板完全配對(duì)

PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物中就引入特定的突變；將PCR產(chǎn)物克隆表達(dá)，可獲得定點(diǎn)突變的蛋白質(zhì)。PCR誘變：1/3/202367學(xué)習(xí)要求6三、蛋白質(zhì)工程中的定點(diǎn)誘變技術(shù)是在編碼蛋白質(zhì)基因第六節(jié)

蛋白質(zhì)與核酸相互作用研究技術(shù)

Protein-NucleicAcidInteractionTechnology1/3/202368第六節(jié)

蛋白質(zhì)與核酸相互作用研究技術(shù)

Protein一、電泳遷移率變動(dòng)分析（electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA）又稱凝膠阻滯分析(gelretardationassay)與游離DNA相比，蛋白-DNA復(fù)合物的遷移率將降低，因此，與游離DNA相對(duì)應(yīng)，人們將觀察到帶中的“阻滯”。1/3/202369是將純化的蛋白或細(xì)胞粗提液，與32P放射性核素標(biāo)記的DNA或RNA探針一起保溫后，在非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離。一、電泳遷移率變動(dòng)分析（electrophoretic二、酵母單雜交技術(shù)系統(tǒng)由2部分組成：(1)宿主菌:剔除轉(zhuǎn)錄因子GAL4；將含目的基因片段和下游報(bào)告基因整合入酵母基因組。1/3/202370-半乳糖苷酶基因目的基因片段

(2)將AD基因與未知蛋白基因群(或未知蛋白cDNA文庫(kù))融合后，插入表達(dá)載體中構(gòu)建AD-未知蛋白重組載體群。二、酵母單雜交技術(shù)系統(tǒng)由2部分組成：(1)宿主菌1/3/202371操作流程ASepharose（ChromotinImmunoprecipitationAssay，ChiP）三、染色體免疫沉淀技術(shù)12/27/202271操作流程ASepharose（Chr基本原理:

①在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物；

②將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段；

③通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體,特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段；

④通過對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。1/3/202372基本原理:①在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物；

①甲醛處理細(xì)胞，使蛋白-DNA交聯(lián)；操作流程：

②加甘氨酸終止交聯(lián)、收集細(xì)胞、超聲破碎；③加入靶蛋白抗體，與靶蛋白-DNA復(fù)合物結(jié)合；④加入ProteinAAgarose，沉淀合合物；⑤清洗除去一些非特異性結(jié)合；⑥洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物；⑦加終濃度為0.2MNaCl、65℃解交聯(lián)過夜解

交聯(lián)，純化富集的DNA-片斷；⑧PCR或Q-PCR分析。1/3/202373①甲醛處理細(xì)胞，使蛋白-DNA交聯(lián)；操作流程：學(xué)習(xí)要求1.掌握分子雜交與印跡技術(shù)基本原理、類型、應(yīng)用。2.掌握PCR的定義、PCR技術(shù)的工作原理及主要用途。3.掌握基因文庫(kù)、基因組DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的概念，了解基因文庫(kù)構(gòu)建過程。（見第20章重組DNA技術(shù)）4.了解轉(zhuǎn)基因技術(shù)與基因剔除技術(shù)的概念、原理及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。5.掌握基因芯片、蛋白質(zhì)芯片的概念，了解基因芯片與蛋白質(zhì)芯片的用途及在臨床疾病的診斷和新藥開發(fā)篩選上的應(yīng)用潛力。6.了解蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)/核酸相互作用研究技術(shù)的基本原理及其用途。學(xué)習(xí)要求1.掌握分子雜交與印跡技術(shù)基本原理、類型、應(yīng)用。第二十一章分子生物學(xué)常用技術(shù)ThePopularTechnologyinMolecularBiology1/3/202375第二十一章分子生物學(xué)常用技術(shù)12/27/20221第2節(jié)PCR技術(shù)第3節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)與基因剔除技術(shù)第1節(jié)分子印跡與雜交技術(shù)第6節(jié)蛋白質(zhì)與核酸相互作用研究技術(shù)第4節(jié)生物芯片技術(shù)第5節(jié)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)1/3/202376第2節(jié)PCR技術(shù)第3節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)與基因剔除技術(shù)第1節(jié)第一節(jié)

分子印跡與雜交技術(shù)

MolecularBlotting&HybridizationTechnology1/3/202377第一節(jié)

分子印跡與雜交技術(shù)

MolecularBlott一、核酸分子印跡與雜交技術(shù)指具有一定互補(bǔ)序列，不同來源的核苷酸單鏈，在一定條件下按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則形成雙鏈的過程。核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)印跡(blotting)指利用各種物理方法，使電泳凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到硝基纖維膜等特定的支持物上，使之成為固相化分子的過程。1/3/202378學(xué)習(xí)要求1一、核酸分子印跡與雜交技術(shù)指具有一定互補(bǔ)序列，不(heteroduplex)1/3/202379(heteroduplex)12/27/20225探針(probe)探針種類標(biāo)記物指可用來檢測(cè)某一特定核苷酸序列或基因序列的,與被測(cè)序列互補(bǔ)并經(jīng)過特殊標(biāo)記的DNA或RNA片段。寡核苷酸基因組DNAcDNA片段RNA片段放射性同位素地高辛生物素?zé)晒馊玖蟫-32PATPa-32PdATP1/3/202380HdATP**探針(probe)探針種類標(biāo)記物指可用來檢測(cè)某一特定1/3/202381dUTPDig-dUTPBiotin-dUTP非放射性標(biāo)記物12/27/20227dUTPDig-dUTPBiotin-Dig-DNA探針雜交化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測(cè)原理

Luminol化學(xué)發(fā)光原理Dig-DNA探針雜交化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測(cè)原理Luminol化Biotin-DNA探針雜交化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測(cè)原理

Luminol化學(xué)發(fā)光原理BiotinAvidinBiotin-DNA探針雜交化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測(cè)原理Lumin（一）Southern印跡雜交

Southern印跡雜交（Southernblotting）是指DNA與DNA分子之間的雜交?；具^程:

將瓊脂糖凝膠電泳分離的待測(cè)DNA片段變性，再將凝膠中的DNA分子轉(zhuǎn)移到硝基纖維膜等固相支持物上，然后用標(biāo)記的探針檢測(cè)待測(cè)的DNA。可用于基因組DNA的定性與定量分析，重組質(zhì)粒和噬菌體的分析等。1/3/202384（一）Southern印跡雜交Southern印跡Southern印跡雜交的基本步驟:

①待測(cè)DNA樣品的限制性內(nèi)切酶消化②酶切DNA樣品的電泳分離③凝膠中DNA的變性和Southern印跡

④探針的制備⑤Southern雜交⑥雜交結(jié)果的檢測(cè)1/3/202385Southern印跡雜交的基本步驟:①待測(cè)DNA樣品的限支持物轉(zhuǎn)移緩沖液Whatman濾紙凝膠Whatman濾紙紙巾玻璃板重物500gNC膜或尼龍膜支持物轉(zhuǎn)移緩沖液Whatman濾紙凝膠Whatman濾紙紙巾（二）Northern印跡雜交

利用類似于Southern印跡雜交的技術(shù)來檢測(cè)RNA稱為Northern印跡雜交（Northernblotting）。原理和過程與Southern印跡基本相同，只是檢測(cè)的分子是RNA，可用來對(duì)組織或細(xì)胞中的mRNA進(jìn)行定性或定量分析。1/3/202387（二）Northern印跡雜交利用類似于SouthNorthern與Southernblotting的異同點(diǎn)相同點(diǎn)：原理均為毛細(xì)作用用途：檢測(cè)組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平；比較不同組織和細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。不同點(diǎn)：轉(zhuǎn)移的是RNA轉(zhuǎn)移前無需酶切轉(zhuǎn)移效率較高變性方法:DNA(堿變性）

RNA（甲醛、乙二醛等）1/3/202388Northern與Southernblotting的異同④HRP/AP標(biāo)記抗體與Dig結(jié)合②漂洗和封閉YHRPHRPHRP⑤底物與抗體-HRP/AP反應(yīng),顯色或發(fā)光底物①

電泳,轉(zhuǎn)膜，紫外交聯(lián)固定D││D

North-South雜交原理和操作流程(地高辛標(biāo)記)③雜交：Dig標(biāo)記的探針與靶DNA結(jié)合1/3/202389④HRP/AP標(biāo)記抗體與Dig結(jié)合②漂洗和封閉YHRPHRP

North-South雜交原理和操作流程(Biotin標(biāo)記)③雜交：生物素標(biāo)記探針與靶DNA結(jié)合⑤底物在HRP催化下,反應(yīng)發(fā)光①電泳,轉(zhuǎn)膜，紫外交聯(lián)固定SAHRP底物B││B④HRP標(biāo)記的鏈親和素與探針上的生物素結(jié)合1/3/202390②漂洗和封閉North-South雜交原理和操作流程(Biotin標(biāo)1.曝光：用濾紙吸去雜交膜上多余底物，作好標(biāo)記，

保鮮膜包裹，放在暗夾里，放上X光片，曝光1-5

分鐘；2.顯影：取出X光片，按使用說明書顯影和定影。后繼的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)

Luminol化學(xué)發(fā)光原理1/3/2023911.曝光：用濾紙吸去雜交膜上多余底物，作好標(biāo)記，2.顯影：?。ㄈ┢渌怂犭s交方法1.斑點(diǎn)印跡雜交2.原位雜交（insituhybridization）

將變性的DNA或RNA直接點(diǎn)樣于NC膜或尼龍膜上，故稱為斑點(diǎn)印跡。簡(jiǎn)便、快速，可以在同一張膜上進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè)。

是指直接用組織切片或細(xì)胞涂片進(jìn)行雜交的方法，可用于檢測(cè)組織切片或細(xì)胞內(nèi)某些特異性核苷酸或核酸片段。1/3/202392（三）其他核酸雜交方法1.斑點(diǎn)印跡雜交2.原位雜交（in二、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Westernblotting)

根據(jù)蛋白質(zhì)分子之間存在相互作用的特點(diǎn)，將蛋白質(zhì)電泳分離，然后將其轉(zhuǎn)移和固定于固體支持物（NC膜或其它膜）上，再用相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子（最常用的是抗體）對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。因此，被稱為免疫印跡（immunoblotting）技術(shù)。

用Westernblotting檢測(cè)樣品中存在特異蛋白質(zhì)用于細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的定量分析用于蛋白質(zhì)分子的相互作用研究1/3/202393二、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Westernblotting)1/3/20239412/27/202220③HRP/AP標(biāo)記抗體與蛋白結(jié)合②漂洗和封閉YHRPHRPHRP④底物與抗體-HRP/AP反應(yīng),顯色或發(fā)光底物①電泳分離,轉(zhuǎn)膜,固定蛋白于膜上1.WesternBlotting直接法操作流程:1/3/202395③HRP/AP標(biāo)記抗體與蛋白結(jié)合②漂洗和封閉YHRPHRPH優(yōu)點(diǎn)：1.快速（一種抗體）2.沒有二抗交叉反應(yīng)引起的非特異性條帶缺點(diǎn)：1.免疫反應(yīng)性較低2.無信號(hào)二級(jí)放大3.抗體標(biāo)記費(fèi)時(shí)昂貴,使用不方便1/3/202396優(yōu)點(diǎn)：1.快速（一種抗體）2.沒有二抗交叉反④HRP/AP標(biāo)記二抗與一抗－蛋白復(fù)合物結(jié)合②漂洗和封閉YYHRPHRPHRP⑤底物與二抗-HRP/AP反應(yīng),顯色或發(fā)光底物①電泳分離,轉(zhuǎn)膜,固定蛋白于膜上③一抗與蛋白結(jié)合(小鼠單抗或兔多抗)2.WesternBlotting間接法操作流程:1/3/202397④HRP/AP標(biāo)記二抗與一抗－蛋白復(fù)合物結(jié)合②漂洗和封閉YY缺點(diǎn)：1.較慢速（2種抗體）2.有二抗交叉反應(yīng)引起的非特異性條帶優(yōu)點(diǎn)：1.免疫反應(yīng)性較高2.有信號(hào)二級(jí)放大，靈敏度高3.可選用的標(biāo)記二抗體商品多,使用方便1/3/202398缺點(diǎn)：1.較慢速（2種抗體）2.有二抗交叉反

三種印跡技術(shù)的比較

Southernblotting

NorthernblottingWesternblotting樣品限制性內(nèi)切酶消化電泳變性轉(zhuǎn)移膜紫外交聯(lián)儀等固定雜交標(biāo)記物DNARNA蛋白質(zhì)需要不需要不需要瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳SDS電泳堿變性甲醛或戊二醛變性高溫變性NC膜或尼龍膜NC膜或尼龍膜NC膜或PVDF膜需要需要不需要標(biāo)記探針標(biāo)記探針 (標(biāo)記)抗體1/3/202399三種印跡技術(shù)的比較Southernblot第二節(jié)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用PolymeraseChainReaction1/3/2023100第二節(jié)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用12/27/2022265Primer15Primer2Cycle2Cycle155

55

5

5TemplateDNA55

555

5

55一、PCR技術(shù)的基本原理1/3/20231015Primer15Primer2Cycle2CycCycle3555555555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。1/3/2023102Cycle35555555555模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶

(Taq

DNA聚合酶)dNTPsMg2+

PCR體系基本組成成分1/3/2023103一、PCR技術(shù)的基本原理模板DNAPCR體系基本組成成分12/27/202229PCR反應(yīng)循環(huán)變性95?C左右延伸酶最適溫度72℃退火Tm-5?C55℃

經(jīng)過30個(gè)左右的循環(huán)后，PCR的擴(kuò)增倍數(shù)為(1+x)n,x=75%,n為循環(huán)數(shù).PCR反應(yīng)循環(huán)變性延伸退火經(jīng)過30個(gè)左右的循環(huán)后，P二、PCR技術(shù)的主要特點(diǎn)1.特異性強(qiáng)2.靈敏度高3.簡(jiǎn)便快速4.對(duì)標(biāo)本的純度要求低1/3/2023105二、PCR技術(shù)的主要特點(diǎn)1.特異性強(qiáng)2.靈敏度高1/3/2023106（三）基因突變分析PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測(cè)的敏感性。（四）DNA和RNA的微量分析（五）DNA序列測(cè)定學(xué)習(xí)要求2（二）基因的體外定點(diǎn)突變--PCR定點(diǎn)誘變?nèi)?、PCR技術(shù)的主要用途（一）目的基因的擴(kuò)增與克隆12/27/202232（三）基因突變分析（四）DNA2.利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段。3.利用簡(jiǎn)并引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中獲得具有一定同源性的基因片段。4.利用隨機(jī)引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中隨機(jī)克隆基因。1.與反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接從組織和細(xì)胞的mRNA獲得目的基因片段。1/3/2023107（一）目的基因的擴(kuò)增與克隆2.利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已5’3’3’5’引物A引物A’混合,變性,退火5’3’5’3’3’5’3’5’+DNA聚合酶5’3’3’5’5’3’3’5’用引物B和B’作PCR（二）基因的體外定點(diǎn)突變--PCR定點(diǎn)誘變引物B引物B’5’5’3’3’PCRPCRPCR3’3’5’5’PCR5’5’3’3’5’3’3’5’引物A引物A’混合,變性,退火5’5’3’3TheNobelPrizeinChemistry1993"forcontributionstothedevelopmentsofmethodswithinDNA-basedchemistry"MichaelSmith1944-1932-2000LaJolla,CA,USAKaryB.MullisUniversityofBritishColumbiaVancouver,Canada"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method""forhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudies"1/3/2023109TheNobelPrizeinChemistry1電泳負(fù)極正極

測(cè)序反應(yīng)

GATC（五）末端合成終止法測(cè)定DNA序列的原理*2’，3’雙脫氧核苷酸*用4種不同熒光標(biāo)記

DNA樣品、引物DNA聚合酶、dNTPddGddAddTddC5'

3'

CCGATTCTTGCACCTGAGGCTAAAAACGTGGACTGGCTAAAddAAddAGGCTAAAAAddCGGCTAAAAACddGGGCTAAAAACGddTGGCTAAAAACGTddGGGCTAAAAACGTGddGGGCTAAAAACGTGGddAGGCTAAAAACGTGGAddCGGCTAAAAACGTGGACddTGGCTAAA電泳負(fù)極正極測(cè)序反應(yīng)GATC（五）末端合成終止法測(cè)定DDNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果1/3/2023111DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果12/27/202237TheNobelPrizeinChemistry1980"forhisfundamentalstudiesofthebiochemistryofnucleicacids,withparticularregardtorecombinant-DNA""fortheircontributionsconcerningthedeterminationofbasesequencesinnucleicacids"PaulBerg1/2oftheprizeStanfordUniversityStanford,CA,USA1926-WalterGilbertFrederickSanger1/4oftheprize1/4oftheprize

HarvardUniversity,BiologicalLaboratoriesCambridge,MA,USAMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdom1932-1918-TheNobelPrizeinChemistry1彌補(bǔ)了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。（二）原位PCR技術(shù)(insituPCR)（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)

(real-timePCR)通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對(duì)定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。1/3/2023113（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(RT-PCR)

四、幾種重要的PCR衍生技術(shù)

是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對(duì)已知序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法彌補(bǔ)了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR

PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而使熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)；每擴(kuò)增一條DNA鏈就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。1/3/2023114實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3第三節(jié)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)與基因剔除技術(shù)

TransgenicTechnology&Gene

KnockoutTechnology1/3/2023115第三節(jié)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)與基因剔除技術(shù)

TransgenicT

是指將外源基因整合到動(dòng)物或植物細(xì)胞的基因組中，并使外源基因在動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞中穩(wěn)定地遺傳和表達(dá)的技術(shù)?；虻膶?dǎo)入方式主要：

顯微注射法(最常用)胚胎干細(xì)胞法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法1/3/2023116一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指將外源基因整合到動(dòng)物或植物細(xì)胞的基因組中，并使外轉(zhuǎn)基因小鼠正常小鼠1982年哈佛R.D.Palmiter“制造”的“超級(jí)小鼠”基本原理

是采用顯微注射等方法，將目的基因?qū)胧芫鸦蛑睬暗呐咛ジ杉?xì)胞核內(nèi)，并經(jīng)同源重組整合到的基因組DNA中，然后將細(xì)胞置入受體動(dòng)物子宮，使之發(fā)育成個(gè)體。

轉(zhuǎn)基因(transgene)：被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenicanimal)：目的基因的受體動(dòng)物轉(zhuǎn)基因小鼠正常小鼠1982年哈佛R.D.Palmiter基本乳腺生物反應(yīng)器的誕生

據(jù)推測(cè)，2010年世界上采用動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的年產(chǎn)超過了500億美元。

1987年Gordon等將組織型纖溶酶原激活劑(tPA)與小鼠乳清蛋白基因的啟動(dòng)子構(gòu)成重組基因，培育出了37只在乳汁中能表達(dá)tPA的轉(zhuǎn)基因小鼠。乳腺生物反應(yīng)器的誕生據(jù)推測(cè)，2010年世界上采用動(dòng)物動(dòng)物多肽藥物用途綿羊a1抗胰蛋白酶蛋白治療氣腫綿羊CFTR治療囊腫性纖維化綿羊組織型纖溶酶原活化因子治療血栓綿羊凝血VIII因子、IX因子治療血友病綿羊纖維蛋白原傷口愈合豬組織型纖溶酶原活化因子治療血栓豬凝血VIII因子、IX因子治療血友病山羊人蛋白質(zhì)C治療血栓山羊抗血栓因子3治療血栓山羊谷氨酸脫羧酶治療I型糖尿病山羊Pro542治療愛滋病牛a-乳清白蛋白抗炎癥牛凝血VIII因子治療血友病牛纖維蛋白原傷口愈合牛膠原蛋白I,II組織修復(fù),治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎牛乳鐵蛋白治療腸道感染,感染性關(guān)節(jié)炎牛人血清白蛋白維護(hù)血液體積雞,牛,山羊單克隆抗體用于疫苗生產(chǎn)動(dòng)物多肽藥物用途綿羊a1抗胰蛋白酶蛋白治療氣腫綿羊CFTR治

是用顯微操作、電融合等方法，將供體動(dòng)物體細(xì)胞的胞核，全部導(dǎo)入另一動(dòng)物個(gè)體的去核卵細(xì)胞中，然后將其置入受體動(dòng)物子宮，使之發(fā)育成為動(dòng)物個(gè)體的技術(shù)員。1/3/2023120二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)--即體細(xì)胞克隆技術(shù)

核轉(zhuǎn)移技術(shù)產(chǎn)生的個(gè)體所攜帶的遺傳物質(zhì)，與細(xì)胞核供體的遺傳物質(zhì)完全一樣，是一種無性繁殖過程，即克隆(clone)。是用顯微操作、電融合等方法，將供體動(dòng)物體細(xì)胞的胞核，1997年2月27日Nature雜志報(bào)道：科學(xué)家維爾穆特(Wilmut)和坎貝爾(Campbell)，利用克隆技術(shù)，培育出一只小母羊“多利”?？寺〖夹g(shù)被《科學(xué)》評(píng)為1997年世界十大科技進(jìn)步之首?！岸嗬闭Q生標(biāo)志著生物技術(shù)新時(shí)代的來臨1.用于動(dòng)物克?。D(zhuǎn)移的核末經(jīng)修飾1997年2月27日Nature雜志報(bào)道：科學(xué)家維爾穆特(W核轉(zhuǎn)移技術(shù)的基本原理1.將供者細(xì)胞核注入到去核卵細(xì)胞內(nèi)2.用電轉(zhuǎn)移法將供者細(xì)胞核注射到去核卵細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)移技術(shù)的基本原理1.將供者細(xì)胞核注入到去核卵細(xì)胞內(nèi)2.1997年6月維爾穆特(Wilmut)報(bào)道：用基因改造過的胎兒成纖維細(xì)胞為核供體，獲得了表達(dá)人凝血因子IX的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊“波莉”?？寺〕鰯y帶有人凝血因子ＩX基因的綿羊早期胚胎成纖維細(xì)胞。以該細(xì)胞系為核供體移植到去核卵母細(xì)胞中，經(jīng)過處理后將卵母細(xì)胞植入假孕綿羊體內(nèi)發(fā)育。獲得3只能高水平表達(dá)人凝血因子ＩX（125μg/ml）

的綿羊。2.用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器的制備

－－轉(zhuǎn)移經(jīng)過修飾的核1997年6月維爾穆特(Wilmut)報(bào)道：用基因改造過的胎－－又稱基因打靶(genetargeting)原理：

通過DNA定點(diǎn)同源重組，使動(dòng)物胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)的某特定內(nèi)源基因被破壞而造成其功能喪失。1/3/2023124三、基因剔除技術(shù)(geneknock-out)是采用分子生物學(xué)的方法，定向敲除動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi)的某個(gè)基因的技術(shù)。－－又稱基因打靶(genetargeting)原理：基本過程包括：①用同源基因片段構(gòu)建含有失活目的基因的載體；②顯微注射法將含有失活目的基因的載體導(dǎo)入ES細(xì)胞，與ES細(xì)胞染色體的相應(yīng)基因發(fā)生同源重組，替代(剔除)掉ES細(xì)胞中原有的正常/異常基因；④將含有基因剔除的ES細(xì)胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宮中，使之發(fā)育成一種既含基因剔除細(xì)胞又含正常細(xì)胞的嵌合體小鼠；⑤將嵌合體小鼠與正常小鼠交配，最終篩選出基因剔除的純合子小鼠。③將剔除正常基因的ES細(xì)胞注入動(dòng)物的囊胚中，使其與囊胚中的細(xì)胞共同組成囊胚內(nèi)的細(xì)胞團(tuán)；基本過程包括：①用同源基因片段構(gòu)建含有失活目的基因的載體；四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用（一）建立疾病動(dòng)物模型（二）生物制藥（三）治療性克隆和生產(chǎn)可用于人體器官移植的

動(dòng)物器官1/3/2023126建立人類疾病的各種動(dòng)物模型，研究基因在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)調(diào)控規(guī)律及其產(chǎn)物與疾病的關(guān)系。轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物作為醫(yī)用或食用蛋白的生物反應(yīng)器，用于生產(chǎn)出具有醫(yī)藥價(jià)值的多肽或蛋白質(zhì)、抗體、疫苗等。學(xué)習(xí)要求4四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用（一）建立疾病動(dòng)物模型第四節(jié)

生物芯片技術(shù)

BiochipTechnology1/3/2023127第四節(jié)

生物芯片技術(shù)

BiochipTechn生物芯片:生物芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片和組織芯片等。1/3/2023128是指采用微電子和微加工技術(shù)，將大量已知序列的核酸或蛋白質(zhì)片段等，有序地組合在約1cm2大小的固相介質(zhì)表面而構(gòu)成的集成分析系統(tǒng)。

將其與標(biāo)記樣品中的特異核酸或蛋白分子雜交、結(jié)合，通過對(duì)“標(biāo)記”的測(cè)定即可實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸或蛋白質(zhì)組分的快速、高效的分析處理。生物芯片:生物芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片DNA芯片(DNAchip)、DNA陣列(DNAarray)或cDNA芯片(cDNAchip)一、基因芯片(genechip)1/3/2023129指以原位合成或顯微打印的方式，將大量特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列、固化在約1cm2的支持物上。

使用時(shí)與標(biāo)記的樣品雜交，通過對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析從而得出樣品的遺傳信息。DNA芯片(DNAchip)、DNA陣列(DNA1/3/2023130

玻片型這種芯片的點(diǎn)陣是通過原位合成技術(shù)制作的，10~40萬點(diǎn)陣/cm2，必須借助于特殊的儀器對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行解讀和分析。(Affimetrix公司)。12/27/202256玻片型這種芯片的點(diǎn)陣是通過原位2202芯片點(diǎn)樣儀

2202芯片點(diǎn)樣儀

*Cy3為紅色,標(biāo)記處理組；Cy5為綠色,標(biāo)記對(duì)照組。*紅色表示上調(diào)；黃色表示不變；綠色表示下調(diào)。*Cy3為紅色,標(biāo)記處理組；Cy5為綠色,標(biāo)記對(duì)照組。是將蛋白分子作為探針，高度密集排列、固定在固相支持物上的點(diǎn)陣。加入待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)1/3/2023133基本原理：蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子之間在空間構(gòu)象上能特異性的相互識(shí)別和相互結(jié)合。最常用的探針：抗體檢測(cè)方法：標(biāo)記檢測(cè)法、直接檢測(cè)法——又稱蛋白質(zhì)陣列(proteinarray)學(xué)習(xí)要求5是將蛋白分子作為探針，高度密集排列、固定在固相支持物上的點(diǎn)陣第五節(jié)

蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)

Protein-ProteinInteractionTechnology1/3/2023134第五節(jié)

蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)

Protein-Prot

該系統(tǒng)的建立是基于對(duì)酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4分子的研究。GAL4（一）基本原理DNA結(jié)構(gòu)域(BD)(DNAbindingdomain)N端轉(zhuǎn)錄激活域(